Imagerie High-Plex à l’aide de la microscopie confocale spectrale pour minimiser la fluorescence tissulaire non spécifique

Résumé

Le blanchiment itératif spectral étend la multiplexité (IBEX) s’appuie sur la technique IBEX de base en ajoutant un blocage de l’héparine pour minimiser la liaison non spécifique et en exploitant la détection spectrale avec démélange informatique pour supprimer l’autofluorescence. Cette approche accélère l’acquisition d’images tout en réduisant les sources d’arrière-plan, ce qui permet des analyses protéomiques spatiales robustes et multi-rondes à paramètres élevés.

Résumé

L’imagerie hautement multiplexée permet d’étudier des cellules fonctionnellement diverses et leurs niches dans leurs environnements tissulaires natifs. IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity) est une technique d’immunomarquage cyclique et d’inactivation des fluorophores qui permet de visualiser plusieurs marqueurs sur la même section de tissu. Les images capturées peuvent ensuite être analysées pour acquérir des données sur une seule cellule afin de définir les amas de cellules, leur localisation et les types de cellules voisines. L’interprétation de ces données repose sur la capacité à distinguer les expressions véritables des marqueurs des sources de fond inhérentes à la microscopie à fluorescence. Spectral IBEX, une adaptation du protocole IBEX, intègre la détection confocale spectrale avec le démélange informatique et intègre le blocage de l’héparine pour réduire la liaison hors cible basée sur la charge. Cette combinaison améliore le rapport signal/bruit de fond, supprime l’autofluorescence des tissus et minimise les fuites tout en réduisant le temps d’acquisition par rapport à l’imagerie confocale multipiste conventionnelle. L’application à du tissu de polypes nasaux humains, un modèle caractérisé par une teneur élevée en éosinophiles et une forte autofluorescence, a démontré une imagerie fiable de 26 marqueurs à travers les compartiments structurels, immunitaires et d’état cellulaire au cours de six cycles d’imagerie. Le flux de travail qui en résulte génère des informations protéomiques de grande dimension, résolues dans l’espace, qui capturent l’architecture tissulaire complexe et les niches cellulaires. L’ensemble de cette approche optimisée fournit une stratégie robuste et largement applicable pour l’imagerie multiplexée, particulièrement adaptée aux tissus où l’autofluorescence et la coloration non spécifique limitent les approches conventionnelles.

Introduction

Les tissus sont composés d’un ensemble diversifié de cellules dotées de fonctions spécialisées qui s’organisent en structures tridimensionnelles et, par l’interaction, coordonnent les processus biologiques nécessaires à la vie. La pathologie survient lorsque des perturbations de la composition cellulaire ou de l’architecture tissulaire interfèrent avec ces interactions et compromettent l’homéostasie tissulaire¹. La connaissance de la façon dont les nombreux types de cellules spécialisées localisent et interagissent dans nos tissus est nécessaire pour comprendre la biologie qui sous-tend la santé et la maladie humaines.

Les progrès des technologies de profilage unicellulaire aux niveaux transcriptomique, épigénomique et protéomique ont révélé une diversité exceptionnelle de types de cellules spécialisées. ^2,3 Des technologies telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire et la cytométrie en flux spectral peuvent mesurer le nombre de paramètres nécessaires pour caractériser ces populations hétérogènes. Cependant, ces approches manquent d’informations spatiales, car les cellules doivent être dissociées de leur environnement tissulaire natif en suspensions unicellulaires ^4,5. Ainsi, des types de cellules associés à divers contextes pathologiques ont été identifiés, mais leurs interactions au sein des tissus et leur contribution à la perpétuation de la maladie restent incertaines.

Pour remédier à certaines de ces limitations, plusieurs technologies spatio-omiques ont été développées pour capturer l’hétérogénéité cellulaire au sein d’un tissu tout en préservant la position de chaque cellule⁶. Par exemple, la transcription des gènes peut être mesurée soit en amplifiant l’ARN à des points pixellisés sur une section de tissu (par exemple, Visium), soit en utilisant des sondes d’hybridation d’ARN ciblant un panel de gènes spécifiques qui sont imagés à une résolution de cellule unique (par exemple, le xénium)^7,8. Ces méthodes sont efficaces pour tracer les modèles transcriptionnels et les mécanismes de régulation dans les tissus. Cependant, les profils transcriptionnels sont souvent peu corrélés avec l’expression des protéines, ce qui reflète plus directement les capacités fonctionnelles d’une cellule⁹. L’expression des protéines peut être identifiée à l’aide d’anticorps spécifiques conjugués à des fluorophores, qui peuvent être détectés par microscopie à fluorescence^10,11. L’utilisation de la microscopie à fluorescence traditionnelle peut permettre l’imagerie discrète de plus de six fluorophores conjugués à des anticorps. Cependant, le chevauchement des profils d’excitation et d’émission de ces fluorophores entraîne une incertitude quant à l’origine du signal de fluorescence dans un canal¹² donné.

IBEX (Iterative Bleaching Extends multipleXity) est une méthode d’imagerie à haut contenu qui a été développée pour surmonter cette limitation de la microscopie à fluorescence 13,14,15. IBEX utilise du borohydrure de lithium (LiBH₄) pour inactiver chimiquement les fluorophores après l’imagerie, ce qui permet de recolorer le même échantillon de tissu avec une série ultérieure d’anticorps conjugués aux fluorophores avant la réimagerie. IBEX préserve l’intégrité des tissus, permettant à de nombreuses séries d’imagerie de visualiser un nombre théoriquement illimité de marqueurs sur la même section de tissu. L’alignement computationnel des images acquises fournit une caractérisation de niveau omique à une résolution de cellule unique tout en préservant les données spatiales pour révéler les niches cellulaires. Ces données peuvent également révéler des interactions cellulaires présumées, bien que celles-ci doivent être validées à l’aide d’autres techniques¹⁶. IBEX est une méthode open source compatible avec les fluorophores disponibles dans le commerce et soutenue par une communauté internationale de chercheurs qui ont validé les réactifs et partagent publiquement les données pour promouvoir l’accessibilité, l’adoption rapide et la génération de données de haute qualité^17,18.

