Induction d’une légère hyperthermie ciblée dans des modèles de tumeurs murines par conversion photothermique de la lumière proche infrarouge par des nanotiges d’or intratumorales

Résumé

Ce protocole présente les techniques et la méthodologie nécessaires à la thérapie hyperthermique ciblée dans des modèles de tumeurs solides. L’approche exploite la conversion photothermique de la lumière proche infrarouge par des nanotiges d’or injectées intratumorale pour induire un réchauffement localisé dans le microenvironnement tumoral.

Résumé

L’hyperthermie légère (42-48 °C) est une modalité thérapeutique bien établie qui peut induire une mort contrôlée des cellules tumorales et stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses. Cependant, fournir de la chaleur avec précision aux tissus tumoraux tout en épargnant les tissus sains environnants reste un défi important. Les méthodes traditionnelles d’hyperthermie, telles que la perfusion isolée d’un membre, nécessitent des procédures complexes et invasives et comportent un risque important de toxicité locale et de morbidité pour le patient. En revanche, la thérapie photothermique utilisant des nanoparticules d’or activées par la lumière proche infrarouge (NIR) est apparue comme une stratégie prometteuse et moins invasive pour obtenir une hyperthermie localisée. Les nanotiges d’or (GNR), en particulier, présentent des propriétés optiques réglables et une efficacité de conversion photothermique élevée, ce qui en fait des candidats idéaux pour la modulation thermique précise des sites tumoraux. Bien que cette technique se soit révélée très prometteuse, en particulier pour les tumeurs superficielles et accessibles, l’administration reproductible, le confinement spatial et la sécurité restent des domaines actifs de raffinement. Dans ce protocole, nous présentons notre méthode validée et optimisée pour obtenir une hyperthermie légère localisée en utilisant l’injection intratumorale de GNR biocompatibles suivie d’une exposition ciblée au laser NIR de courte durée. Cette approche permet un échauffement rapide et contrôlable dans la gamme thérapeutique, favorisant la mort des cellules tumorales immunogènes et stimulant les réponses immunitaires innées, mécanismes particulièrement pertinents pour les tumeurs immunologiquement « froides ». La surveillance de la température en temps réel et la distribution locale garantissent la reproductibilité, la sécurité et une exposition systémique minimale. Ce protocole simplifié offre une plate-forme robuste et accessible pour les études précliniques, soutenant des efforts plus larges visant à exploiter l’hyperthermie légère dans l’immunothérapie du cancer.

Introduction

Le traitement du cancer reste à relever d’importants défis, notamment la résistance aux médicaments, l’évasion immunitaire et la toxicité hors cible, qui compromettent tous le succès à long terme des thérapies conventionnelles. Ces limites ont conduit au développement de stratégies thérapeutiques complémentaires conçues pour surmonter les mécanismes de résistance tout en minimisant les dommages collatéraux aux tissus sains. L’hyperthermie légère, définie comme l’élévation de la température des tissus à 42-48 °C, est reconnue depuis longtemps comme un complément efficace aux traitements anticancéreux standard¹. Historiquement, l’hyperthermie légère a été utilisée en combinaison avec la chirurgie, la chimiothérapie ou la radiothérapie pour améliorer l’efficacité de ces thérapies en augmentant la perfusion tumorale, en perturbant l’architecture stromale et en sensibilisant les cellules malignes aux agents cytotoxiques¹. Plus récemment, avec le succès croissant de l’immunothérapie en oncologie, on s’intéresse de plus en plus à l’exploitation du potentiel immunomodulateur inhérent à l’hyperthermie légère pour améliorer les réponses immunitaires antitumorales ^1,2,3.

Malgré ses avantages cliniques démontrés, l’application plus large de l’hyperthermie tumorale reste limitée en raison des défis rencontrés pour obtenir un chauffage localisé, contrôlable et reproductible des tumeurs tout en évitant les lésions tissulaires hors cible⁴. Les techniques cliniques et expérimentales actuelles d’hyperthermie, telles que la perfusion régionale des membres ou les approches systémiques basées sur des nanoparticules, souffrent souvent d’une précision spatiale limitée, d’une absorption tumorale variable et d’un potentiel de toxicité systémique 2,5,6,7,8,9 . La thérapie hyperthermique ciblée est une modalité émergente dans ce domaine du traitement du cancer, conçue pour élever sélectivement la température tumorale tout en minimisant les dommages aux tissus sains environnants. Plus précisément, l’administration ciblée de nanotiges d’or (GNR) est une méthode prometteuse pour surmonter les limites actuelles de la précision et de la toxicité de l’hyperthermie tumorale légère. Les GNR sont particulièrement bien adaptés aux applications photothermiques en raison de leur résonance plasmonique de surface accordable dans la région du proche infrarouge, de leur efficacité de conversion photothermique élevée et de leurs profils de biodistribution favorables par rapport à d’autres nanostructures d’or^10,11. Leur réactivité aux longueurs d’onde NIR permet une absorption efficace de la lumière et un réchauffement localisé, même dans les tissus plus profonds, avec des dommages minimes aux structures environnantes. En tant que tels, les GNR peuvent améliorer l’efficacité, le ciblage et l’innocuité des thérapies hyperthermiques.

L’objectif de cette méthode est de fournir un protocole hautement efficace, peu gourmand en ressources et reproductible pour réaliser une hyperthermie légère médiée par des nanotiges d’or dans les tumeurs solides. Cette technique, appelée thérapie hyperthermique ciblée (THT) médiée par le GNR, résout les principales limites des approches d’hyperthermie conventionnelles en combinant l’injection intra-tumorale directe de GNR avec l’activation externe de la lumière NIR. Cela garantit une concentration locale élevée de nanoparticules, améliorant la reproductibilité et la sécurité, en particulier pour les tumeurs petites ou mal vascularisées qui peuvent ne pas accumuler efficacement les agents délivrés par voie systémique. De plus, l’utilisation d’une injection intratumorale directe de GNR suivie d’une exposition à la lumière proche infrarouge (NIR) garantit un chauffage précis, contrôlé et localisé des tumeurs, tout en minimisant l’exposition systémique, la toxicité et les effets hors cible associés aux techniques d’hyperthermie régionale conventionnelles.

