Article de méthode

Progrès dans le profilage métabolique des sphéroïdes de tumeurs cérébrales tridimensionnelles pour le criblage de médicaments

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DOI :

10.3791/68833

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5 septembre 2025

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1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous établissons une plateforme de profilage métabolique intégrant des sphéroïdes de gliome tridimensionnels (3D) et une normalisation basée sur l’imagerie via l’analyse des flux extracellulaires. Cette approche permet une évaluation plus précise des réponses métaboliques tumorales aux traitements médicamenteux et donne un aperçu des mécanismes potentiels de résistance.

Résumé

Les tumeurs cérébrales, en particulier les gliomes, sont difficiles à traiter en raison de leur nature agressive, de leur microenvironnement tumoral complexe et de leur résistance aux thérapies conventionnelles. Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles ne parviennent souvent pas à reproduire l’environnement tumoral réel, ce qui conduit à des prédictions inexactes de l’efficacité des médicaments. La technologie d’analyse des flux extracellulaires, généralement utilisée pour l’analyse métabolique en temps réel dans les cultures 2D, mesure des paramètres métaboliques clés, tels que le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR), fournissant des informations sur le métabolisme cellulaire. L’utilisation de modèles 3D représente une avancée significative, car ils imitent plus précisément l’environnement tumoral in vivo . L’analyseur de flux extracellulaire a été adapté à des modèles tridimensionnels (3D) de cellules de gliome, permettant l’analyse des voies métaboliques critiques, y compris la glycolyse et la phosphorylation oxydative, dans un contexte plus pertinent sur le plan physiologique.

Les cellules U87 ont été ensemencées à des densités appropriées dans une plaque à faible fixation de 96 puits et cultivées pendant 5 jours. Le jour 5, la formation de sphéroïdes 3D a été observée via l’imagerie à haut contenu. Les sphéroïdes formés avec succès ont ensuite été transférés sur une plaque de dosage métabolique recouverte de poly-L-lysine pour une analyse métabolique. Pour améliorer la précision de ces mesures, des systèmes d’imagerie à haut contenu évaluent la taille des cellules 3D, ce qui permet une normalisation précise des données de flux extracellulaires et minimise les variations métaboliques dues aux différences de taille des cellules. Cette approche intégrée fournit une analyse plus fiable des réponses métaboliques des cellules de gliome aux traitements médicamenteux, révélant les mécanismes potentiels de résistance aux médicaments. En fin de compte, cette méthodologie offre des informations précieuses sur la dynamique métabolique des gliomes et soutient le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques cliniquement pertinentes.

Introduction

Les gliomes, une forme répandue et agressive de tumeur cérébrale, posent des défis cliniques importants en raison de leur progression rapide, de leur microenvironnement tumoral très hétérogène et de leur résistance marquée aux thérapies conventionnelles1. Ces complexités nécessitent des modèles expérimentaux plus pertinents sur le plan physiologique pour améliorer la précision des évaluations thérapeutiques. Les systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) traditionnels ne parviennent pas à récapituler l’architecture tumorale in vivo et les interactions cellule-cellule2, conduisant souvent à des conclusions trompeuses concernant l’efficacité des médicaments et la biologie tumorale3.

Pour remédier à ces limitations, les modèles tumoraux tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative supérieure, offrant une pertinence biologique accrue en imitant les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des tumeurs in vivo 4,5. Parallèlement, la reprogrammation métabolique est de plus en plus reconnue comme une caractéristique de la progression du gliome et de la résistance au traitement 6,7,8. L’analyse des flux extracellulaires est devenue une technique largement adoptée pour la mesure en temps réel de paramètres métaboliques clés, tels que le taux d’acidification extracellulaire (ECAR, mesurant l’efflux de protons principalement à partir de la production de lactate glycolytique) et le taux de consommation d’oxygène (OCR, quantifiant l’utilisation de l’oxygène mitochondrial dans la phosphorylation oxydative), fournissant des informations essentielles sur les voies de phosphorylation glycolytique et oxydative 9,10,11.