Dans ce travail, un protocole modifié d’IBEX a été conçu pour surmonter deux défis majeurs de la technique : l’autofluorescence tissulaire et la liaison non spécifique des sondes d’anticorps conjuguées aux fluorophores (collectivement appelées arrière-plan). L’autofluorescence se produit lorsque l’excitation de molécules fluorescentes endogènes à un tissu émet de la lumière qui chevauche le signal souhaité obtenu à partir de fluorophores conjugués à des anticorps^19,20. La liaison hors cible ou non spécifique d’anticorps conjugués aux fluorophores entraîne une fluorescence à partir de cellules ou de structures qui n’expriment pas la protéine cible^21,22. Ces artefacts peuvent aboutir à la conclusion inexacte qu’une cellule exprime un marqueur qu’elle n’exprime pas vraiment, ce qui complique les analyses computationnelles et l’attribution précise du type de cellule. En combinant la neutralisation de charge à base d’héparine du signal hors cible avec l’acquisition spectrale complète et le démixage informatique, l’IBEX spectral réduit considérablement le saignement, améliore le rapport signal/bruit de fond (SBR) et réduit de moitié le temps d’acquisition par tour.

Protocole

Les tissus des polypes nasaux utilisés dans cette étude ont été prélevés lors d’une chirurgie des sinus à Hamilton Health Sciences avec l’approbation éthique du Hamilton Integrated Research Ethics Board. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.

1. Prélèvement d’échantillons

1. Obtenez des échantillons lors des procédures de polypectomie de routine effectuées sur des patients atteints de rhinosinusite chronique. Après le retrait chirurgical, placez les échantillons dans un flacon contenant du sérum physiologique sur de la glace pour le transport et traitez-les immédiatement pour l’imagerie afin de préserver l’intégrité des tissus.

2. Préparation du réactif

1. Préparez la solution de fixation et de perméabilisation en diluant la solution de fixation et de perméabilisation obtenue à 1:4 dans du PBS. Préparez la solution de cryoconservation sous forme de saccharose à 30 % dans du PBS. Préparer le tampon de dilution à 0,1 % v/v Triton X-100 dans du PBS.
2. Préparer le réactif de bloc BSA sous forme d’albumine sérique bovine à 1 % p/v dans un tampon de dilution. Préparez le réactif de bloc d’héparine sous forme de sel sodique d’héparine 10KU dans 1 mL de PBS. Préparez le tampon de blocage en mélangeant le réactif de bloc d’héparine (1:50) avec le réactif de bloc Fc (1:100) dans le réactif de bloc BSA.
3. Préparez le mélange de coloration sous forme d’anticorps titré à des dilutions appropriées dans un tampon de blocage. Préparez une solution de blanchiment en ajoutant 10 mg de LiBH₄ dans 10 mL d’eau ultrapure.

3. Traitement et grossissement des tissus

1. Inspectez les tissus sous un microscope de dissection (généralement à un grossissement de ~15x, bien que cela puisse varier en fonction de l’échantillon et du microscope) et retirez la graisse et l’os à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Pour préserver au mieux les tissus, utilisez des instruments propres, travaillez sur une surface froide et humide et minimisez la durée du traitement.
2. Les tissus grossiers > 0,5 cm d’épaisseur en tranches de 4 à 5 mm avec un scalpel²³. Immerger les tranches dans une solution de fixation et de perméabilisation et les faire pivoter à °C pendant 16 h.
   REMARQUE : Le volume de cette solution et des autres solutions de l’étape 3.3 doit être d’environ 20 fois le volume de l’échantillon, dans un tube de taille appropriée.
3. Placez le mouchoir dans le PBS et rincez pendant 5 min. Immerger les tissus dans une solution de cryoconservation et incuber à °C pendant 16 h. Ne pas laver après cette étape, car cela réintroduirait de l’eau dans les tissus.

4. Congélation des tissus

1. Étiquetez une plaque à 6 puits avec les détails de l’expérience et de l’échantillon au-dessus de chaque puits et placez-la dans un congélateur à -20 °C pour qu’elle refroidisse pendant au moins 20 min.
2. Remplissez un cryomoule de taille appropriée avec un composé à température de coupe optimale (OCT). Évitez de créer des bulles dans l’OCT. Faites glisser les grosses bulles vers les bords du cryomoule à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe de pipette.
   REMARQUE : Un cryomoule peut être fabriqué à l’aide d’une feuille d’aluminium enroulée autour d’un petit flacon ou d’un tube à fond plat.
3. Retirez le tissu de la solution de cryoconservation. Tamponnez doucement le mouchoir sur une lingette non pelucheuse pour éliminer l’excès de liquide, car cela peut compromettre la congélation.
4. Remplissez un bécher de 250 ml avec environ 100 à 150 ml d’isopentane dans une hotte et placez-le dans une boîte à mousse ou une glacière partiellement remplie d’azote liquide.
   REMARQUE : L’isopentane s’évapore s’il est laissé ouvert pendant plus de 2 h ; Utiliser immédiatement après ouverture. L’isopentane facilite la congélation uniforme et rapide des tissus. L’isopentane peut geler lentement avec le temps. S’il gèle solidement, retirez le bécher de l’azote liquide et laissez-le décongeler. L’isopentane peut être versé dans une bouteille en verre avec un bouchon pour être réutilisé jusqu’à 5x. Le niveau d’isopentane doit être supérieur à celui de l’azote liquide pour éviter que le bécher ne flotte ou ne bascule.
5. Ajustez l’orientation du tissu comme vous le souhaitez dans l’OCT sous un microscope de dissection.
   REMARQUE : Pour les tissus des polypes nasaux, nous orientons généralement l’échantillon le long de son axe long pour obtenir des sections symétriques qui capturent la plus grande section transversale possible. Consultez les manuels d’histologie du tissu d’intérêt pour une orientation optimale de l’enrobage.
6. Trempez le fond du cryomoule dans l’isopentane. Retirez le cryomoule de l’isopentane lorsque le centre du tissu est entièrement blanc et opaque. Évitez d’immerger complètement le cryomoule ; Le bloc peut se fissurer, compromettant le sectionnement.
7. Sortez doucement le bloc du cryomoule en exerçant une pression sur le dos et placez-le dans la plaque à 6 puits pré-refroidie à -20 °C. Après avoir congelé tous les échantillons, transférez la plaque dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
   REMARQUE : Il s’agit d’un point de pause. Les mouchoirs peuvent être conservés à -80 °C pendant des années.

