Fabrication d’une matrice cérébrale extensible personnalisable à travers les stades de développement

Résumé

Une méthode innovante pour construire des matrices cérébrales extensibles afin de couper des tranches coronales ou sagittales est décrite pour une application chez les porcelets nouveau-nés. Cette approche économique utilise des plaques acryliques sculptées à partir de gabarits issus du moulage cerveau en gel d’agarose, s’applique à plusieurs espèces et permet une expansion pour favoriser la croissance cérébrale.

Résumé

L’intérêt croissant pour l’utilisation des porcelets nouveau-nés comme modèle d’étude pour le développement et la pathologie néonatales a suscité la nécessité d’une matrice cérébrale pour acquérir avec précision les coupes histologiques. Cependant, la croissance rapide du cerveau du nouveau-né limite l’utilité des matrices disponibles dans le commerce à une fenêtre de développement étroite. Par conséquent, une méthode de construction de matrice cérébrale réglable a été développée. D’abord, un récipient en verre a été placé sur de la glace humide, et une couche de gel d’agarose à 4 % a été posée au fond. Ensuite, un cerveau fixé au formol était placé sur cette couche et enrobé d’un gel d’agarose à 4 %. Après la solidification du gel, le gel au-dessus du cerveau était soigneusement retiré, puis le cerveau extrait. La cavité a été remplie d’un gel d’agarose à 4 % avec 2 % d’encre indienne. Après solidification, le bloc de gel était retiré et découpé à l’épaisseur désirée (2 mm ou 5 mm) et à l’orientation (coronale ou sagittale) pour imprimer les gabarits cérébraux sur du papier à écailles. Les gabarits étaient copiés sur une série de plaques acryliques transparentes (épaisses de 2 mm ou 5 mm) et découpés en conséquence à la scie à ruban. Enfin, les plaques ont été assemblées et fixées avec trois ensembles de boulons et d’écrous à travers des trous d’alignement pré-percés pour construire une matrice cerveau personnalisée. La construction des matrices coronale et sagittale est illustrée pour un cerveau de porcelet de jour 5 néonatal, avec des pas de 2 mm, et une matrice coronale pour le cerveau postnatal du jour 32-38, avec des pas de 5 mm. En ajoutant ou en retirant des plaques d’acrylique appropriées, la matrice était ajustée pour s’adapter aux différentes tailles de cerveaux de porcelet. Ainsi, une méthode simple et économique pour personnaliser les matrices cérébrales selon les tailles variées de grands animaux est introduite dans la communauté de la recherche neurologique.

Introduction

Le développement du cerveau des porcelets ressemble étroitement à celui des^humains 1,2,3,4. Ainsi, l’intérêt pour l’utilisation des porcelets dans des études précliniques sur les troubles du neurodéveloppement, les maladies néonatales et pédiatriques, ainsi que les blessures (Figure 1A,B)^5,6,7,8,9,10. Comme on le voit dans la Figure 1, le porcelet nouveau-né, en tant que modèle animal de grande taille, a un crâne et un cerveau plus proches de ceux d’un fœtus humain prématuré (Figure 1A,B), tandis que les crânes de souris et de rats adultes sont au moins deux fois plus petits.

Cependant, l’utilisation de mammifères plus grands dans la recherche biomédicale présente des défis par rapport aux modèles murins plus largement utilisés. Le cerveau des porcelets néonatals grandit rapidement durant les trois premiers mois suivant la naissance. Au cours des cinq premières semaines de vie, le cerveau du porcelet double presque de poids et triple de volume (Figure 1C)^4,11,12,13. Durant la période allant de p5 à p38, la croissance cérébrale et le développement des gyris et des sillons étaient notables (Figure 1C). Le poids et le volume du cerveau du porcelet p5 étaient de 29,5 g et 18,9 mL, tandis que les deux cerveaux p32 pesaient respectivement 51,4 et 52,6 g, et 49,6 et 53,5 mL. À 38 jours, le cerveau a atteint 53,7 g et 52,5 mL, ce qui représente une augmentation de 80 % du poids et une augmentation de volume de 170 % par rapport au p5. Cette croissance rapide du cerveau porcin néonal pose un défi pour une section histologique précise des cerveaux de porcelets de différents âges, souches ou sexes, en utilisant une seule matrice.