Dans cette étude, l’analyse des flux extracellulaires a été adaptée pour analyser en 3D les sphéroïdes de gliome, ce qui a permis d’étudier les voies métaboliques dans un contexte qui ressemble beaucoup aux conditions tumorales in vivo . Les cellules de gliome U87 ont été ensemencées à une densité de 1 500 cellules par puits dans des plaques transparentes à fond rond et à très faible fixation de 96 puits et cultivées pendant 5 jours à 37 °C avec 5 % de CO2 pour faciliter la formation de sphéroïdes. L’imagerie à haut contenu a été utilisée pour confirmer la morphologie des sphéroïdes et évaluer la taille des cellules. Avant l’analyse métabolique, des sphéroïdes cellulaires 3D denses et circulaires d’un diamètre d’environ 220 μm ont été transférés sur des plaques de test pré-recouvertes de poly-L-lysine pour assurer l’adhérence et la stabilité de la mesure. Il est important de noter que la normalisation des données métaboliques sur la base de la taille des sphéroïdes a été effectuée via l’imagerie intégrée à haut contenu, réduisant la variabilité et améliorant la fiabilité des données.

Cette plateforme intégrée, combinant la culture 3D, la technologie d’analyse des flux extracellulaires et la normalisation basée sur l’imagerie, permet une évaluation plus précise des réponses métaboliques du gliome aux interventions thérapeutiques. Cette étude fournit un cadre solide pour l’étude des fondements métaboliques de la résistance aux médicaments et contribue au développement de stratégies de traitement des gliomes plus efficaces et cliniquement traduisibles.

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Protocole

REMARQUE : Les spécifications complètes de tous les réactifs et consommables sont détaillées dans la table des matériaux.

1. Culture cellulaire 2D

  1. Maintenir les cellules U87 dans un milieu essentiel minimum (MEM) complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) dans des conditions stériles. Effectuez des procédures de passage standard une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence.
    REMARQUE : Tout au long du processus de culture, surveiller de près l’état des cellules et exclure des expériences ultérieures les cellules présentant une croissance anormale ou des changements morphologiques.
  2. Semez les cellules U87 dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm et incubez dans un incubateur de culture cellulaire stérile à 37 °C avec 5 % (v/v) de CO2 et 90-95 % d’humidité relative.
    REMARQUE : Le milieu doit être remplacé régulièrement pour maintenir des conditions de croissance optimales.