5. Préparation des lames et cryo-sectionnement

1. Pipeter 10-1 μL d’adhésif à la gélatine de chrome alun sur les lames ; Étaler uniformément et sécher à l’air libre pendant 15 min. Pour une adhérence optimale, appliquez un adhésif à base de gélatine de chrome et d’alun sur des verres de protection chambrés 2x-3x, en ajoutant 5 μL par application (total 15 μL).
2. Après séchage, placez les lames dans un four à 80 °C pendant 1 h pour assurer un séchage complet. Si vous utilisez un verre de protection à chambre, laissez-le sécher à 37 °C pendant la nuit, car le plastique peut fondre à 80 °C.
   REMARQUE : Une fois les lames enrobées et séchées, elles peuvent être conservées à température ambiante pendant des jours jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. Ils doivent être couverts pour éviter la poussière.
3. Transférez les tissus de −80 °C à −20 °C (ou dans le cryostat à la température de coupe) pour équilibrer et pré-refroidissez pendant 1 h avant la section. Découpez des sections de 10 à 2 μm sur un cryostat²⁴.
   1. Si vous coupez dans un verre de protection chambré, prélevez doucement la section à l’aide d’une pince après avoir soulevé la plaque anti-roulis. À l’aide d’un pinceau, posez-le à plat sur le verre à l’intérieur de la chambre. Appuyez sur le pouce sous l’échantillon au bas du verre de protection pour faire fondre la section sur le verre.
4. Sécher les lames à 3 °C pendant 1 h ou à température ambiante pendant 24 h.
   REMARQUE : Si les lames sont utilisées immédiatement, elles peuvent être temporairement stockées à température ambiante dans une boîte à lames pour les protéger de la poussière pendant la préparation aux taches. Cependant, s’ils ne sont pas utilisés immédiatement, conservez-les à -80°C pour préserver l’intégrité des tissus. Il s’agit d’un point de pause. Si les lames sont stockées à -80 °C, le processus peut être interrompu ici.

6. Blocage et immunomarquage des anticorps

1. Dessinez un cercle sur le verre autour du tissu à l’aide d’un stylo PAP pour créer une barrière hydrophobe qui contient le liquide pendant la coloration ou d’autres étapes. Ne tirez pas sur l’OCT, car l’encre hydrophobe s’effacera lorsque l’OCT se dissoudra.
   REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire pour le verre de couverture à chambre, car les parois retiennent le liquide dans le puits.
2. Ajouter ~100 μL de PBS à chaque tissu et incuber pendant ~2 min à température ambiante pour réhydrater les tissus et laver l’OCT. Utilisez ~1 mL de PBS pour le verre de protection chambré.
   REMARQUE : Pour éviter que le tissu ne se détache du verre, ne pipetez pas de liquide directement sur l’échantillon.
3. Aspirez le PBS et ajoutez 100 μL de tampon de blocage. Incuber à température ambiante dans une chambre d’humidité couverte pendant 1 h. Utilisez ~400 μL de tampon de blocage pour le verre de protection chambré.
4. Aspirez le tampon de blocage et ajoutez 100 μL du mélange de coloration. Incuber dans une chambre d’humidité couverte, placée à l’intérieur du réfrigérateur (4 °C) pendant la nuit. Utilisez ~400 μL du mélange de coloration pour le verre de couverture chambré. Préparez des coupes colorées avec un seul des fluorophores du panneau, et un contrôle négatif sans aucune coloration, pour définir le spectre des fluorophores et l’autofluorescence des tissus.
   REMARQUE : Les dilutions des anticorps doivent être optimisées expérimentalement en les titrant à 1:50, 1:100 et 1:200, ou à une autre dilution si nécessaire. Choisissez la quantité minimale d’anticorps qui donnera le signal optimal. Visez que les intensités de tous les anticorps du panel soient à peu près équivalentes afin de maximiser l’efficacité du démélange spectral. Protégez les échantillons de la lumière au-delà de cette étape afin de minimiser le photoblanchiment des fluorophores.
5. Aspirez le mélange de coloration et lavez 3 fois avec du PBS (10 μL, 2 min chacun), en aspirant le liquide entre chaque lavage. Utilisez ~1 mL de PBS pour le verre de protection chambré.
6. Ajoutez ~10 μL de support de montage à chaque section. Pipetez lentement pour éviter les bulles d’air qui créeront des aberrations optiques pendant l’imagerie. Aspirez toutes les bulles qui se forment à l’aide d’une pipette. Pour le verre de protection chambré, ajoutez 1 mL de support de montage dans chaque puits.
   REMARQUE : Les étapes suivantes, 6.7 et 6.8, ne sont pas nécessaires pour le verre de protection à chambre.
7. Posez délicatement le verre de protection n° 1 de 22 mm x 50 mm sur l’échantillon.
   REMARQUE : Les bulles peuvent être minimisées en appuyant fermement sur une extrémité du verre de couverture sur le support de montage et en laissant le verre tomber sur l’échantillon, en répartissant uniformément le fluide. L’épaisseur de la vitre de protection doit correspondre aux spécifications de l’objectif (par exemple, lamelle de protection #1.5 pour la plupart des objectifs à grande ouverture numérique). Si l’objectif est équipé d’un collier de correction, assurez-vous qu’il est ajusté à la bonne taille de lamelle. L’utilisation d’une épaisseur ou d’un réglage de collier incorrects peut provoquer une aberration sphérique et entraîner des images floues ou déformées.
8. Retournez la glissière et appuyez doucement sur une lingette non pelucheuse pour expulser l’excès de support de montage.
   REMARQUE : Évitez d’appuyer avec trop de force sur la glissière. Une force excessive peut endommager ou déformer le tissu, ce qui pourrait avoir un impact sur l’alignement entre les cycles d’imagerie.

