Identification bioinformatique des biomarqueurs candidats associés à la parodontite dans les cellules souches du ligament parodontal traitées par cytokines

Résumé

L’étude actuelle vise à explorer des gènes dysrégulés via une analyse bioinformatique dans les cellules souches du ligament parodontal traitées par cytokines. ERC2-IT1 à la hausse et EPB41L4A-AS1 à la baisse ont été identifiés comme des molécules clés dans ces cellules, pouvant servir de biomarqueurs candidats potentiellement associés à la parodontite.

Résumé

L’objectif principal de la présente étude était d’étudier le mécanisme moléculaire potentiel sous-jacent aux cellules souches du ligament parodontal induit par les cytokines (PDLSC). Les données de microarrays issues de l’ensemble de données GSE260558 ont été extraites de la base de données omnibus d’expression génique (GEO). Après la normalisation, les gènes dérégulés ont été identifiés. Ensuite, les différents ARNm exprimés (ARNm DE) ont été soumis à des analyses d’enrichissement de l’ontologie génique (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG). Par la suite, les gènes hubs ont été criblés sur la base du réseau d’interaction protéine-protéine (IPP). Enfin, les réseaux régulateurs compétitifs de l’ARN endogène (ceRNA) contenant des gènes hubs ont été établis en utilisant le site web ENCORI. Un total de 739 ARNm (ARNm DE) exprimés différents et 809 ARNm exprimés différents (ARNm DE) ont été identifiés en utilisant le package limma dans le langage de programmation R. Ensuite, les analyses GO et KEGG ont démontré que les ARNm de DE étaient étroitement associés à l’inflammation et à la formation de matrices extracellulaires dans les PDLSC traités par cytokines. Un réseau d’interaction protéine-protéine (PPI) a été construit pour les ARNm DE, et des gènes hub ont été obtenus en évaluant le degré. Un total de 12 gènes hub à la hausse et 12 gènes hubs à la baisse ont été dépistés. Ces gènes hubs à la hausse et à la baisse ont ensuite été utilisés pour construire un réseau régulateur des ceRNA, respectivement. Dans ces réseaux, ERC2-IT1 à la hausse et EPB41L4A-AS1 à la baisse étaient considérés comme des ARNnc clés dans la parodontite. En conclusion, l’analyse bioinformatique a révélé plusieurs gènes clés et un réseau régulateur du ceRNA qui ont participé à la progression des PDLSC induits par les cytokines. Bien que cette étude ait identifié plusieurs biomarqueurs candidats liés à la parodontite, une validation expérimentale supplémentaire dans des modèles animaux ou des échantillons cliniques est nécessaire.

Introduction

Selon l’Organisation mondiale de la santé, la parodontite est reconnue comme la sixième maladie inflammatoire chronique la plus répandue, omniprésente et irréversible chez ^l’humain. À l’ère actuelle, elle touche près de 15 % de la population mondiale ^1,2,3. Il a été rapporté que la parodontite est fortement corrélée à divers facteurs tels que l’âge, le sexe, les pratiques d’hygiène buccale, le statut tabagiste, l’ethnicité, le statut socio-économique inférieur et une gamme de maladies^systémiques 2,3,4,5. La parodontite, qui présente une prévalence notablement élevée chez les personnes âgées, est pathologiquement provoquée par des altérations dysbiotiques du microbiote sub-gingival qui adhère aux^{dents 6,7}. Si elle n’est pas traitée, cette affection conduit finalement à la destruction osseuse, au mouvement des dents et à la perte malheureuse de leurs^dents. Par conséquent, une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires sous-jacents à la parodontite et l’identification de marqueurs diagnostiques de la maladie sont urgemment nécessaires.

La complexité structurelle et interactive du tissu parodontal est largement considérée comme l’un des facteurs majeurs contribuant à la difficulté importante rencontrée lors du processus de régénération parodontale ^9,10. Parmi la diversité des cellules souches mésenchymateuses (MSC) utilisées pour la régénération parodontale, les cellules souches du ligament parodontal (PDLSC) ont été démontrées comme une source hautement fiable pour la formation de nouvelles structures semblables au cément dans l’environnement in ^{vivo 11,12}. Dans les études précliniques récentes menées, le traitement basé sur les PDLSC a montré des résultats extrêmement prometteurs dans le domaine de la régénération^{tissulaire 13,14}. Comparée au tissu gingival du patient, l’analyse transcriptomique des PDLSC a montré une orientation fonctionnelle plus forte et un potentiel de transformation^{thérapeutique plus forts 13,14}.