2. 3D formation de sphéroïdes cellulaires

  1. Préparation expérimentale
    1. Examinez l’ensemble du flux de travail de la figure 1 avant de commencer les procédures expérimentales.
      ATTENTION : Respectez strictement les techniques d’asepsie tout au long de l’expérience pour assurer la santé des cellules et prévenir la contamination.
  2. Dissociation et comptage des cellules
    1. Retirer le milieu usé de la boîte de culture cellulaire et laver les cellules U87 trois fois avec 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (3 mL par lavage). Jetez les réactifs usagés dans une solution d’eau de Javel à 20-25 % (v/v) pour inactiver toutes les matières bioactives.
    2. Ajouter 1 mL de solution de trypsine dans la boîte et incuber à 37 °C pendant 2-3 min. Neutralisez la trypsine avec 2 mL de DMEM contenant 10 % de FBS préchauffé à 37 °C une fois que toutes les cellules sont détachées sous observation microscopique.
    3. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 200 × g pendant 3 min. Jetez le surnageant et mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS. Pipetez doucement les cellules pour assurer une suspension cellulaire uniforme. Comptez ensuite à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre initial de cellules.
      REMARQUE : Manipulez les cellules avec douceur pendant le lavage et l’ajout de média pour éviter tout dommage mécanique. La force de pipetage peut être contrôlée pour éviter la formation de bulles, ce qui peut affecter la viabilité des cellules et la précision du comptage.
  3. Dilution en suspension cellulaire
    1. Préchauffer le produit inutilisé à 37 °C. Maintenez les suspensions cellulaires à température ambiante (RT ; 25 ± 2 °C) pendant 30 min.
    2. Sur la base du nombre initial de cellules, diluer la suspension cellulaire avec du DMEM contenant 10 % de FBS jusqu’à un volume final de 20 ml, ce qui permet d’obtenir environ 200 000 cellules.
      REMARQUE : Avant la dilution finale, pipetez doucement la suspension cellulaire pour éviter la sédimentation. Le milieu inutilisé a été maintenu à 37 °C et les suspensions cellulaires ont été incubées à RT. Si 96 puits de 1 500 cellules par puits ont été ensemencés, un volume total de 22 mL a été préparé pour tenir compte de l’excédent. La suspension cellulaire diluée a été transférée dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL et soigneusement mélangée.
  4. Ensemencement cellulaire dans des plaques de 96 puits à fixation ultra-faible
    1. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire finale à l’aide d’une pipette de 200 μL. Ajoutez lentement 200 μL de suspension (1 500 cellules/puits) à chaque puits d’une plaque transparente à fond rond à fixation ultra-basse de 96 puits le long du bord.
      REMARQUE : Pour plus d’efficacité, envisagez l’utilisation d’une pipette multicanaux.
    2. Jetez toute suspension restante une fois que tous les puits sont remplis pour éviter toute contamination.
  5. Centrifugation
    1. Fermez hermétiquement la plaque avec du parafilm pour éviter les fuites pendant la centrifugation. Centrifuger le mélange à 200 × g pendant 2 min pour granuler les cellules au fond de chaque puits.
    2. Retirez la plaque de la centrifugeuse, retirez délicatement le parafilm et placez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 .

3. Revêtement en poly-D-Lysine des plaques de dosage métabolique

REMARQUE : La microplaque de dosage métabolique est une microplaque spécialisée conçue pour l’adhésion des sphéroïdes cellulaires lors de l’analyse du flux extracellulaire.

  1. Préparez une solution d’enrobage en dissolvant 5 mg de poly-D-lysine dans 50 mL d’eau stérile. Mélanger.
  2. Ajouter 30 μL de la solution d’enrobage dans chaque puits de la plaque de dosage métabolique. Assurez-vous de l’absence de bulles en secouant ou en aspirant doucement l’excès de solution.
  3. Incuber la plaque et la couvrir pendant 20 min à RT. Aspirer la solution d’enrobage et laver les puits deux fois avec 200 μL d’eau stérile.
  4. Faites sécher la plaque à l’air libre pendant au moins 30 minutes, puis chauffez-la à 37 °C sans CO2 pendant 30 minutes pour stabiliser le revêtement.
  5. Ajouter 175 μL de milieu préchauffé dans chaque puits et maintenir la plaque à 37 °C dans un incubateur sans CO2 jusqu’à ce qu’elle soit prête pour le transfert de sphéroïdes cellulaires.

4. Suivi de la croissance des sphéroïdes

  1. Transférez les plaques sphéroïdes dans un système d’imagerie à haut contenu après 5 jours de culture.
  2. Paramètres d’imagerie de configuration : réglez la température à 37 °C et le COà 2 à 5 %, et ajustez le type de plaque, les canaux et la plage de mise au point.
  3. Acquérez des images sphéroïdes à l’aide d’un microscope confocal avec des objectifs 10x et d’un logiciel d’imagerie.
  4. Identifiez les puits contenant des sphéroïdes intacts (p. ex., figures 2A-C) et notez leur position pour le transfert. Exclure les puits avec des sphéroïdes irréguliers (p. ex., figure 2D).

5. Traitement sphéroïde

REMARQUE : Un traitement médicamenteux a été effectué sur des sphéroïdes 3D matures pour évaluer les réponses métaboliques.