Les matrices cérébrales commerciales pour porcelets ont un coût approximatif allant de 1 000 $ à 3 600 $ chacune et ne sont disponibles qu’en une seule option, conçues pour être utilisées pour les porcelets âgés de 2 semaines ou moins. Bien qu’il existe quelques publications ayant utilisé la technique de numérisation 3D et d’impression 3D pour créer diverses matrices cérébrales pour les poissons-zèbres, souris et^{oiseaux 14, 15, 16}, ces matrices sont à une échelle relativement réduite. Il n’existe pas de série d’IRM établie ni de tableau détaillé de croissance pour le cerveau des porcelets nouveau-nés, surtout pour ceux de 2 semaines et plus jeunes. Nous avons donc créé plusieurs modèles de tranches cérébrales à partir de cerveaux collectés entre le jour 5 et le jour 38, sur la base desquels un système matriciel cérébral ajustable a été établi.

Ce protocole décrit une méthode innovante pour établir des modèles cérébraux de porcelets néonatals et développer une matrice cérébrale personnalisable à base de plaques acryliques, pouvant être utilisées pour le coupement coronanel ou sagittal du cerveau sur un spectre de tailles.

Protocole

Dans cet article, les quatre cerveaux de porcelets ont été obtenus et préparés pour une coloration histologique après une euthanasie humaine, suivant un protocole approuvé par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université du Kentucky pour une étude distincte. Toutes les procédures sur les sujets animaux ont été approuvées, et des soins appropriés ont été pris pour minimiser le stress ou la douleur associés aux traitements ou à l’euthanasie.

1. Animaux

1. Procurer quatre porcelets néonatals mâles naïfs (jours postnatals 4, p4) (poids corporel 1,5-1,8 kg) avec un historique génétique de 62,5 % de Landrace, 25 % de grands blancs et 12,5 % du Yorkshire.
2. Hébergez les animaux ensemble dans une pièce dédiée dans un porcherion, avec le soutien d’une lampe chauffante et d’un sol recouvert d’une serviette. Nourrissez-les à volonté avec un substitut de lait pendant la première semaine, puis passez progressivement à la nourriture granulée à 2-3 semaines.
3. Surveillez l’activité physiologique et le poids corporel et effectuez des IRM hebdomadaires sous anesthésie isofluorane.
4. Euthanasier par overdose de pentobarbital et perfuser transcardiquement avec du sérum physiologique hépariné, suivi d’un formol tampon neutre à 10 %.
5. Disséque le cerveau depuis^{le crâne 17}, fixe avec du formol pendant la nuit, puis ajoute 30 % de saccharose dans du PBS pendant 3 jours pour la cryopréservation.

2. Moulage en gel d’agarose

1. Immergez un récipient en verre dans un seau de glace humide jusqu’à sa demi-hauteur (Figure 2A).
2. Utilisez une bande plastique robuste comme revêtement pour le contenant et assurez-vous que le bas et les parois latérales sont complètement couverts tout en laissant les deux extrémités au moins 5 cm au-dessus du bord supérieur.
3. Chauffez 150 mL de PBS dans un bécher en verre à 90 °C sur une plaque chauffante à brassage avec un agitateur magnétique, puis ajoutez et dissoudez progressivement 6 g d’agarose pour obtenir un gel d’agarose à 4 % dans le PBS.
4. Verser une couche de 0,5 à 1 cm d’épaisseur dans le récipient en verre (Figure 2B) et attendre qu’elle solidifie.
5. Appliquez une fine couche d’huile minérale localement sur le cerveau (Figure 2C) et placez le cerveau sur la couche de gel (Figure 2D).
6. Laissez la solution d’agarose refroidir à 50 °C. Enfoncez le cerveau dans un gel d’agarose refroidi (Figure 2E) et laissez solidifier (Figure 2F), ce qui prend généralement ~10 minutes sur de la glace humide.
7. Retirez soigneusement la couche supérieure de gel d’agarose au-dessus du cerveau (Figure 2G) avec une sonde chirurgicale et extrayez le cerveau du moule solidifié (Figure 2H,I).
8. Chauffez 98 mL de PBS dans un autre bécher en verre à 90 °C sur une plaque chauffante à brassage avec un mélangeur aimant, ajoutez 4 g d’agarose et 2 mL d’encre de Chine, puis laissez bien remuer et mélanger. Verser 4 % d’agarose avec 2 % d’encre de Chine dans la cavité laissée par le cerveau extrait (Figure 2J) jusqu’à ce qu’il soit plein, puis laisser solidifier sur de la glace humide pendant 15 minutes (Figure 2K).
9. En utilisant les parties en surplomb de la bande plastique, soulevez la bande plastique pour retirer tout le bloc d’agarose du récipient (Figure 2L).