De nombreux cancers présentent des mécanismes complexes et divers d’échappement immunitaire, leur permettant de résister à l’immunothérapie par divers moyens, le plus évident étant une mauvaise infiltration des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral ^2,4,5. L’hyperthermie légère offre une solution synergique lorsqu’elle est utilisée en combinaison avec des immunothérapies. En plus des effets cytotoxiques directs, l’hyperthermie légère induit préférentiellement la mort cellulaire immunogène (CIM), entraînant la libération d’antigènes associés à la tumeur (TAA) et de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP)^1,2. Ces signaux activent les voies immunitaires innées, améliorent la présentation de l’antigène tumoral, favorisent la maturation des cellules dendritiques et améliorent l’amorçage des cellules T, augmentant finalement l’infiltration des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral ^1,6,12. Dans nos propres modèles précliniques, cette technique THT médiée par GNR a fonctionné pour activer les réponses immunitaires locales et améliorer l’infiltration immunitaire tumorale¹³. Lorsqu’elle est associée à un traitement intratumoral à l’interleukine-2 (IL-2) ou à une inhibition systémique du point de contrôle anti-PD1, cette technique THT médiée par GNR augmente encore l’immunité antitumorale et surpasse la monothérapie seule dans les modèles de cancer du sein et de mélanome¹³. Ces résultats sont cohérents avec un nombre croissant de preuves soutenant la synergie entre l’hyperthermie médiée par les nanoparticules et l’immunothérapie dans les tumeurs solides, y compris le cancer du sein 14,15,16 et les tumeurs cérébrales ^17,18. En bref, en convertissant immunologiquement les tumeurs « froides » en tumeurs « chaudes », le THT médié par GNR peut améliorer la réponse aux immunothérapies, y compris les inhibiteurs de point de contrôle ^1,2,12.

Le protocole THT médié par GNR présenté ici est peu gourmand en ressources, techniquement simple et largement adaptable aux tumeurs sous-cutanées ou superficielles. Cette technique est particulièrement appropriée pour les chercheurs travaillant avec des modèles murins de tumeurs sous-cutanées ou superficielles, y compris le mélanome et le cancer du sein. Cependant, avec des modifications mineures, il peut être étendu à d’autres types de tumeurs et sites anatomiques. De plus, cette technique offre une plate-forme polyvalente pour intégrer l’hyperthermie contrôlée dans les études précliniques sur le cancer, en particulier celles qui étudient des stratégies d’amélioration de l’immunothérapie et cherchent à explorer l’hyperthermie légère pour améliorer la réponse au traitement ou surmonter la résistance aux traitements d’immunothérapie. De plus, les connaissances et l’équipement nécessaires à la mise en œuvre de cette technique sont accessibles et adaptables à une variété de contextes de soins de santé, ce qui renforce sa faisabilité dans une utilisation clinique plus large³.

Dans ce manuscrit, nous fournissons des instructions détaillées, étape par étape, pour mettre en œuvre notre protocole THT médié par GNR dans des modèles de souris utilisant un système laser NIR fonctionnant à 860 nm. Le succès de ce protocole dépend de l’activation efficace des nanotiges d’or par les tissus profonds en utilisant la longueur d’onde appropriée de la lumière proche infrarouge. Nous soulignons également les considérations procédurales pour obtenir un dosage hyperthermique léger cohérent, sûr et efficace dans des modèles de tumeurs murines, telles que la surveillance précise en temps réel de la température interne de la tumeur tout au long de la procédure. Cette méthode s’appuie sur et rassemble des aspects des approches d’hyperthermie à nanoparticules précédemment publiées, offrant une alternative complète, validée, très précise et reproductible pour la recherche préclinique sur le cancer. Dans l’ensemble, ce protocole offre une méthode biologiquement sûre, rentable et peu toxique pour administrer l’hyperthermie localisée dans la tumeur, avec un fort potentiel d’amélioration de l’efficacité des immunothérapies anticancéreuses existantes et d’élargissement de l’utilité clinique de l’hyperthermie en oncologie.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité universitaire sur les animaux de laboratoire de l’Université Dalhousie conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Toutes les lignes directrices internationales, nationales et institutionnelles applicables en matière de soins et d’utilisation des animaux ont été respectées. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Exigences relatives au laser et aux installations de traitement

1. Sécurisez l’accès à un système laser entièrement calibré capable de fournir de la lumière à une longueur d’onde de 860 ± 10 nm avec une intensité allant jusqu’à 4 000 mA. Assurez-vous que le système laser dispose de mécanismes d’arrêt appropriés.
   REMARQUE : Dans cette étude, nous avons utilisé un laser conçu sur mesure. Le modèle utilisé dans ce protocole dispose d’une clé d’activation laser, d’un bouton d’arrêt d’urgence et d’un cavalier de verrouillage (le cavalier connecté peut également être câblé à un interrupteur de sécurité utilisé pour la conformité de sécurité, par exemple, l’accès à une porte d’accès à une salle laser de classe 4).
2. Fixez une sonde de température insérable et calibrée pour la surveillance de la température intratumorale, capable de transmettre des données de température en direct via le logiciel d’enregistrement de thermocouple approprié.
3. Préparez une salle laser désignée qui répond aux normes de sécurité requises pour la classe laser. Assurez-vous qu’il y a une zone de travail dégagée, avec une bonne ventilation, un éclairage adéquat et toutes les surfaces réfléchissantes couvertes. Limitez l’accès à la pièce pendant le fonctionnement du laser pour éviter toute exposition involontaire. Assurez-vous que tout le personnel impliqué dans l’étude est entièrement formé au fonctionnement du laser et aux protocoles de sécurité et qu’il porte un EPI et une protection oculaire appropriés.
4. Établissez un espace de travail dans la salle laser qui peut accueillir un appareil d’anesthésie à proximité de l’installation laser. Assurez-vous que le laser est solidement monté, mais réglable, avec le sujet expérimental pouvant être positionné à environ 1 à 2 cm de la source du faisceau laser pour assurer un ciblage précis du site de la tumeur.
5. Utilisez une caméra thermique sur un trépied, positionnée pour capturer les relevés de température à partir de la surface du sujet, tout au long de l’exposition laser.