  1. Affectation de groupes de sphéroïdes
    1. Attribuez les sphéroïdes intacts à deux groupes :
      Groupe témoin : 6 puits répétés
      Groupe de traitement : 6 puits répétés (traités au fénofibrate)
  2. Préparation de la solution médicamenteuse
    1. Préparer la solution de travail du fénofibrate dans un milieu frais préchauffé à la concentration optimale (p. ex., 100 μM).
      REMARQUE : Les groupes de traitement ont été reconstitués dans du DMSO à 100 % pour créer des solutions mères, qui ont ensuite été diluées dans un milieu frais préchauffé. Les groupes témoins ont reçu la même concentration finale de DMSO (0,1 % v/v) que celle présente dans les échantillons traités par le médicament. La concentration finale a été déterminée à l’aide d’essais dose-réponse.
  3. Remplacement moyen
    1. Aspirez lentement 100 μL de fluide de chaque puits le long de la paroi.
      REMARQUE : Évitez de toucher le fond du puits pour éviter toute perturbation sphéroïde.
    2. Ajouter 100 μL de milieu frais dans les puits témoins.
    3. Ajouter 100 μL de solution de travail de fénofibrate dans les puits de traitement.
  4. Incubation post-traitement
    1. Remettez délicatement la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 . Culture pendant 72 h.
  5. Évaluation morphologique
    1. Évaluez l’intégrité des sphéroïdes à la suite de la procédure d’imagerie à l’étape 4.

6. Transfert de sphéroïdes cellulaires

  1. Retirez avec précaution la plaque de fixation basse contenant des sphéroïdes du système d’imagerie et placez-la sur une surface stérile à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique. Placez les plaques de dosage enrobées de poly-L-lysine l’une à côté de l’autre pour le transfert.
  2. Coupez l’extrémité d’une pipette de 20 μL pour faciliter l’aspiration douce des sphéroïdes cellulaires sans les endommager.
  3. Aspirez doucement chaque sphéroïde intact du fond du puits et transférez-le dans le puits correspondant de la plaque cellulaire, en le laissant se stabiliser pendant 20 s. Confirmer l’adhésion par l’absence de fragments flottants sous 10× microscopie.
  4. Répétez l’opération pour tous les sphéroïdes et vérifiez l’efficacité du transfert via le système d’imagerie décrit à l’étape 4.