3. Découpage de blocs d’agarose et copie de gabarit sur papier à l’échelle

1. Pour protéger le papier de l’humidité lors de la découpe, placez une feuille de papier à l’échelle entre deux plaques acryliques transparentes de 0,76 mm (0,03") d’épaisseur (Figure 3A), puis placez la plaque papier laminé-acrylique placée près du bord de l’établi.
2. Fixez les carrés d’angle sur le établi avec des pinces à une position appropriée pour maintenir debout deux plaques acryliques de 5 mm d’épaisseur et maintenir fermement le bloc de gel entre les deux avec l’orientation souhaitée (sagittale dans la Figure 3). Assurez-vous que le bord de chaque plaque acrylique verticale est aligné sur la même ligne sur le papier à échelle, afin de servir de référence pour découper le bloc de gel. Utilisez un poids pour fixer le bloc de gel à l’extrémité opposée à celle où la découpe aura lieu (Figure 3B).
3. En utilisant le papier à écailles sous-jacent comme guide, déplacez le bloc de gel vers l’avant entre les plaques d’acrylique à l’étape souhaitée (2 mm ou 5 mm), tenez la lame du microtome à deux mains, puis tranchez la partie au-delà du bord avant de la plaque acrylique (Figure 3B).
4. Recueillez chaque tranche (Figure 3C), placez-la sur un papier à l’échelle séparée (Figure 3D), pressez doucement la partie teinte à l’encre de Chine du moulage sur le papier à écailles pour transférer le contour (Figure 3E), tracez le contour de toute la section gel avec un stylo, retirez la section gel et dessinez également l’impression à l’encre de Chine avec un stylo (Figure 3F). Faites attention à garder l’orientation de chaque tranche et le modèle copié cohérents.
5. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 jusqu’à ce que toutes les pièces de gel soient copiées sur le papier à écaille et numérotées séquentiellement. Revérifiez les tranches et leurs empreintes (images représentatives des tranches coronales et des empreintes dans la Figure 3G,H).

4. Sculpture en plaque acrylique

1. Faites des rainures sur la grande plaque acrylique avec un couteau de découpe en plexiglas et cassez les grandes plaques en morceaux de 10 x 8,5 cm.
   REMARQUE : Le nombre total de morceaux dépend de la taille du cerveau, de l’épaisseur de la tranche souhaitée et de l’orientation de tranche. En général, nous préparons 25 plaques acryliques de 2 mm pour une matrice coronale ou sagittale pour les cerveaux de porcelets néonatals, et 15 plaques de 5 mm pour les cerveaux plus grands afin de faciliter la manipulation.
2. On repère trois trous d’ancrage sur la plaque acrylique aux coordonnées x, y mesurées depuis le coin inférieur gauche (en mm) : (11, 42) ; (45, 15); et (88, 42).
3. Fixez les plaques en acrylique avec le support de carrés d’angle et de pinces sur la plateforme de la perceuse à colonne. Perçez trois trous d’ancrage aux coordonnées mentionnées avec une mèche à plaques acryliques (Figure 4A). Tracez une ligne de couleur sur le côté droit de toutes les plaques pour indiquer l’orientation.
4. Retirez le film protecteur de la plaque acrylique et placez-le au-dessus du gabarit sur le papier à échelle, en alignant le bord supérieur de la plaque acrylique avec les lignes supérieures du gabarit qui a été copié sur le papier écaille. Tracez le contour du cerveau sur la plaque acrylique avec un marqueur permanent (Figure 4B). Étiquetez la plaque séquentiellement comme dans le modèle.
5. Découpez la plaque acrylique de la scie à ruban le long des lignes de gabarit (Figure 4C). Sinon, utilisez un outil rotatif avec un kit de découpe polyvalent et une embout à sculpture sur bois pour éliminer les zones indésirables.
6. Polir le bord de coupe à l’aide de l’outil rotatif avec une embout ponçable pour lisser les bords laissés par l’outil de coupe (Figure 4D).
7. Revérifiez les découpes sur les plaques acryliques par rapport au gabarit sur le papier à échelles (Figure 4E). Taillez et polissez si nécessaire.
8. Préassemblez la matrice en empilant les plaques coupées dans un ordre séquentiel et vérifiez l’alignement des plaques (Figure 4F).