7. Configuration et imagerie du microscope

REMARQUE : Ce protocole fait spécifiquement référence au ZEISS LSM980 et aux autres systèmes ZEISS. Ces étapes peuvent être différentes sur d’autres systèmes. Deux flux de travail sont détaillés : confocal + démixage traditionnel (acquisition multipiste avec démixage spectral computationnel post hoc), qui peut être utilisé lorsqu’un détecteur spectral n’est pas disponible, mais qui a des temps d’acquisition plus longs et un certain débordement résiduel ; et la détection spectrale complète (acquisition spectrale en un seul passage, 34 canaux), notre méthode préférée, car elle offre le meilleur SBR, une diaphonie proche de zéro et des temps d’imagerie les plus rapides.

1. Microscopie confocale traditionnelle
   1. Mettez le système de microscope sous tension (y compris les lasers, les détecteurs et l’ordinateur) environ 30 minutes avant l’imagerie.
   2. Sur l’écran de contrôle du microscope accessible en cliquant sur Microscope > objectifs, sélectionnez l’objectif approprié (par exemple, 20 x 0,8 NA) et nettoyez-le avec une lingette sans danger pour l’objectif si nécessaire.
   3. Montez l’échantillon en toute sécurité sur la platine. Essayez d’aligner le verre ou la chambre de verre de couverture contre le même coin/extrémité du support de diapositive pour faciliter l’alignement X-Y des tours consécutifs. Cela dépendra du support installé.
   4. Concentrez-vous sur l’échantillon à l’aide des oculaires de l’éclairage GFP, YFP ou RFP, puis basculez vers l’onglet Acquisition sur l’écran de l’ordinateur.
      REMARQUE : N’utilisez pas le filtre DAPI lors de la focalisation de l’échantillon à l’aide des oculaires, car l’exposition de la coloration DAPI à la lumière UV (à l’aide du cube du filtre DAPI) la fera photoconvertir en une molécule fluorescente verte (Figure supplémentaire 1A).
   5. Configurez des pistes d’imagerie qui minimisent le chevauchement et l’excitation laser croisée (le tableau supplémentaire 1 et le tableau supplémentaire 2 indiquent les paramètres d’acquisition pour les expériences de microscopie confocale traditionnelles présentées ici).
      REMARQUE : Les combinaisons idéales impliquent des pics d’excitation et d’émission distincts, tels que DAPI ou AF488 avec AF594, AF647 ou AF700.
      1. Attribuez le(s) laser(s) d’excitation optimal(s) pour chaque piste. Ajustez la taille du sténopé à 1 unité AU ou Airy pour chaque piste pour un sectionnement optique optimal.
      2. Ajustez la plage de longueurs d’onde d’acquisition pour chaque détecteur accordable de la piste séparément, en fonction des fluorophores de la piste.
      3. Réglez la puissance du laser et le gain du détecteur pour maximiser le SBR. Assurez-vous que très peu de pixels, voire aucun, atteignent leur intensité maximale.
         REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment et/ou la surexposition des détecteurs, maintenez la puissance laser aussi faible que possible. Optimisez la dilution des anticorps afin qu’un signal fort soit détecté au-dessus du bruit de fond.
   6. Appuyez sur le bouton Mode de balayage continu pour prévisualiser l’échantillon et définir les paramètres de balayage (vitesse de balayage, résolution et moyenne si nécessaire).
      REMARQUE : Pour les petites tuiles et pour minimiser l’arrière-plan, un temps de séjour compris entre 0,2 et 0,3 μs, avec 1 à 2 tours moyens, est recommandé. Pour maximiser la vitesse tout en préservant la segmentation et la résolution d’une seule cellule, utilisez la vitesse de balayage la plus rapide sans moyenne et une taille de pixel de 0,2-0. μm/pixel. Par exemple, une imagerie à 2048 x 2048 pixels par tuile avec un objectif 20x/0,80 NA donne un rendement de 0,20 μm/pixel sur une trame de 424,26 x 424,2 μm².
   7. Effectuez des balayages de test pour chaque piste afin de vérifier la diaphonie ou le saignement.
      1. Sur la diapositive colorée avec tous les marqueurs, en mode de balayage continu, démarrez chaque laser à faible puissance et ne l’augmentez que jusqu’à ce que le marqueur soit clairement visible sans saturation (utilisez l’indicateur LUT/saturation).
         REMARQUE : Si possible, il est recommandé d’utiliser un échantillon répété ou une région indésirable pour optimiser les paramètres du microscope avant d’imager l’échantillon expérimental. Ceci est particulièrement important lors de la coloration avec du DAPI (pour éviter le risque de photoconversion) ou des fluorophores qui photoblanchissent rapidement (par exemple, le PE).
      2. Passez à la commande monocolore pour ce fluorophore. Ajustez la puissance du laser et le gain du détecteur de manière à ce que le signal soit brillant et insaturé.
      3. Sur la même lame monocolorée, balayez tous les autres canaux de détection. Si l’intensité hors canal dépasse le bruit de fond, rétrécissez la fenêtre de détection et/ou réduisez l’excitation/le gain.
      4. Répétez les points 7.1.7.1 à 7.1.7.2 pour chaque fluorophore. Après tout ajustement, vérifiez brièvement les colorations précédemment optimisées pour garder les intensités comparables, en particulier pour les marqueurs qui co-localisent.
   8. Activez la fonctionnalité Vignettes et définissez une région d’acquisition de vignettes.
      1. Optimisez la mise au point de la région d’acquisition de la tuile au centre du tissu. Trouvez une caractéristique unique (un ensemble de cellules dans une certaine disposition) comme référence pour l’alignement dans les tours ultérieurs.
   9. Activez la fonction Z-stack et accédez à l’onglet Z-stack. Allez dans l’onglet Centre. Définissez le nombre de tranches dans la pile Z sur au moins 6, avec un intervalle d’au moins 1 μm entre les tranches. Cliquez ensuite sur le bouton Centre pour positionner le point de mise au point actuel (déterminé à l’étape 6.1.8.1) comme la tranche centrale de la pile.