7. Dosage métabolique

  1. Dégazage d’échantillons
    1. Placez la plaque de dosage sphéroïde traitée par le médicament dans une chambre d’hydratation prééquilibrée à 37 °C dépourvue de CO2.
      REMARQUE : Un dégazage continu a été effectué pendant 1 h avec un contrôle environnemental strict pour assurer la précision de la mesure métabolique.
  2. Préparation du réactif et administration du médicament
    1. En parallèle, préparez le réactif et chargez le médicament pendant la période de dégazage de 1 h.
      REMARQUE : L’objectif principal de cette expérience est d’évaluer le stress mitochondrial ; Toutes les procédures doivent être méticuleusement alignées sur cet objectif. Des protocoles spécifiques doivent être suivis pour des types d’expériences distincts afin de garantir l’exactitude et la fiabilité des données.
    2. Préparation médicamenteuse : Utilisez les composés suivants :
      Oligomycine (inhibiteur du complexe mitochondrial V)
      Cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP, découpleur)
      Un mélange de roténone (un inhibiteur du complexe I) et d’antimycine A (un inhibiteur du complexe III)
      REMARQUE : Les médicaments ont été obtenus à partir du kit de test de stress mitochondrial utilisé dans cette étude. Certains composés sont biologiquement dangereux ; Des protocoles stricts en matière de biosécurité (équipement de protection individuelle et préparation aux situations d’urgence) doivent être utilisés.
    3. Formulation du médicament
      1. Préparez les solutions mères des médicaments en poudre comme indiqué dans le tableau 1.
      2. Diluer les solutions mères aux concentrations de travail spécifiées au tableau 2.
        REMARQUE : Les solutions sont tourbillonnées ou agitées à fond pour assurer l’homogénéité sur tous les gradients de concentration.
  3. Chargement de composés dans des cartouches de sonde de détection
    REMARQUE : La cartouche de sonde de détection est une cartouche jetable contenant des sondes de biocapteur pour la mesure en temps réel de l’oxygène et du pH.
    1. Activation de la cartouche de sonde (doit précéder la charge du composé) :
      REMARQUE : Assurez-vous de l’activation du capteur en effectuant ces étapes au moins 12 h avant l’utilisation :
      1. Ajouter 200 μL de la solution d’étalonnage dans chaque puits de la plaque d’hydratation.
      2. Positionnez soigneusement la cartouche de la sonde de détection sur la plaque d’hydratation, en assurant une immersion complète de toutes les sondes dans la solution de calibrant.
      3. Incuber l’unité assemblée dans un incubateur sans CO2 à 37 °C pendant 12 à 24 h pour activer les capteurs.
        REMARQUE : Une immersion incomplète ou une hydratation insuffisante entraîne une dérive de mesure (±15 % d’erreur OCR).
    2. Utilisez des pipettes multicanaux ou électroniques pour administrer des volumes précis dans les puits, en évitant les gouttelettes résiduelles sur les bords des puits.
      REMARQUE : Comme la stimulation aiguë du médicament n’est pas nécessaire, suivez les séquences de charge standard.
    3. Placez la plaque de sonde sur une surface stable après le chargement pour éviter les perturbations pendant le transport.
      REMARQUE : La précision du chargement a un impact significatif sur les résultats.
  4. Configuration logicielle
    1. Lancez le logiciel et sélectionnez le protocole de test de stress mitochondrial.
    2. Attribuez des groupes en fonction du regroupement expérimental prédéfini.
    3. Définissez le nom du fichier et cliquez sur Démarrer l’exécution.
  5. Calibrage des cartouches de sonde de détection.
    1. Insérez doucement la plaque de sonde chargée dans la fente de l’instrument à l’invite du système.
    2. Lancez l’étalonnage (15-20 min). Maintenir des conditions stables ; Évitez les vibrations.
    3. Retirez rapidement la plaque d’hydratation après l’étalonnage (en suivant les instructions à l’écran).
      REMARQUE : Retirez le couvercle de la plaque avant l’étalonnage.
  6. Profilage métabolique des sphéroïdes 3D
    1. Transférez la plaque de dosage des sphéroïdes 3D dégazés dans la fente de mesure de l’instrument. Assurez-vous d’un alignement précis avec le réseau de sondes en confirmant ce qui suit : (i) Guides de fente d’angle de plaque ; (ii) le puits A1 s’aligne avec la position indexée ; (iii) Aucun espace visible entre la plaque et la surface de l’instrument
    2. Cliquez sur Démarrer pour lancer les tests de stress mitochondrial (durée : ~1,5 h). Surveillez les paramètres de l’instrument tout au long de l’appareil.
      REMARQUE : Retirez les couvercles des plaques de test sphéroïdes 3D avant la mesure.
  7. Analyse des données
    1. Analyse d’imagerie
      1. Transférez des plaques de dosage de sphéroïdes 3D vers un système d’imagerie à haut contenu.
        REMARQUE : les images ont été acquises comme décrit à l’étape 4. L’imagerie a révélé que la majorité des sphéroïdes sont restés intacts, tandis qu’une minorité a subi des dommages pendant le processus de transfert, comme le montre la figure 3.
      2. Analysez les données morphologiques (p. ex., surface, longueur, largeur) des sphéroïdes cellulaires à l’aide de la version 5.2 du logiciel Harmony, en suivant les étapes 7.7.1.3 à 7.7.1.7.
      3. Appliquez grossièrement le module Région de texture pour séparer les sphéroïdes 3D de l’arrière-plan en divisant le contenu de l’image en trois groupes sur la base des caractéristiques de texture des objets dans les images.
      4. Appliquez le module Rechercher une région d’image pour affiner la séparation des sphéroïdes 3D pré-isolés via des caractéristiques de taille basées sur le volume afin d’éliminer les impuretés et de conserver les sphéroïdes intacts.
      5. Mesurez les paramètres morphologiques des sphéroïdes 3D via le module Propriétés morphologiques .
      6. Appliquez le module Sélectionner la population pour filtrer les sphéroïdes de cellules 3D authentiques.
      7. Exporter les résultats des données morphologiques, comme indiqué dans le tableau 3.
    2. Traitement des données
      REMARQUE : Normalisez les données de la cellule à l’aide des paramètres des sorties d’imagerie afin de minimiser les artefacts expérimentaux.
      1. Ouvrez les données métaboliques brutes via le logiciel d’analyse.
      2. Sélectionnez l’option de normalisation pour accéder à l’interface d’édition du mode de normalisation.
      3. Entrez la section transversale des sphéroïdes contenus dans chaque puits correspondant de la plaque de test dans le champ Valeurs de normalisation .
      4. Définissez le paramètre de facteur d’échelle sur 1 000 000.
      5. Cliquez sur le bouton Appliquer pour finaliser le processus de normalisation. Les résultats finaux sont présentés à la figure 4.