2. Culture cellulaire et inoculation (injection de cellules tumorales)

1. Sélectionnez des modèles de souris appropriés en fonction du type de tumeur d’intérêt, en suivant des techniques standardisées de préparation et d’entretien des cultures cellulaires en laboratoire. Pour suivre ce protocole, sélectionnez des souris femelles BALB/c âgées de 6 à 8 semaines pour l’inoculation de la tumeur CT26.
   REMARQUE : Des souris immunocompétentes ou immunodéprimées d’âges et de souches variés peuvent être utilisées, selon les exigences de l’étude.
2. Cultivez la lignée cellulaire cancéreuse CT26 dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 2 mM de glutamine. Maintenir les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂. Renouveler le milieu tous les 2-3 jours, et sous-cultiver les cellules à 70-80 % de confluence en utilisant un rapport de séparation de 1:4 à 1:10. Utilisez des cellules dans les premiers passages (p. ex., ≤10 passages) pour assurer une croissance constante et une efficacité d’inoculation. Élargir les cultures au besoin pour obtenir le nombre de cellules requis pour l’inoculation.
   REMARQUE : Le nombre de cellules nécessaires par souris variera en fonction du modèle, par exemple, pour le modèle de cancer colorectal murin CT26, nous avons besoin de 5 × 10⁵ cellules par souris.
3. Détachez les cellules adhérentes à l’aide de la trypsinisation et lavez-les 2 fois avec du PBS stérile 1 fois. Mettre en suspension dans une solution stérile 1x PBS pour atteindre la concentration souhaitée de 5 × 10⁶ cellules/mL. Conserver la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation stérile de 2 mL sur de la glace pendant un maximum de 1 h avant l’injection.
4. Avant l’injection, anesthésier les souris à l’aide d’une chambre d’induction contenant 4 % d’isoflurane vaporisé à un débit de 0,8 L/min. Une fois anesthésié, réduisez l’isoflurane à 2 % et maintenez l’anesthésie avec un cône nasal pendant la procédure d’inoculation. Confirmez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un test de pincement des orteils pour vous assurer de l’absence de réponse à la douleur. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement et minimiser les dommages potentiels causés par le laser.
5. Rasez le site d’injection (par exemple, le flanc gauche pour ce modèle hétérotopique CT26) à l’aide d’un rasoir électrique et nettoyez la zone avec une lingette imbibée d’alcool pour éliminer les débris et désinfecter la peau. Pincez la peau au point d’injection et injectez 100 μL de suspension cellulaire à 5 × 10⁶ cellules/mL par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 26 g et d’une seringue de 1 mL. Après l’injection, retirez la souris du cône nasal et remettez-la dans sa cage pour la récupérer sur une couverture chauffante pendant 1 h.

3. Croissance tumorale et mesure

1. Commencez les mesures quotidiennes de la tumeur, généralement à partir du 7e jour après l’injection, à l’aide d’un pied à coulisse de mesure de la tumeur. Mesurez les dimensions de la tumeur sur trois axes : largeur, longueur et hauteur et calculez les volumes tumoraux à l’aide d’une formule de volume tumoral ellipsoïde de π/6 × de longueur × de largeur × de hauteur.
2. Prévoir d’initier une THT médiée par GNR une fois que les tumeurs atteignent un volume approximatif de 50 mm³ (± 20 mm³).
   REMARQUE : Pour notre modèle CT26, ce volume tumoral a été atteint entre les jours 10 et 12 après l’injection de cellules tumorales).
3. Avant le traitement au laser, assurez-vous d’attribuer au hasard les souris dans les groupes de contrôle et de traitement. Le groupe de traitement recevra une injection intratumorale de GNR suivie d’une exposition au laser ; et le groupe témoin recevra une injection intratumorale de PBS (même volume que l’injection de GNR) au lieu de GNR, suivie d’une exposition au laser.