5. Assemblage et expansion de la matrice cérébrale

1. Placez trois rondelles entre des plaques d’acrylique, chacune centrée sur un trou d’ancrage (Figure 5A). Collez-les autour des trous d’ancrage avec de la superglue du même côté que toutes les plaques acryliques pour réduire le temps d’assemblage (Figure 5A).
2. Empilez les plaques d’acrylique séquentiellement, insérez des boulons en acier inoxydable à travers chaque trou d’ancrage pour assembler la matrice, et serrez les écrous pour fixer (Figure 5A).
3. Appliquez le polissage final des bords coupés qui toucheront le cerveau pour lisser les plaques.
4. Codez par couleur le haut de la matrice pour aider à identifier les étapes lors du découpage. Alternez la couleur des bords supérieurs de la plaque en noir, rouge, puis de l’espace blanc pour former un motif. Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les plaques soient codées par couleur avec le même motif (Figure 5).
5. Pour ajuster la géométrie ou modifier la taille de la cavité afin de mieux s’adapter à certains cerveaux, retirez ou ajoutez certaines plaques d’acrylique (Figure 5B) pour s’adapter à différentes tailles de cerveau, ce qui augmente considérablement la flexibilité de ces matrices et permet d’économiser des matériaux et des efforts.

6. Découpe coronale ou sagittale du cerveau

1. Enroulez une extrémité de la lame cryostat à profil élevé avec du ruban adhésif de laboratoire sur au moins 2 cm de longueur pour protéger la main de l’utilisateur. Placez le cerveau solidement dans la cavité matricielle. En tenant l’extrémité enveloppée de la lame, placez soigneusement la lame entre les plaques acryliques de la matrice, puis tranchez le cerveau en tranches coronales ou sagittales avec le cerveau soutenu et sécurisé par l’autre main (Figure 6A,B).
   REMARQUE : Prudence : 1) Comme chaque partie du cerveau a des textures différentes après fixation du formol, il faut faire preuve de prudence pour appliquer une pression uniforme sur la lame. 2) De plus, le cerveau du porcelet est grand, il est donc préférable d’utiliser un mouvement de tranche pour couper le cerveau plutôt qu’un mouvement direct de coupe « poussée vers le bas ». 3) Il est essentiel de garder le cerveau bien ajusté dans la matrice avec le soutien de l’autre main pendant la découpe afin d’éviter toute inclinaison ou changement d’orientation. Il faut éviter en permanence une pression excessive sur le cerveau contre la matrice.
2. Mettez toutes les tranches dans une plaque remplie de PBS à 6 puits ou dans un plateau en inox. Disposez soigneusement les tranches dans la même orientation (Figure 6C,D) et conservez ou procédez selon les besoins.

Résultats

Un porcelet a été euthanasié par overdose de pentobarbital à l’âge de 5 ans. Les trois autres animaux ont montré des activités physiologiques normales et une prise de poids similaire (atteignant 7,44-8,4 kg). Deux porcelets ont reçu une IRM hebdomadaire sous anesthésie isoflurane jusqu’à leur euthanasie au p32. Le quatrième porcelet est resté naïf jusqu’à l’euthanasie à la page 38.

La similarité de la taille de la tête entre le porcinet et le fœtus humain peut...