   10. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition des images. Enregistrez les paramètres d’acquisition et sauvegardez les données de l’image en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la vignette de l’image et en sélectionnant Enregistrer sous. Ensuite, choisissez l’emplacement du fichier et nommez l’image.
   11. Démélangez l’image en utilisant les mêmes paramètres optimisés que ceux de l’acquisition de la région en mosaïque, capturez un Snap à partir de chaque commande mono-colorée pour obtenir le spectre du signal réel et à partir de la commande non colorée pour capturer l’arrière-plan/l’autofluorescence, préparé à l’étape 6.4.
       1. Ces images sont utilisées pour le démixage spectral ; Ne sélectionnez pas True Signal à partir d’échantillons multiplexés. Confirmez que la région sélectionnée représente vraiment le signal en vous assurant d’abord que l’intensité/morphologie est absente ou équivalente au bruit de fond dans le témoin non coloré, puis en faisant correspondre la localisation attendue du marqueur (par exemple, membrane, nucléaire, cytoplasmique, sécrété).
       2. Ouvrez l’image instantanée. Cliquez sur l’onglet Démixage . Utilisez l’un des outils de sélection de région sous l’onglet Outils de démixage pour dessiner une ROI autour du signal positif (un spectre de cette région apparaîtra). Répétez cette opération pour chaque image instantanée de chaque fluorophore afin de créer des spectres de référence pour le démélange.
          1. Comparez ce spectre au spectre théorique du fluorophore pour vous assurer que la région sélectionnée est représentative du signal réel. Nommez le spectre en fonction de chaque fluorophore et enregistrez-le dans la base de données spectrale.
             REMARQUE : Un spectre d’autofluorescence peut être identifié et traité comme un fluorophore distinct afin de le dissocier des autres signaux. Après l’optimisation complète du panel, l’acquisition de nouvelles références n’est pas nécessaire, car on peut réutiliser les mêmes paramètres tant que le même protocole et le même type de tissu sont utilisés.
       3. Chargez l’image en mosaïque et accédez à l’outil Dissociation. Utilisez le bouton + pour ajouter les spectres de référence de chaque fluorophore à la liste de démixage, puis cliquez sur le bouton Démixage linéaire .
   12. Enregistrez l’image non mélangée pour une analyse ultérieure.
       REMARQUE : La sortie est une image à plusieurs tuiles avec un canal pour chaque marqueur. L’expérience peut être interrompue ici avant de continuer.
   13. Acquisition de l’image de référence d’ombrage
       1. En utilisant exactement le même paramètre que celui utilisé pour l’imagerie de l’échantillon, acquérez une image d’une lame d’étalonnage DAPI. Enregistrez l’image, puis extrayez uniquement le canal DAPI qui servira de référence d’ombrage. Le résultat est une image à champ plat (Figure supplémentaire 1B).
          REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’acquérir une image de référence pour chaque échantillon. Tant que le même instrument avec les mêmes réglages est utilisé, la référence doit être la même. Cette référence n’est pas nécessaire si les images acquises ne présentent pas d’artefacts d’ombrage, comme le montre la figure supplémentaire 1C.
2. Microscopie confocale spectrale
   1. Mettez sous tension le système de microscope (y compris les lasers, les détecteurs et l’ordinateur). Sélectionnez l’objectif approprié (par exemple, 20x 0,8 NA ou tout autre objectif) et nettoyez-le si nécessaire.
   2. Montez l’échantillon en toute sécurité sur la platine. Assurez-vous que la lamelle fait face à l’objectif.
   3. Faites la mise au point sur l’échantillon à l’aide d’un fond clair ou d’une CID, puis passez en mode fluorescence. Configurer l’acquisition spectrale. Le tableau supplémentaire 3 présente les paramètres d’acquisition pour les expériences de microscopie confocale spectrale présentées ici.
      1. Attribuez les bons lasers.
         REMARQUE : Certains lasers peuvent exciter plusieurs fluorophores. Ainsi, il n’est peut-être pas nécessaire d’avoir un laser unique pour chaque fluorophore.
      2. Sélectionnez un séparateur de faisceau adapté aux lignes laser utilisées. Permettez à tous les détecteurs de capturer autant de spectre que possible. Ajustez la taille du sténopé à 1 UA pour un sectionnement optique optimal.
   4. Optimiser le réglage du laser
      1. À l’aide d’une section tachée avec tous les marqueurs, démarrez le mode de balayage continu avec des lasers à faible puissance. Réglez l’intensité de chaque laser jusqu’à ce que les marqueurs puissent être identifiés à un bon SBR.
         REMARQUE : Bien que cela ne permette pas un réglage précis pour les fluorophores qui se chevauchent spectralement, cela aidera à minimiser le nombre de fois où les lames monocolorées doivent être commutées sur le microscope.
      2. Utilisez des sections monocolorantes pour affiner les intensités laser pour chaque fluorophore. Passez de manière itérative des sections à coloration unique à la section avec tous les marqueurs jusqu’à ce que le signal de chaque marqueur puisse être visualisé sans sursaturation.
         REMARQUE : Chaque fois qu’un réglage d’intensité ou de gain laser est ajusté, revenez sur les lames à coloration unique précédemment optimisées pour vous assurer que le signal reste optimal. Pour un démixage optimal, les niveaux d’intensité du signal doivent être aussi similaires que possible entre les marqueurs, en particulier entre les marqueurs qui colocalisent. Si possible, il est recommandé d’utiliser un échantillon répété ou une région indésirable pour optimiser les paramètres du microscope avant d’imager l’échantillon expérimental. Ceci est particulièrement important lors de la coloration avec du DAPI (pour éviter le risque de photoconversion) ou des fluorophores qui photoblanchissent rapidement (par exemple, le PE).
   5. Effectuez les étapes 7.1.8 à 7.1.14.