4. Conversion photothermique de la lumière proche infrarouge à l’aide de GNR intra-tumoraux

1. Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, utilisez une seringue de 0,3 à 1 ml avec une aiguille de 31 G pour prélever le volume approprié de GNR en fonction de chaque volume tumoral.
2. Anesthésier la souris de la même manière que pour l’injection de cellules cancéreuses (avec un cône nasal délivrant 2 % d’isoflurane à un débit de 0,8 L/min et confirmer la profondeur d’anesthésie adéquate à l’aide d’un test de pincement des orteils).
3. Une fois anesthésié, réduisez l’isoflurane à 2 % et placez la souris en position couchée sur la plate-forme laser tout en maintenant l’anesthésie à l’aide d’un cône nasal. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement et minimiser les dommages potentiels causés par le laser.
4. Rasez l’excès de fourrure autour de la tumeur, si nécessaire, pour assurer l’exposition de la surface de la peau au laser. Utilisez de l’éthanol pour désinfecter la surface de la tumeur, en essuyant toute fourrure/débris.
   REMARQUE : Dans cette étude, nous avons utilisé des GNR optimisés pour l’absorption à 860 nm. Si vous utilisez un produit GNR différent de celui suggéré ici, assurez-vous que la livraison de la longueur d’onde du laser NIR est optimisée en fonction du spectre d’absorption du GNR.
5. Avant l’exposition au laser, injecter des GNR par voie intratumorale à une concentration de 1 μg/^mm3 de volume tumoral. Si nécessaire, répartissez l’injection entre deux sites intratumoraux pour assurer une distribution efficace des GNR à l’intérieur de la tumeur.
   REMARQUE : Dans cette vidéo de protocole, des GNR à une concentration de 2 μg/μL ont été utilisés ; par conséquent, pour une tumeur de 50 mm³ , 25 μL de GNR ont été injectés dans la tumeur. Assurez-vous d’essuyer tout excès de GNR à la surface de la peau après les injections respectives.
6. Pour les souris du groupe témoin, administrer une injection intratumorale de PBS stérile du volume équivalent utilisé pour le(s) groupe(s) d’injection GNR (par exemple, injecter 25 μL de PBS dans le cas d’une tumeur de 50 mm³).
7. Désinfectez la sonde de température intratumorale avec de l’éthanol et insérez-la doucement au milieu de la masse tumorale.
8. Appliquez une couche uniforme de gel d’aloe vera d’environ 5 mm d’épaisseur sur la surface de la tumeur pour prévenir l’ulcération cutanée et minimiser le risque de blessure thermique pendant le traitement.
9. Assurez-vous que le laser est ajusté pour s’aligner directement au-dessus du milieu de la tumeur. Utilisez la table de recherche de l’irradiance (Tableau 1) pour déterminer la hauteur de laser appropriée en fonction du diamètre du faisceau laser requis pour couvrir la surface de la tumeur. Optimisez la hauteur du laser en fonction du diamètre de la tumeur pour assurer une distribution d’énergie constante.
   REMARQUE : Dans notre expérience, une tumeur d’un diamètre de 1,3 cm nécessitait une hauteur laser de 1,5 cm).
10. Allumez la source de refroidissement laser et thermos électrique (TEC), puis branchez le système laser sur la source d’alimentation (adapté selon le protocole du fabricant). Allumez la source de refroidissement thermos électrique ; attendez que la LED bleue s’allume et que la température de la source TEC du laser se stabilise à 25 °C après 30 s.
11. À l’aide de la table de recherche de l’irradiance (Tableau 1), vous obtiendrez un irradiance cible de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² en ajustant la sortie de courant du laser (tournez le bouton de la source laser jusqu’au point de consigne de courant souhaité).
    REMARQUE : Dans notre expérience, une hauteur de laser de 1,5 cm, un diamètre de faisceau de 1,3 cm et un courant laser de 1 800 mA ont donné une valeur d’irradiance de 0,82 W/cm², qui a été optimisée pour ce modèle de tumeur.
    À partir de ce moment, assurez-vous que toutes les personnes présentes dans la salle d’opération laser portent des lunettes de sécurité laser certifiées pour la longueur d’onde de la lumière utilisée.
12. Installez la caméra thermique adjacente à la plate-forme laser, dirigée vers la souris, pour surveiller la température de surface de la peau pendant la procédure laser.
13. Sur le logiciel d’enregistrement du thermocouple, créez un nouveau fichier et cliquez sur le bouton d’enregistrement . Assurez-vous que le graphique de la température de la tumeur interne en fonction du temps est affiché en temps réel.
14. Tournez la clé de sécurité pour activer la sortie de la source laser. Commencez l’administration du laser en appuyant sur la pédale.
    REMARQUE : Dans ce protocole, un contrôleur Raspberry Pi est l’interface interne entre la pédale et la source laser.
15. Vérifiez et assurez-vous que le logiciel informatique détecte une augmentation de la température tumorale une fois que la tumeur injectée par GNR est exposée au faisceau laser.
    REMARQUE : La température interne de la tumeur commencera à augmenter au moment du démarrage du laser, prenant environ 15 s à 2 min pour entrer dans la plage d’hyperthermie cible de 42 °C, selon la taille et le type de modèle de tumeur.
16. Maintenez la température interne de la tumeur à une plage hyperthermique (entre 42 °C et 48 °C) pendant 5 minutes complètes. Surveillez en permanence la température interne de la tumeur et, si elle approche de 48 °C, retirez le pied de la pédale et laissez la température redescendre. Recherchez cette baisse de température en temps réel sur le graphique d’affichage de la température en fonction du temps. Une fois que la température interne de la tumeur est tombée à ~43 °C, réactivez l’administration du laser en appuyant à nouveau sur la pédale. Continuez ce modèle de cycle de pédale laser marche/arrêt pour maintenir la température de la tumeur interne dans la plage hyperthermique appropriée pendant 5 minutes complètes, et surveillez le graphique d’affichage de la température en fonction du temps.
    1. Si la température de la tumeur descend en dessous de 42 °C à tout moment pendant la période d’hyperthermie de 5 minutes, augmentez le temps d’hyperthermie pour rattraper le temps perdu. Par exemple, si la température descend en dessous de 42 °C pendant 20 s, ajoutez 20 s à la fin de la durée initiale de 5 minutes. Certaines tumeurs injectées avec des GNR peuvent ne pas atteindre 48 °C, et le cycle marche/arrêt du laser ne sera pas nécessaire.
       REMARQUE : Chez les souris témoins injectées par voie intratumorale avec PBS, les tumeurs n’atteindront pas la plage hyperthermique. Si nécessaire, le cycle marche/arrêt du laser pour les souris témoins doit suivre le même schéma établi pour le groupe traité par GNR, malgré l’absence attendue de réponse hyperthermique.
17. Tout au long du maintien de l’hyperthermie tumorale, surveillez en permanence la température de surface de la peau pour vous assurer qu’elle reste inférieure à 50 °C. Quelle que soit la température interne de la tumeur, si la température de surface de la peau atteint 50 °C, éteignez le laser pour permettre le refroidissement. Si la température interne ne peut pas atteindre la plage hyperthermique souhaitée sans faire dépasser la température de la peau à 50 °C, réduisez la puissance du laser et/ou appliquez de l’aloe vera supplémentaire sur le site de la tumeur pour aider à dissiper la chaleur. Après 5 minutes dans la plage hyperthermique, relâchez la pédale pour arrêter l’administration du laser et laisser la température interne de la tumeur descendre à ~37 °C et désactiver la clé de sécurité du laser.
    REMARQUE : Il est important de minimiser les dommages cutanés qui pourraient entraîner une ulcération tumorale en maintenant la température de la peau en dessous de 50 °C¹⁹.
18. Surveillez la sonde de température tumorale interne, ce qui permet à la température tumorale de redescendre à environ 37 °C. Retirez délicatement la sonde de température de la tumeur et essuyez le gel d’aloe vera restant à la surface de la tumeur.
19. Retirez la souris de l’anesthésique du cône nasal et surveillez l’excitation de l’animal avant de la remettre dans la cage. Placez la cage partiellement sur un coussin chauffant à 37 °C pendant la période de récupération qui suit la procédure, permettant aux souris de se déplacer entre des zones plus chaudes et plus froides au besoin pour réguler leur température corporelle. Surveillez chaque souris pour assurer un retour à un comportement normal avant de les renvoyer dans leur logement.