Discussion

Ce protocole présente la méthodologie pour créer des matrices cérébrales abordables et faciles à construire, qui peuvent être utilisées pour aider à découper le cerveau du porcelet ou de toute autre espèce de grand animal à l’orientation et à l’épaisseur souhaitées. Il est important de noter que, contrairement aux matrices commerciales de « taille fixe » qui ne fonctionnent qu’avec une plage limitée de tailles de cerveau, cette approche permet d’ajuster ou d’élargir la matrice de manière...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vis de machine à tête à treillis Phillips en inox 1/4 »-20 x 3-1/2 » (25 pièces), filetage grossier, acier inoxydable 18-8 (304), par compte-gouttes de boulons	Coupe-boulons		https://www.amazon.com/ Inox-Phillips-Machine -Bolt-Dropper/dp/B07D1L8 7VB/ref=sr_1_2 ?crid=38M PNERXG39Q3& mots-clés =1%2F4%22+3,5+pouce+ inox+boulons& qid=16427 82626& s=industriel& sprefix =1%2F4+3,5+pouces+inoxydable +boulons %2Cindustrial %2C62 & sr=1-2
Pack de 10 de 8 x 10" Panneaux PET / Plexiglas 0,03" Thick  ;	CALPALMY		https://www.amazon.com/dp /B084P4YSST/ ?coliid=I1S59 82XD9P6CB& colide = XJ78FAX D85BF& ; psc=1& ref_=lv_ov_lig_dp_it
Plaque de 3 3 feuilles d’acrylique transparente de 3/16 » (4,5 mm) 8 » x 12 » en plexiglas moulé (0,177 ») AZM de taille nominale épaisse	Écrans AZM		https://www.amazon.com/4-5mm -Acrylique-Plexiglas-Nominal-AZM /dp/B082CGYSCK/ref=sr_1_12 ? dchild=1& mots-clés=acrylique+feuille %2C+4,5mm& qid=1617572206& sr=8-12
3  ; Raccourcissement des cales à épaules  ; Rondelle, acier inoxydable 18-8, taille de boulon de 1/2 », diamètre de 0,501 », diamètre extérieur de 0,750 », épaisseur de 0,016 » (paquet de 50)	Petits rôles		https://www.amazon.com/Shoulder- Shortening-Washer-Stainless-Stee l-0-251/dp/B004K1FFZA/ref=sr_1_ 3 ?crid=1K8LO0VN4GLE& dchild=1 & mots-clés=Laveuses& ; _rd_r= 0ffe510e-abe5-4eae-b975-ed945 08ac71a& _rd_w=HuED5& _r d_wg=fixK7& pf_rd_p=b4950e17-f 2f6-494c-bba5-69a9d0aa3887& pf _rd_r=BRVGS2378CHD1WBC2E 4P& PID=3tNTL8W& ; qid=1617573484 & ; refinements=p_n_feature_twenty _browse-bin %3A17420898011%2 Cp_n_feature_twenty-one_browse -bin %3A19047154011& s=industria l& sprefix=washer %2Bfor %2B %2C aps %2C202& sr=1-3& th=1
Plaque à 6 puits	avantor	76520-650
Écrou hexagonal 8-32, écrou hexagonal à filetage grossier, écrou hexagonal en acier inoxydable 18-8, teinte argentée, ?100 pièces ?	Fullerkreg		https://www.amazon.com/Fullerkreg -Machine-Stainless-Bright-Quantity/ dp/B078S3J765/ref=sr_1_4 ?crid=4 VSSI5B9MJ2D& mots-clés=1%2F4 %22-20+Pouce+Inox+Acier+ Hex+écrou+grossier+filet& qid=1 642782823& s=industriel& sprefix =1%2F4+-20+inch+inoxydable+ste el+hex+nut+coabout+thread %2Cin dustrial %2C61& sr=1-4
Alliage d’aluminium à positionnement à 90 degrés	HINMAY		https://www.amazon.com/Positioni ng-Aluminium-Woodworking-Carp enter-Clamping/dp/B08294FZ7L/r ef=sr_1_6 ?crid=1I97TLVRYREPQ & dchild=1& mots-clés=corner+squ are& qid=1625683905& sprefix=co rner+squ %2Caps %2C182& sr=8-6
Agarose	avantor	97062-244
Scie à bande	SKIL
Remplaçant de lait Birthright (Pipestone)	Pipestone	SKU  ; 8229	https://pipevet.com/birthright-baby-pig-milk-replacer
Seau	avantor	89233-340
Kit rotatif haute performance Dremel 4300-5/40	Dremel		https://www.amazon.com/dp/B0 1M1SJNVU/ ?coliid=IMLRI62ZL JTSJ& colid=2XZ304Y9M7PV7 & psc=1& ref_=lv_ov_lig_dp_it
Mèches pour plastique (acrylique, plexiglas, ABS, lexan, polycarbonate, PVC)	FTM		https://www.amazon.com/dp/B 07D1B3B51/ ?coliid=I26RS6UP UJ3P1Y& colide=2XZ304Y9M7P V7& psc=1& ref_=lv_ov_lig_dp_it