La technologie bioinformatique et les méthodes d’analyse bioinformatique permettent aux chercheurs d’identifier les processus biologiques potentiels et les associations avec les statistiques protéomiques, génomiques et^{métabolomiques 15,16}. De plus, la nature à haut débit de la technologie bioinformatique permet également aux chercheurs d’analyser des ensembles de données biologiques à grande échelle, tels que ceux générés par le séquençage de nouvelle génération et les expériences sur^{microarrays 17,18}. Cette capacité permet d’identifier des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic^{de la maladie 19,20}. Par exemple, une disintégrine et métalloprotéinase 28 (ADAM28) ainsi qu’un domaine de type disintégrine et métalloprotéase avec des motifs de thrombospondine de type I (ADAMTSL3) ont été identifiés comme de nouveaux biomarqueurs dans les tissus gingivaux de patients atteints de parodontite via une analyse complète basée sur la technologie^{bioinformatique 21}. Par de plus, plusieurs gènes liés à la ferroptose, dont le coactivateur du récepteur nucléaire 4 (NCOA4), le transporteur de soluté 1A5 (SLC1A5) et la protéine de choc thermique B1 (HSPB1), ont présenté une meilleure valeur diagnostique dans la parodontite²². Cependant, le mécanisme moléculaire de la parodontite mérite une exploration plus approfondie. Dans la présente étude, les chercheurs s’efforcent d’utiliser la technologie bioinformatique pour étudier les gènes hubs dans les PDLSC induits par des cytokines et pour discerner les processus biologiques potentiels et les voies liées à la parodysite. L’analyse bioinformatique des PDLSC traités aux cytokines capture les programmes transcriptionnels liés à l’inflammation pertinents pour le dysfonctionnement des PDLSC, qui comblent l’écart entre le dysfonctionnement des PDLSC et la parodontite. Ces gènes et voies clés dans les PDLSC induits par des cytokines offrent des informations précieuses sur les mécanismes unifiés sous-jacents à la parodontite.

Protocole

1. Ensemble de données

Cette analyse utilisait des données publiques et n’impliquait pas de sujets humains ou animaux, conformément aux directives éthiques institutionnelles et JoVE. Toutes les informations relatives aux plateformes utilisées sont disponibles dans le Tableau des Matériaux.

1. Sélectionnez un total de 6 échantillons (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 et GSM8119442) à partir du jeu de données GSE260558 (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) pour une analyse en bioinformatique.
2. Dans ces échantillons, cultivez les cellules souches du ligament parodontal (PDLSC) dans un milieu normal ou contenant des cytokines inflammatoires pendant 7 jours.
3. Extraire l’ARN total des PDLSC et le soumettre à un séquençage à haut débit²³. Le processus d’analyse bioinformatique est illustré à la Figure 1.

2. Identification des DEG

1. Analysez les profils d’expression des lncRNA et des mRNA à l’aide du logiciel limma (version : 3.46.0) comme décrit^{précédemment 24}.
2. Effectuer des comparaisons par paires entre les cytokines et les groupes normaux.
3. Utilisez la correction du taux de fausses découvertes (FDR) avec un seuil standard de < 0,05 pour identifier des gènes significativement exprimés différenciément. Utilisez les valeurs p ajustées (FDR) pour contrôler la proportion de faux positifs parmi les résultats statistiquement significatifs.
4. Utilisez un seuil ajusté de la valeur P de < 0,05 et un seuil de changement de pliage de > 1 pour identifier les ARNnc ou ARNm significativement dérégulés.
5. Présentez l’expression différentielle des gènes dans des graphiques volcaniques (ggplot2 : version 3.4.1), qui ont été générés à l’aide du logiciel R (version 4.0.4).
6. Listez les 10 principaux ARNn et ARNm dérégulés dans des tableaux.

3. Analyse d’enrichissement fonctionnel

1. Effectuez une analyse d’enrichissement GO des ARNm en utilisant la base de données en ligne DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
   1. Soumettez les gènes dérégulés sur le site web, et sélectionnez les termes GO, incluant la fonction moléculaire (MF), les processus biologiques (BP) et les composants cellulaires (CC), pour effectuer une analyse GO.
   2. Soumettez les gènes dérégulés au plugin Cytoscape (version : 3.8.2) ClueGO [16]+ et à l’application Cluepedia.
   3. Appliquez la correction de Benjamini-Hochberg pour les comparaisons multiples et fixez le seuil de signification à une valeur p ajustée < 0,05.
   4. Téléchargez les résultats de Cytoscape. Classez les enrichissements par ordre décroissant selon la valeur P, et présentez les 5 meilleurs enrichissements dans chaque catégorie.
2. L’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) est une ressource précieuse pour comprendre les fonctions et impacts de haut niveau des systèmes biologiques (http://www.genome.jp/kegg/).
   1. Effectuez l’analyse KEGG de la même manière en choisissant KEGG-PATHWAY sur le site web.
   2. Fixer le seuil de signification à une valeur P ajustée < 0,05, et présenter les 10 enrichissements principaux dans cette étude. Effectuer ces analyses d’enrichissement selon les études ^{rapportées 25,26}.