Résultats

L’objectif de ce protocole THT médié par GNR est de chauffer les tumeurs solides de manière constante et fiable jusqu’à la plage hyperthermique légère souhaitée de 42 à 48 °C. Les principales étapes de cette procédure sont décrites à la figure 1. Le succès de ce protocole dépend de l’établissement et du maintien d’une hyperthermie légère contrôlée et reproductible au sein d’un modèle de tumeur solide donné. Les GNR utilisés ont été synthétisés à l’aide d’une méthode brevetée sans CTAB, dans laquelle le sel d’or a été réduit dans une solution de tensioactif exclusive pour favoriser la croissance cristalline en forme de bâtonnet. Après la synthèse, les tensioactifs natifs ont été largement remplacés par du PEG de faible poids moléculaire pour améliorer la biocompatibilité. Les GNR résultants étaient de taille uniforme (51,1 ± 10,8 nm sur 12,2 ± 1,9 nm), avaient une longueur d’onde d’excitation optimale de 860 ± 10 nm et étaient exempts d’endotoxines détectables.

Pour assurer un chauffage adéquat de la tumeur et un suivi précis de la température, une sonde de température intratumorale doit être insérée au centre de la tumeur. De plus, la surveillance de la température de surface de la peau tout au long de la procédure à l’aide d’une caméra thermique est cruciale. Il est possible, en particulier pour les tumeurs de plus petit volume, que les GNR injectés par voie intratumorale puissent se diffuser dans l’espace péritumoral et/ou sous-cutané autour de la tumeur. Lors de l’exposition à la lumière NIR, cela peut provoquer un réchauffement de la peau au-dessus des niveaux physiologiques de base, et si la peau atteint des températures supérieures à des niveaux hyperthermiques légers (supérieurs à 50 °C), cela pourrait entraîner des lésions cutanées telles que des croûtes et/ou des^{ulcérations 19}. L’application d’une couche de gel d’aloe vera à la surface de la tumeur est une étape de précaution importante pour aider à réguler la température de surface de la peau et prévenir les dommages thermiques lors de l’exposition au laser NIR. Dans tous les cas, il est recommandé de surveiller la zone traitée pour détecter des signes d’ulcération au cours des 48 heures suivant le THT. La figure 2 représente une représentation visuelle de la configuration suggérée pour optimiser la gestion de la température tumorale, montrant l’emplacement de la sonde de température tumorale interne et de la couche de gel d’aloe vera par rapport à la sonde laser NIR.

Le succès relatif de ce protocole expérimental peut être déterminé en observant la température interne de la tumeur en fonction du graphique temporel tout au long de l’opération laser. Pour les souris injectées par voie intratumorale avec des GNR, les tumeurs devraient se réchauffer dans la plage hyperthermique légère (42-48 °C) en 15 s à 2 min. Une fois que la température interne de la tumeur est entrée dans la plage hyperthermique légère, on s’attend à ce qu’elle se stabilise dans la plage appropriée ou nécessite un cycle marche/arrêt de l’administration du laser pour s’assurer que la température interne de la tumeur ne dépasse pas 48 °C (comme le montre la figure 3A). Le maintien réussi d’une hyperthermie légère pendant 5 minutes est considéré comme un résultat positif. Pour les souris injectées par voie intratumorale avec du PBS, les tumeurs ne devraient pas chauffer dans la plage hyperthermique. L’exposition à la lumière NIR à une longueur d’onde de 860 nm n’est pas suffisante à elle seule pour provoquer un réchauffement des tissus dans la gamme hyperthermique légère, et les tumeurs témoins devraient se stabiliser autour de 39-40 °C. La figure 3B montre un graphique de température tumorale interne en fonction du temps entre les souris GNR et les souris témoins (injectées de PBS) tout au long de la procédure de 5 minutes. Si une tumeur injectée par GNR n’est pas en mesure d’atteindre la plage hyperthermique lors de l’exposition à la lumière NIR ou ne peut pas être maintenue dans la plage hyperthermique appropriée pendant 5 minutes complètes, cela est considéré comme un résultat négatif.

Une analyse supplémentaire en aval pour déterminer le succès de ce protocole THT médié par GNR consiste à mesurer les changements de volume tumoral après la procédure. Le THT médié par GNR réalisé avec succès provoque la mort ciblée des cellules tumorales et l’activation des réponses immunitaires anticancéreuses, ce qui conduit à la régression tumorale et à la réduction du volume tumoral associée¹³. La figure 4 montre les changements de volume tumoral après THT médié par GNR pour deux modèles de cancer murin du flanc sous-cutané (mélanome B16 et modèle de cancer colorectal hétérotopique CT26) et un modèle de cancer murin du coussinet adipeux mammaire (cancer du sein 4T1). Dans chaque modèle, une réduction significative du volume tumoral par rapport aux témoins est évidente 48 à 72 heures après la procédure THT médiée par GNR. Le calendrier et l’ampleur de la réduction du volume tumoral après la procédure devraient varier en fonction de la souche de souris et du modèle de cancer. En plus de la réduction tumorale, nous avons observé une puissante réponse immunitaire innée dans les 48 heures suivant le THT médié par GNR, caractérisée par une expression accrue des gènes impliqués dans la voie STING-cGAS et la régulation et l’activation à la hausse des cellules dendritiques, des macrophages et des cellules NK dans les modèles B16F10 et 4T1¹³. Notamment, dans un modèle de tumeur bilatérale 4T1, le THT activé par GNR a induit une réponse immunitaire systémique, comme en témoigne l’infiltration accrue de lymphocytes T CD8⁺ dans les tumeurs controlatérales non traitées¹³. Ces résultats confirment le potentiel de cette approche à provoquer des effets anticancéreux cytotoxiques directs et immunomodulateurs plus larges.