8. Retrait de la lamelle (s’applique uniquement aux diapositives, pas au verre de protection chambré)

1. Immergez la glissière dans le PBS et laissez la lamelle se détacher. N’essayez pas de forcer le lamelle, car cela pourrait déformer le tissu, provoquant des problèmes d’alignement lors des cycles d’imagerie ultérieurs ou un détachement complet de la lame. Utilisez un récipient suffisamment grand pour s’adapter à la diapositive et assurez-vous qu’elle peut être complètement immergée dans le PBS.

9. Blanchiment et cycle au fluorophore

1. Pour le verre de protection chambré uniquement : Aspirez autant de support de montage que possible à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas endommager le tissu.
   REMARQUE : L’inclinaison de la chambre sur le côté peut faciliter l’aspiration.
2. Laver 3 fois avec ~1 mL (verre de protection chambré) ou ~100 μL (lames) de PBS pendant 2 min jusqu’à ce que le support de montage soit complètement retiré.
3. Préparez la solution de blanchiment dans la hotte. Pesez 10 mg de LiBH₄ directement dans un bécher sec à l’aide d’une micro-spatule. Ajoutez délicatement 10 ml d’eau ultrapure directement dans le bécher contenant LiBH₄ et mélangez jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous pour obtenir la solution de blanchiment.
   REMARQUE : Préparez immédiatement avant l’utilisation pour une réactivité maximale.
   ATTENTION : Le LiBH₄ est extrêmement inflammable, cette étape nécessite donc un soin extrême - assurez-vous que la hotte est utilisée correctement (c’est-à-dire un châssis à la hauteur appropriée, un EPI approprié, etc.) et ne travaillez qu’avec <10 mg de LiBH₄ à la fois. Assurez-vous que le bécher est complètement sec avant d’ajouter LiBH4 - le non-respect de cette consigne peut entraîner un incendie.
4. Ajouter ~100 μL de solution de blanchiment, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, à chaque section de tissu et incuber à température ambiante dans la hotte pendant 15 min. Utilisez 2 ml de solution de blanchiment pour les lames de chambre.
5. Si vous blanchissez avec des colorants BV (par exemple, BV421, BV510, etc.), déplacez soigneusement le puits vers un microscope épifluorescent. Sélectionnez le filtre DAPI, concentrez l’échantillon et éclairez-le à pleine puissance.
   1. Utilisez l’objectif 5x pour un plus grand champ d’éclairage. Abaissez l’étage aussi bas que possible pour éviter d’endommager les objectifs et le boîtier.
6. Décantez la solution de LiBH₄ hors du puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et ajoutez-la dans le bécher de la solution de LiBH₄ .
   REMARQUE : Il s’agit désormais de déchets LiBH₄ ; La solution ne peut pas être stockée pour une utilisation future.
7. Lavez les lames 3 fois avec un tampon de dilution et incubez pendant ~3 min. Le volume total est de 2 mL pour les lames de chambre.
8. Ajoutez le mélange d’anticorps et colorez selon le protocole normal (étapes 6.3 à 6.8).
9. Ajouter 2N H₂SO₄ goutte à goutte aux déchets LiBH₄ dans la hotte en mélangeant régulièrement.
   ATTENTION : LiBH₄ bouillonnera de manière agressive. Ces bulles sont du gaz_H2 libéré par le LiBH₄ ; H₂ est très inflammable donc faites extrêmement attention à cette étape et ajoutez H₂SO₄ très lentement.
10. Versez-le dans un sous-matelas absorbant lorsque la solution ne bouillonne plus. Rincez le bécher à l’eau ultra-pure et versez-le dans le sous-matelas absorbant.
    ATTENTION : Mettez le sous-coussin absorbant dans un sac à risque chimique/biologique, fixez-le et jetez-le conformément aux directives locales en matière de danger chimique.