4. Réseau PPI

1. Prédire et construire un réseau d’interactions protéine-protéine (IPP) en utilisant l’outil de recherche pour la récupération des gènes en interaction (STRING, version 12.0).
2. Soumettez 318 ARNm à la hausse ou 465 ARNm à la baisse sur le site web de STRING pour construire le réseau IPP.
3. Exportez les données d’interaction depuis le réseau PPI et soumettez ces données au logiciel Cytoscape.
4. Masquer le nœud individuel dans le réseau PPI. Téléchargez le réseau IPP présent dans cette étude.
5. Calculez les propriétés topologiques du réseau, y compris la distribution des degrés, en utilisant l’application CentiScaPe, un plug-in de Cytoscape.
6. Quantifiez la topologie locale de chaque gène en additionnant le nombre de ses gènes adjacents, et comptez les interactions pour un nœud donné.
7. Classez tous les gènes du réseau PPI par ordre décroissant selon leur degré de connectivité.
8. Sélectionnez les 12 gènes les plus hauts et les 12 gènes les plus à la baisse dans cette liste classée comme gènes centrals.

5. réseau régulateur miARN-ARNm

REMARQUE : La base de données ENCORI (version 12.0, https://rnasysu.com/encori/) a été utilisée pour prédire les associations régulatrices entre les microARN (miARN) et les DE-INNCRNA (ou gènes centrals).

1. Soumettez les gènes hub à hausse ou à la baisse à ENCORI, et fixez le critère de coupure du programme ≥5 au total six programmes, dont PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar et TargetScan, pour l’analyse de prédiction dans ENCORI.
2. Téléchargez les miARN prédits et soumettez-les à ENCORI pour obtenir des RNncRNA potentiels.
3. Téléchargez les ARNCra prédites et identifiez les ARNlcRNA chevauchés entre l’étape 5.2 et la Figure 2.
4. Soumettre les gènes hub, les miARN obtenus dans la section 5.1 et les lncRNA obtenus à l’étape 5.3 au logiciel Cytoscape (version 3.4.0) pour construire le réseau ceRNA.

Résultats

Identification des DEG
Le logiciel limma R a été utilisé pour analyser les profils d’expression différentiels des ARNnc et ARNm. Les différences entre les deux groupes ont été déterminées par un test t non apparié. Comme illustré dans le diagramme volcanique (Figure 2), un total de 739 ARNncRNA exprimés différents (DE-lncARN, valeur p<0,05, |log2FC|>1) ont été identifiés. Parmi ces ARNlnc DE, 340 ARNnC à la hausse et 399 ARNnC à ...

Discussion

Les cellules souches du ligament parodontal (PDLSC) sont considérées comme des cellules clés qui jouent un rôle crucial dans la suppression des lésions parodontales tout au long des étapes de progression et de récupération de la parodontite^32,33. Un nombre considérable de preuves a clairement démontré que l’incubation sous une condition inflammatoire a le potentiel d’accélérer significativement la sénescence des^...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
R	Fondation R pour l’informatique statistique	4.0.4	Environnement open source de base pour l’informatique statistique. Sert de base à toutes les analyses ultérieures. Généralement utilisé avec RStudio.
Limma	Communauté Bioconductrice (Développeur principal : Walter & Eliza Hall Institute)	3.46.0	Package spécialisé pour l’analyse d’expression différentielle des microarrays et de l’ARN-seq.  ;
Cytoscape	Cytoscape Consortium	3.8.2	Plateforme open source pour la visualisation réseau. Nécessite une installation séparée ; prend en charge des plugins comme ClueGO et cytoHubba via l’App Store.
STRING	Laboratoire européen de biologie moléculaire	12	La plus grande base de données mondiale pour les interactions protéine-protéine (PPI) prédites et connues. Accessible via le web ou le plugin Cytoscape ; fournit des scores de confiance.
ENCORI	Université Sun Yat-sen	3	Base de données publique axée sur les réseaux ceRNA (miARN-ARNM-ARNm).