Tableau 1 : Table de recherche de l’irradiance. Tableau fournissant les valeurs d’irradiance (W/cm²) pour différents réglages de courant laser (mA) et distances de travail (cm). La table est utilisée pour déterminer la hauteur de laser appropriée en fonction du diamètre de faisceau requis pour couvrir la surface de la tumeur et pour obtenir une irradiance cible de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm². Les valeurs surlignées en vert indiquent des niveaux d’irradiance optimaux proches de 1 W/cm². Cette table d’irradiance est spécifique au laser LDX et a été fournie par le fabricant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1 : Schéma graphique de la procédure THT médiée par GNR. Méthodologie de thérapie hyperthermique ciblée médiée par des nanotiges d’or pour les tumeurs sous-cutanées du flanc dans un modèle murin. Après l’établissement d’une tumeur palpable (environ 50 mm³) et l’anesthésie chez la souris, (1) injecter des GNR par voie intratumorale à une concentration de 1 μg/mm³, (2) insérer une sonde de température intra-tumorale au milieu de la masse tumorale, (3) appliquer une couche de ~5 mm de gel d’aloe vera sur la surface de la tumeur, (4) commencer l’administration d’un laser NIR et (5) maintenir la température interne de la tumeur dans une plage hyperthermique légère (42 °C-48 °C) pendant 5 min. Abréviations : GNR = nanotige d’or ; THT = thérapie hyperthermique ciblée ; NIR = proche infrarouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Représentation visuelle du dispositif expérimental. Une souris BALB/c portant une tumeur colorectale hétérotopique avec une sonde de température intra-tumorale insérée au centre et une couche topique de gel d’aloe vera appliquée directement sous l’exposition à un faisceau laser proche infrarouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Graphiques de température interne en temps réel. Profil(s) représentatif(s) de température tumorale interne au fil du temps (en ms) enregistré par la sonde de température interne tout au long de l’exposition de la tumeur au laser NIR. (A) Modèle de cycle laser NIR marche/arrêt chez une souris injectée de GNR nécessaire pour maintenir la température tumorale interne dans une plage hyperthermique légère (42 °C-48 °C) pendant 5 min. Cela souligne l’importance d’une surveillance étroite de la température interne de la tumeur et du cycle d’administration du laser pour maintenir la plage hypothermique tout au long de la procédure. (B) Différence moyenne de température tumorale interne entre les souris injectées de GNR (n = 15) et les souris témoins (injectées de PBS) (n = 8) tout au long d’une exposition au laser NIR de 5 minutes. Les tumeurs des souris injectées de PBS ne sont pas chauffées dans une plage d’hypothermie légère et plafonnent autour de 39-40 °C malgré la même durée d’exposition au laser NIR que le groupe injecté de GNR, dont les tumeurs atteignent des températures hyperthermiques de 42-48 °C. Abréviations : GNR = nanotige d’or ; NIR = proche infrarouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Graphiques de volume tumoral après THT médié par GNR. Le THT médié par GNR induit une réduction du volume tumoral dans plusieurs modèles de cancer murin dans les 48 à 72 heures suivant le traitement. (A) Mesures du volume tumoral dans un modèle 4T1 (cancer du sein) après THT médié par GNR (n = 24 PBS, n = 28 THT). (B) Mesures du volume tumoral dans le modèle B16-F10 (mélanome) après THT médié par GNR (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Mesures du volume tumoral dans le modèle CT26 (cancer colorectal) après THT médié par GNR (n = 9 PBS, n = 9 THT). Une réduction ou un ralentissement de la croissance du volume tumoral dans les 48 à 72 heures suivant le traitement est indicateure d’un résultat positif. Les données de volume tumoral pour le modèle CT26 à 24 h avant ne sont pas fusionnées - les valeurs sont similaires et se chevauchent. Les barres d’erreur représentent le MEB. * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Étapes critiques du protocole
La conception et la mise en œuvre de cette technique THT médiée par GNR offrent la possibilité de réaliser un chauffage ciblé, précis, peu gourmand en ressources et reproductible de tumeurs solides in vivo. L’un des principaux avantages de ce système réside dans sa précision spatiale et son contrôle thermique, ce qui permet un traitement localisé sans endommager les tissus environnants. Une étape essentielle pour une conversion photothermique réussie consiste à assurer la compatibilité entre les GNR utilisés et la source lumineuse NIR. Dans cette étude, nous avons utilisé des GNR optimisés pour l’absorption à 860 nm. À cette longueur d’onde, la lumière pénètre efficacement dans les tissus et la chaleur est générée de manière sélective dans les tumeurs contenant du GNR, tandis que les tissus sains environnants restent proches de la température physiologique^{de 20}. De plus, lors de l’exécution de ce protocole, une surveillance précise en temps réel de la température interne de la tumeur est cruciale pour confirmer qu’une plage hyperthermique légère est atteinte et que le traitement est administré de manière cohérente. La mise en place d’une sonde de température intratumorale, comme le montre la figure 2, permet de surveiller en temps réel la dose thermique de la tumeur, comme le montre la figure 3B.