10. Traitement post-acquisition de l’image

1. Ouvrez l’image de référence (à partir de l’étape 7.1.14) dans le logiciel Zen en cliquant sur Fichier > Ouvrir > Sélectionner l’image de référence.
   REMARQUE : Les étapes de traitement d’image post-acquisition peuvent également être effectuées dans des progiciels open source. (par exemple, ImageJ).
2. Ajustez la luminosité et le contraste pour optimiser la plage dynamique en cliquant sur Traitement > Intensité > Étirement du contraste > Auto > Appliquer.
3. Changez le type de pixel en 32 bits en cliquant sur Traitement > image > Convertir le type de pixel > 32 bits (Float).
4. Normalisez l’image de référence en cliquant sur Traitement > Intensité > Normaliser (pixels saturés = 0 %) > Appliquer.
5. Lissez l’image de référence en cliquant sur Traitement > Lissage > gaussienne > entrez le rayon (par exemple, 2-5 px) > Appliquer (Figure supplémentaire 1B).
   REMARQUE : Optimisez le rayon du flou gaussien en essayant différentes valeurs. Pour connaître la bonne valeur divisée (Traiter > Calculateur d’image), l’image de référence brute par l’image traitée et l’image résultante doivent avoir une intensité uniforme (tous les pixels ayant à peu près la même valeur).
6. Ouvrez l’image à plusieurs tuiles à corriger en cliquant sur Fichier > Ouvrir > sélectionnez l’image à plusieurs tuiles.
7. Appliquez la correction d’assemblage et d’ombrage à l’aide de la référence traitée en cliquant sur Traitement > Assemblage avec les paramètres suivants.
   1. Cochez la case de mélange. Cochez la case d’ombrage correcte et dans le menu déroulant, choisissez l’image de référence traitée (étape 10.5). Gardez tous les autres paramètres identiques.
      REMARQUE : Les paramètres peuvent nécessiter un réglage pour obtenir les meilleurs résultats.
   2. Dans le menu Entrée/Sortie, choisissez l’image à mosaïques multiples comme entrée et la référence d’ombrage comme référence.
   3. Appuyez sur le bouton Appliquer en haut et une nouvelle image avec l’assemblage et l’ombrage corrigés sera générée (Figure supplémentaire 1D).
      REMARQUE : La correction de l’assemblage (figures supplémentaires 1I-J) est nécessaire pour assurer la précision de l’alignement de l’image plus tard dans le processus.
   4. Enregistrez l’image corrigée en cliquant sur Fichier > Enregistrer > Sélectionner un dossier.

11. Alignement de l’image

1. Convertissez les images traitées, quel que soit leur format (.czs, .tif, etc.) au format Imaris à l’aide de l’outil Imaris File Converter.
   REMARQUE : L’outil peut être téléchargé et installé en suivant les instructions sur ce site Web (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
2. Lancez l’outil d’enregistrement des extensions Imaris pour enregistrer (aligner) les images de tous les tours en une seule image avec tous les canaux.
   REMARQUE : Pour installer l’outil et aligner correctement les images, suivez les instructions sur le site Web suivant (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
3. Cliquez sur le bouton Imaris Extensions . Sélectionnez SimpleITK Utilities > Exporter les paramètres de la chaîne au format CSV.
4. Cliquez sur Parcourir, accédez à une image .ims (à partir de l’un des tours), sélectionnez-la, puis cliquez sur Ouvrir.
5. Cliquez sur Exporter et choisissez un emplacement pour enregistrer le fichier CSV. Entrez un nom et cliquez sur Enregistrer.
6. Ouvrez le fichier CSV enregistré et vérifiez que les noms des chaînes sont corrects. Modifiez si nécessaire.
7. Si des modifications sont apportées, allez dans Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings.
   REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire si aucune modification n’a été apportée à l’étape précédente.
8. Cliquez sur Parcourir, accédez au fichier CSV, sélectionnez-le, puis cliquez sur Ouvrir. Cliquez sur Suivant, puis sur Parcourir à nouveau pour sélectionner la même image .ims et cliquez sur Ouvrir.
9. Cliquez sur Configurer pour appliquer les modifications. Répétez les étapes 11.3 à 11.8 pour toutes les images de différents tours.
10. Une fois les canaux correctement nommés, allez dans Imaris Extensions > Algorithmes SimpleITK > Enregistrement affine des Z-Stacks à l’aide d’un canal commun.
11. Cliquez sur Parcourir, accédez au dossier contenant tous les ronds, sélectionnez toutes les images, puis cliquez sur Ouvrir.
12. Cliquez sur Suivant, sélectionnez le canal d’enregistrement (canal de référence). Pour ce protocole, le canal DAPI a été utilisé. Choisissez ensuite l’image fixe.
    REMARQUE : Choisissez un canal/marqueur qui reste constant sur toutes les rondes et qui résiste aux produits chimiques ou au photoblanchiment (par exemple, les colorants nucléaires comme le DAPI). Choisissez ensuite l’image fixe.
13. Cliquez sur Paramètres d’enregistrement avancés, cochez toutes les cases sauf Masque automatique et réglez le sigma de lissage gaussien sur 5.0.
14. Cliquez sur Terminé, puis sur Enregistrer pour effectuer l’alignement. Une fois l’inscription terminée, cliquez sur Rééchantillonner et enregistrer l’image combinée.
15. Après le rééchantillonnage, sélectionnez le canal de repère et cliquez sur Calculer la corrélation. Les fichiers de sortie comprennent une image output.ims alignée, deux PDF indiquant la qualité de l’alignement avant et après l’enregistrement, un fichier JSON contenant les paramètres utilisés pour l’enregistrement et un fichier TXT avec le journal de l’ensemble du processus.

12. Alignement de l’image

1. Segmenter des cellules/objets à l’aide de CellPose (v2.5)²⁵
2. Pour chaque jeu de données à coloration unique, générez un masque de segmentation à partir du canal de détection du marqueur (Exemple : pour le colorant unique CD20, générez le masque à partir du canal de détection AF488 (canal prévu pour CD20)).
3. Appliquez le masque de segmentation de l’étape 2 à chaque canal du même jeu de données (dans l’exemple CD20, le masque dérivé de l’AF488 est appliqué à l’AF488 pour mesurer le signal réel et à tous les autres canaux de détection pour mesurer le saignement).
4. Extrayez les intensités et les aires par objet en Python à l’aide de scikit-image (regionprops_table) et de NumPy.
5. Rapport signal/bruit de fond (SBR)
   1. Calculez l’intensité moyenne de l’objet sur tous les ROI segmentés dans le canal de détection prévu du marqueur.
   2. Définissez l’intensité de l’arrière-plan comme l’intensité moyenne de tous les pixels en dehors des zones d’intérêt dans le même champ de vision, à l’exclusion des pixels de remplissage à valeur nulle ou des pixels hors limites.
      Calculer le SBR comme suit :
      
   3. Visualisez les distributions SBR à l’aide de graphiques à violon, en affichant les valeurs par objet sous forme de points (ou de valeurs par trame lorsque cela est indiqué).
6. Quantification des saignements
   1. Pour chaque canal non prévu, calculez le saignement ( %) en utilisant les mêmes ROI que ceux du masque à l’étape 12.2 :
      
   2. REMARQUE : les entrées diagonales sont égales à 100 %, car dans le canal prévu d’une image à coloration unique, le numérateur et le dénominateur sont identiques (le signal de marqueur réel est mesuré dans son propre canal).