8. Élimination des déchets

  1. Éliminer tous les déchets expérimentaux (milieux, réactifs, consommables et suspensions cellulaires) conformément aux protocoles de gestion des déchets biologiques et des déchets de laboratoire. Autoclavez ou désinfectez chimiquement les déchets bioactifs avant de les éliminer pour éviter la contamination de l’environnement.

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Résultats

Les trois étapes les plus critiques du processus de détection du métabolisme énergétique des sphéroïdes cellulaires 3D sont la culture des sphéroïdes cellulaires 3D, le processus de transfert de sphéroïdes et l’imagerie et la quantification des sphéroïdes après détection (Figure 1). De plus, l’observation de l’état des sphéroïdes cellulaires est très importante. Lorsque les expériences ont été menées selon les procédures expérimentales mentionnées ci-dessus, les sphéroïdes ont été détectés l...

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Discussion

L’adaptation de l’analyse des flux extracellulaires aux modèles 3D de gliomes représente une avancée méthodologique critique dans l’étude du métabolisme des cellules tumorales. Alors que les cultures 2D traditionnelles ont longtemps servi de base à l’expérimentation in vitro , elles ne parviennent pas à capturer l’architecture spatiale, les interactions cellule-cellule et cellule-matrice, ainsi que les gradients d’oxygène et de nutriments caractéristiques des tumeurs in vivo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, les subventions 82471329 et 82001248.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plat de 10 cmCorning430167
Tube à centrifuger de 15 mLCorning430791
Tube à centrifuger de 50 mLCorning430828
Calcein, AMInvitrogenRéf. C1430
Comtesse 3Thermo FisherCompteur automatique de cellules
Sérum fœtal bovinGibcoA5669701
Harmonie 5.2PerkinElmerLogiciel d’imagerie
Hoechst 33342SolarbioRéf. C0031
MEM EBSS MediumHyCloneSH30024.01
Opérette CLSPerkinElmerSystème d’analyse d’imagerie à haut contenu
PBSHyCloneSH30256.01
Poly-D Bromhydrate de lysineSigma  ;P7280
Plaques à fond rond à fixation ultra-basse à 96 puitsCorning4515
Logiciel de bureau Seahorse WaveAgilent
Hippocampe XFe96AgilentMachine d’essai métabolique extracorporel
Sorvall ST8RThermo FisherCentrifugeuse
TRYPSINE 0,25 % EDTAGibco25200072
Lignée cellulaire U87MGInfrastructure nationale des ressources cellulaires
Solution de glucose XF 1,0 M, 50 mLAgilent103577-100
XF 100 mM de solution de pyruvate, 50 mLAgilent103578-100
XF 200 mM Solution de glutamine, 50 mLAgilent103579-100
Solution d’étalonnage XF 500 mL  ;Agilent100840-000
XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100
Milieu DMEM XF, pH 7,4, 500 mLAgilent103575-100
Réseau de sondes de détection XFe96/XF Pro FluxpakAgilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Plaques de dosage métaboliquesAgilent103792-100

Références

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