Dépannage de la technique
En fonction du modèle in vivo et du type de tumeur, de légères modifications du protocole peuvent être nécessaires pour optimiser les résultats. Par exemple, dans les modèles murins de mélanome, de cancer colorectal et de cancer du sein référencés dans la figure 4, nous avons optimisé la concentration de volume GNR/tumeur à 1 μg/mm³. Nous avons également optimisé l’efficacité de ce protocole en effectuant une exposition au laser NIR directement après l’injection de GNR, car aucune différence d’efficacité du traitement n’a été observée en comparant cette injection et le moment du traitement à des intervalles plus longs de 0,5, 1, 4, 18 ou 24 h. Pour les modèles tumoraux qui diffèrent de notre (nos) modèle(s) en termes de physiopathologie tumorale ou de localisation corporelle, une concentration GNR différente, injectée à un moment différent, peut être optimale pour atteindre et/ou rester dans la plage hyperthermique. Suite à cette procédure, des mesures quotidiennes du volume tumoral doivent être effectuées pour enregistrer les changements de volume tumoral. La régression tumorale dans les 2 à 3 jours est un indicateur positif du succès du traitement.

En raison de la nature du protocole laser, les brûlures et les ulcérations superficielles de la peau sont un facteur de risque potentiel, en particulier chez les peaux pigmentées ou sensibles. Des ajustements de la sortie de courant laser peuvent être nécessaires pour maintenir un équilibre approprié entre la surface de la peau et la température interne de la tumeur, selon le modèle in vivo utilisé. Par exemple, nous avons constaté qu’en raison des différences de teneur en eau et de pigment de mélanine dans la peau²¹, les souris C57Bl/6 nécessitent une administration de laser NIR à un courant plus faible par rapport aux souris BALB/c, pour maintenir la température de la peau en dessous de 50°C. Lors de la modification de la sortie de courant laser, assurez-vous que la hauteur du laser est ajustée en conséquence pour maintenir une irradiance cible de 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² tout en couvrant la majeure partie de la surface tumorale avec le diamètre du faisceau laser. Alternativement, l’application de gel d’aloe vera supplémentaire peut aider à abaisser la température de la peau pendant la procédure sans affecter considérablement la température interne de la tumeur. Il est important de maintenir une température de surface cutanée appropriée grâce aux modifications nécessaires pour minimiser le risque d’ulcération, qui a été observé comme un effet secondaire potentiel de ce traitement. Lorsque vous apportez des modifications à la couche de gel d’aloe vera, assurez-vous d’arrêter momentanément l’administration du faisceau laser NIR. Dans les jours qui suivent le protocole laser, assurez-vous que les souris sont surveillées de près pour détecter des brûlures et/ou des ulcérations potentielles.

Limites du THT médié par GNR
Un problème de sécurité majeur qui doit être pris en compte lors de l’exécution de cette procédure est l’utilisation de lunettes de sécurité laser certifiées pour la longueur d’onde de la lumière utilisée pendant le fonctionnement du laser. Le système laser doit inclure des fonctions de sécurité intégrées, telles qu’un verrouillage à clé, pour éviter toute activation accidentelle. Cependant, un équipement de protection individuelle supplémentaire, en particulier des lunettes de sécurité laser appropriées, est nécessaire pour protéger contre l’exposition potentielle aux faisceaux réfléchis ou diffusés. L’œil est le plus vulnérable aux lésions causées par un faisceau laser, les brûlures de la rétine étant une préoccupation majeure avec les lasers NIR²². Enfin, tout le personnel qui utilise le laser doit avoir reçu une formation appropriée.

Ce protocole a opté pour l’injection intratumorale de GNR plutôt qu’une injection systémique afin de minimiser la toxicité du système, de limiter la distribution de nanoparticules dans les organes hors cible tels que le foie, la rate et les reins, et d’améliorer la précision, l’efficacité et le profil d’innocuité du traitement hyperthermique. Cependant, étant donné que ce protocole nécessite des injections intratumorales de GNR, sa capacité à induire une hyperthermie peut être limitée dans certains modèles tumoraux. Jusqu’à présent, nous avons prouvé l’efficacité de cette méthode dans les tumeurs du coussinet adipeux sous-cutané et mammaire, qui résident toutes deux près de la surface de la peau et sont facilement accessibles en termes d’injection de GNR et d’exposition à la lumière NIR. Des difficultés logistiques peuvent survenir lors du ciblage des tumeurs qui résident à l’intérieur des cavités corporelles, telles que le péritoine, ou lors de la tentative de cibler les sites métastatiques d’une tumeur primaire. Une modification potentielle de ce protocole pourrait impliquer une injection systémique de GNR, à condition que les nanoparticules soient modifiées pour assurer une accumulation efficace dans les sites tumoraux avant l’exposition au NIR²³. De plus, il est possible que l’injection intratumorale de GNR puisse entraîner une distribution inégale des nanoparticules dans la tumeur, affectant l’uniformité du chauffage. Cependant, l’échauffement non uniforme de la tumeur ne devrait pas avoir un impact important sur le degré d’efficacité du traitement, étant donné que le résultat principal de ce protocole THT médié par GNR est l’induction d’un ICD pour activer l’immunité anticancéreuse. Enfin, la lecture de la température intratumorale dépend de l’emplacement de la sonde de température dans la tumeur. Le milieu de la tumeur est l’emplacement le plus optimal pour que la sonde reflète avec précision la température moyenne globale de la tumeur. Cependant, s’il est difficile d’assurer et/ou de confirmer l’insertion d’une sonde centrale en raison de la taille et/ou de la forme de la tumeur, il peut être nécessaire d’enregistrer à l’aide de deux ou plusieurs sondes de température à différents endroits.

Importance par rapport aux méthodes existantes
Ce manuscrit fournit un protocole complet, optimisé et reproductible pour le THT médié par GNR dans les tumeurs solides et superficiellement accessibles. Par rapport à d’autres méthodes d’induction de l’hyperthermie, cette technique offre des avantages distincts, à savoir qu’elle nécessite peu de ressources, qu’elle est spatialement précise et qu’elle est associée à une toxicité systémique minimale. Bien que l’utilisation des GNR pour la thérapie photothermique soit bien documentée, il reste une variabilité importante dans la littérature dans la façon dont ces protocoles sont mis en œuvre. Les éléments clés de la procédure tels que la durée de l’irradiation NIR, le choix des outils de surveillance thermique (sondes thermocouples ou caméra thermique), la préparation de la solution GNR et les méthodes d’injection GNR varient souvent d’une étude à l’autre.