Résultats

Deux défis fondamentaux rencontrés par les techniques d’imagerie par immunofluorescence sont la liaison non spécifique des sondes d’anticorps conjuguées aux fluorophores et l’autofluorescence tissulaire. Ce protocole est conçu pour aider à distinguer un signal réel du bruit de fond afin d’optimiser les techniques d’immunofluorescence multiplexée.

Le blocage de l’héparine réduit la liaiso...

Discussion

Spectral IBEX, une adaptation du protocole IBEX, répond avec succès à deux problématiques clés de l’imagerie d’immunofluorescence : la liaison non spécifique et l’autofluorescence. Le traitement des tissus hautement éosinophiles avec de l’héparine et l’utilisation du démélange spectral pour éliminer l’autofluorescence et le chevauchement spectral entre les canaux ont considérablement augmenté la détection du signal réel au-dessus du bruit de fond. La capture de tous les marqueurs en un s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’acide sulfurique 2N (H2SO4)	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Bécher de 500 mL	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Plaque à 6 puits	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
BCL-6 - Alexa Fluor 647	BD Biosciences	561525	Facteur de dilution 1:100
Kit de fixation/perméabilisation de cytofix/cytoperm BD	BD Biosciences	554722
Microscope de dissection de laboratoire	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Albumine sérique bovine (BSA)	SIGMA-ALDRICH	A4503
CD11c - Alexa Fluor 700	BD Biosciences	561352	Facteur de dilution 1:100
CD138/Syndecan-1 - PE	BioLegend	356503	Facteur de dilution 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53020282	Facteur de dilution 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532	NovusBio	NBP2-60733AF532	Facteur de dilution 1:100
CD23 - EP	BioLegend	338507	Facteur de dilution 1:200
CD3 - iFluor 594	AAT Bioquest	100320C0	Facteur de dilution 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303134	Facteur de dilution 1:100
CD34 - iFluor 594	AAT Bioquest	103400C0	Facteur de dilution 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303523	Facteur de dilution 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647	BioLegend	300520	Facteur de dilution 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532	ThermoFisher Scientific	58045942	Facteur de dilution 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647	BioLegend	353113	Facteur de dilution 1:100
Adhésif Chrome Alum-Gélatine	Approvisionnement des nouveaux arrivants	1033A
Cryomold	Fisher Scientific & nbsp ;	NC9511236	De plus, le numéro de catalogue 50-465-347 pour les échantillons plus volumineux
Culasse d’étalonnage DAPI	Agar Scientific	AG2273
Solution DAPI, 1 mg/mL	ThermoFisher Scientific	62248	Facteur de dilution 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647	BioLegend	147307	Facteur de dilution 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594	BioLegend	324228	Facteur de dilution 1:100
Tubes Eppendorf/Falcon	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Pinces	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
FoxP3 - eFluor 660	ThermoFisher Scientific	50577382	Facteur de dilution 1:100
Lames de microscope à extrémité givrée	Chimie	GEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	53590282	Facteur de dilution 1:100
Sel d’héparine sodique	SIGMA-ALDRICH	H3393	10KU
HLA-DR - PE	NovusBio	NB100-77855PE	Facteur de dilution 1:200
Human TruStain FcX (solution bloquante des récepteurs Fc)	BioLegend	422302	Facteur de dilution 1:100
Chambre d’humidité	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Seau à glace avec couvercle	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
IgD - Alexa Fluor 488	BioLegend	348215	Facteur de dilution 1:100
IL4Ra/CD124 - PE	BioLegend	144803	Facteur de dilution 1:200
Convertisseur de fichiers Imaris	Instruments OXFORD	N/A	Couvrir tout format de fichier image en format .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentane (2-méthylbutane)	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Ki-67 - Alexa Fluor 488	BD Biosciences	558616	Facteur de dilution 1:100
Kimberly-Clark Kimtech Science Professional Kimwipes Essuie-glaces délicats, 1 brin	Kimtech Science	06-666
De grandes pinces (c’est-à-dire 25 cm de long)	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Azote liquide	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Borohydrure de lithium (LiBH4)	SIGMA-ALDRICH	222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53603680	Facteur de dilution 1:100
Verre n°1 pour cache-lames de microscope 22x50 mm	Fisher Scientific & nbsp ;	12-542A
Eau Milli-Q	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
MUC2 - Alexa Fluor 488	NovusBio	NB120-11197AF488	Facteur de dilution 1:100
Vitre de couverture chambrée Nunc Lab-Tek	ThermoFisher Scientific	155380
Stylo PAP	Abcam	AB2601
Solution de solution saline tamponnée phosphate (PBS)	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
Scalpel	N/A	N/A	Tout ce qui est disponible/utilisé dans le laboratoire
SimpleITK Imaris Extensions	N/A	N/A	Logiciels utilisés pour aligner des images de différents tours (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
Saccharose	SIGMA-ALDRICH	S0389
Composé Tissulaire-Tek O.C.T.	Sakura Finetek USA	4583
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
Zeiss LSM 980	Microscopie ZEISS	N/A	Le système d’imagerie utilisé dans cette étude
Zen Blue	Microscopie ZEISS	N/A	Le logiciel utilisé pour le traitement d’image après acquisition