Bécher en verre X 2	avantor	470335-854
Contenant en verre	Plats de teinture Wheaton	WHEATON® ;   ; 900303
Cahier en papier quadrillé : 1 mm d’épaisseur et 10 mm plus épaisse de lignes gris clair (métrique, 120 pages) :			https://www.amazon.com/ Carnet en papier millimétré double face-non-perforé /dp/154319026X/ref=sr_1_13 ? dchild=1& mots-clés=millimètre +papier& qid=1617634163& sr=8-13
HACKER INSTRUMENTS LAME DE COUTEAU MICROTOME	HACKER INSTRUMENTS
Bande plastique robuste	avantor	89072-136
Encre de Chine	Speedball SUPER NOIR
IRWIN QUICK-GRIP Clamps, à une main, mini-barre, 6 pouces, pack de 4 (1964758)	IRWIN		https://www.amazon.com/IRWIN -QUICK-GRIP-1964758-One- Pince à main/dp/B001DSY4 QO/ref=sr_1_5 ?crid=3NJ320 86LJCS6& dchild=1& mots-clés = slips+pour+menuiserie& qid =1617634545& sprefix=clamp % 2Caps %2C184& sr=8-5
Kreg KHC-Premium Slips de Face & nbsp ;	Kreg		https://www.amazon.com/KREG -KHC-PREMIUM-Kreg-Face- Pince/dp/B001DC9UR8/ref=sxin _11 ?ascsubtag=amzn1.osa.27 eddff2-544b-4c29-9242-220b3f 760cb0. ATVPDKIKX0DER.en_ États-Unis & creativeASIN=B001DC9UR 8& crid=3NJ32086LJCS6& cv_ct_ cx=pinces+pour+menuiserie& ; cv _ct_id=amzn1.osa.27eddff2-544b -4c29-9242-220b3f760cb0. ATVP DKIKX0DER.en_US & cv_ct_pg= recherche& cv_ct_we=asin& cv_ct_wn =osp-source-single-earns-comm& dchild=1& mots-clés=pinces+pour+ menuiserie& linkCode=oas& ; _r d_i=B001DC9UR8& _rd_r=eeaf7 178-eee3-4399-862a-479fffb6cfc3& _rd_w=W3Inj& _rd_wg=PKPUl& pf_rd_p=e666d5aa-04ca-46aa-86b0- 07ac28e037d4& pf_rd_r=22RKP4S4S SS5PYDM2ZFD& qid=1617634545& s préfixe=clamp %2Caps %2C184& SR=1- 2-64F3A41A-73CA-403A-923C-8152C4 5485FE& tag=thisoldhouse05-20
Ruban de laboratoire	avantor	76276-016
Loctite 1363589 bouteille de 4 grammes Super Glue Ultra Gel Control Adhesive, pack de 3	Loctite		https://www.amazon.com/Loctite- 1363589-4-Gram-Control-Adhesive/ dp/B01HPT0AWQ/ref=sr_1_13 ? mots-clés=superglue+power+glue +pour+plastique& qid=1642782991& s préfixe=superglue %2Caps %2C83& sr=8-13
Lames jetables Microtome à profil élevé	Optimal Scientific		https://www.amazon.com/Optimal -Scientific-Microtome-High-Profile -Jetable/dp/B08MCSN6SL/ref =sr_1_1 ?dchild=1& mots-clés=hig h+profil+cryostat+blade& qid=16 17592221& sr=8-1
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410-100ml
PBS	avantor	97062-818
Embout de polissage	Mèches en carbure de 20 pièces avec tige de 1/8"
Pellets pré-démarreur Non-Med - #50 (Pipestone)	Pipestone	SKU  ; 8228	https://pipevet.com/pre-starter-pellet-non-med-50-hubbard
Red Devil 1170 PLEXIGLASS Cutting TOOLCARDED	Diable Rouge		https://www.amazon.com/dp /B000BZZ1D0/ ?coliid=I3C0K3 AKD3TS75& colide=XJ78FAXD8 5BF& ; psc=1& ref_=lv_ov_lig_dp_it
Marqueurs permanents au marqueur Sharpie | Marqueurs à pointe de ciseau	Sharpie		https://www.amazon.com/ Sharpie-Permanent-Markers -Chisel-Classic/dp/B00006IFI A/ref=sr_1_8 ?crid=2GD78WJ5COF NN& mots-clés=permanent+marker s+assorted+colors& qid=16427831 06& sprefix=permanent+markers % 2Caps %2C129& sr=8-8
plaque chauffante à brassage	Corning	100493-718
Magent remuant	VWR	58948-138
STYLEZONE 10 pièces Feuilles d’acrylique transparente transparente 8 x 10 pouces 0,08 pouce 2 mm d’épaisseur	Style zone		https://www.amazon.com/dp/ B08GJYS4TT/ ?coliid=I11RLE V42BKEFB& colide = XJ78FAX D85BF& ; psc=1& ref_=lv_ov_lig_dp_it
Plateau chirurgical	avantor	10193-194
Glace humide	Fabriqué en laboratoire
Pointe en bois de carvign	Outils de sculpture sur bois pour outil rotatif		https://www.amazon.com/ magasins/page/28E50A85-D8C 1-4669-8272-D5D435EA126F