Par exemple, d’autres méthodes nécessitaient une exposition plus longue (20 min)²⁴ ou plusieurs doses (4 x 15 min)²⁵ d’exposition au proche infrarouge pour obtenir des résultats similaires aux nôtres. De plus, la plupart des protocoles utilisent soit des sondes thermocouples, soit des caméras thermiques, mais combinent rarement les deux outils^26,27. De plus, les solutions GNR sont souvent préparées avec CTAB 28,29,30, et leur méthode d’administration varie entre les injections systémiques ^24,30 et les injections intra-tumorales³¹, ce qui peut avoir un impact sur leur dispersion/localisation dans le TME. En tant que tel, une méthode complète et adaptable pour le THT médié par GNR qui optimise et améliore les protocoles actuels n’a pas encore été établie.

Notre protocole comble ces lacunes en intégrant les composants les plus efficaces et les plus reproductibles de la littérature dans une approche unique et standardisée. Plus précisément, nous utilisons une double surveillance thermique (thermocouple et caméra thermique) pour assurer une distribution de chaleur précise et sûre ; nous utilisons l’injection intra-tumorale de GNR sans CTAB pour maximiser la localisation tumorale et minimiser la toxicité ; Et nous incorporons l’utilisation de gel d’aloe vera pour protéger contre les brûlures superficielles de la peau. De plus, les GNR utilisés dans ce protocole sont optimisés pour une conversion photothermique efficace à 860 nm NIR, ce qui permet d’atteindre rapidement des températures hyperthermiques douces en quelques secondes. Une fois cette plage de température atteinte, elle peut être maintenue de manière stable pendant la durée du traitement de 5 minutes, ce que nous avons déterminé comme suffisant pour induire la mort cellulaire immunogène et l’activation immunitaire. La longueur d’onde NIR de 860 nm elle-même offre également un équilibre favorable entre la profondeur de pénétration tissulaire et la sécurité, améliorant encore la fenêtre thérapeutique de cette méthode.

En résumé, notre protocole offre une alternative consolidée, validée et biologiquement efficace aux approches existantes d’hyperthermie médiée par GNR, et comble une lacune critique dans le domaine en fournissant une méthode entièrement détaillée et adaptable adaptée à la recherche préclinique sur le cancer et au développement de thérapies combinées.

Applications futures de la technique
Enfin, bien que ce protocole puisse être facilement combiné avec divers traitements anticancéreux, il est particulièrement bien adapté pour améliorer l’efficacité des immunothérapies, compte tenu de la capacité inhérente du THT à stimuler l’immunité anticancéreuse. En induisant la mort cellulaire immunogène, en favorisant la libération d’antigènes spécifiques de la tumeur et en augmentant le nombre de cellules immunitaires innées recrutées dans le TME dans les 48 heures suivant le traitement, le THT médié par GNR aide à « resensibiliser » les tumeurs immunologiquement froides à la détection et à l’attaque du système immunitaire¹³. Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour améliorer l’efficacité des immunothérapies dans le traitement des cancers qui peuvent avoir précédemment développé une résistance, offrant ainsi une stratégie potentielle pour surmonter les obstacles au traitement du cancer et la progression de la maladie¹³.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % de trypsine  ;	Thermo Fisher Scientific	25200-056
10 ml de stripette	Fisher Scientific	7200574
Tube Falcon de 15 mL	Corning	352095
Seringue de 1 mL	BD Biosciences	3331431
Aiguille de 28 g	BD Biosciences	1298811
Lignée cellulaire du cancer du sein 4T1	Collection de la culture de type américain	CRL-2539
5 ml de stripette	Fisher Scientific	7200573
Tube Falcon de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
70 % d’éthanol	Alcools commerciaux	36195
Gel d’aloe vera	Marque Life	57800985495
Lignée cellulaire de mélanome B16-F10	Collection de la culture de type américain	CRL-6475
Bio-rendu	BioRendu	N/A
Armoire de sécurité	Nuaire	N/A
Lunettes de sécurité laser de classe 4	par vision laser	F22. Réf. P5P18.5000	Nous avons utilisé un cadre P22 avec un filtre P5P18
Incubateur CO2 (37 ° ; C, 5 % de CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 et micro ; L Pipette en rack à ajustement universel  ; Conseils	Corning	4865
Pipette filtrée Corning  ; Pointes, 30 & micro ; L	Fisher Scientific	07-200-265
Lignée cellulaire colorectale murine CT26	Collection de la culture de type américain	CRL-2638
Le	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Tubes Eppendorf	Thermo Fisher Scientific	3451
Souris femelles BALB/c	Laboratoires Charles River (Montréal, Canada)	028
Femelle C57Bl/6	Laboratoires Charles River (Montréal, Canada)	027
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher scientific invitrogen	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Sonde de température intra-tumorale	OMÉGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Sonde thermocouple modèle HYP-1
IsoTip 1000 et micro ; L Pipette filtrée universelle  ; Conseils	Corning	4809
Laser LDX (modèle : LDX- 3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Courant laser avec point de consigne maximum à 4600 mA
Optixcare Lubrifiant pour les yeux	Aventix	N/A
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140148
Prisme 10.6.0	Bloc-notes	N/A
RPMI 1640 Moyen	Thermo Fisher Scientific	11875119
TC-08 Logiciel d’enregistrement de données de thermocouple  ;	Technologie Pico	PicoLog V5.25.3
Caméra thermique  ;	HIKmicro	EA-1086922
Boîte de culture tissulaire 100 x 20 mm	Fisher Scientific	877222
Trypan Blue Solution 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061
Pied à coulisse de mesure de tumeur.	Giles scientificSociété Mitutoyo	500-321