Article de méthode

Analyses du réseau d’ARN endogènes concurrents chez des rats présentant une occlusion de l’artère cérébrale moyenne sur la base de l’expression de lncRNA, de miRNA et d’ARNm

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DOI :

10.3791/68876

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7 octobre 2025

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

Dans cet article

Résumé

Cette étude a utilisé des analyses bioinformatiques et une validation expérimentale pour étudier systématiquement les rôles régulateurs et les mécanismes sous-jacents des ARN longs non codants (ARNlnc) fonctionnant comme des ARN endogènes compétitifs (ARNce) dans l’AVC ischémique.

Résumé

Cette étude vise à étudier les rôles régulateurs et les mécanismes sous-jacents des ARNlnc agissant comme des ARNc dans l’AVC ischémique. Sur la base de l’hypothèse de l’ARNce, les ARNlnc, les miARN et les ARNm ont été identifiés comme des composants d’un réseau de régulation impliqué dans l’AVC. Les principaux ARNlnc du sous-réseau résultant ont été sélectionnés pour une analyse détaillée. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel à l’aide de l’ontologie génétique et la cartographie des voies par l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto ont révélé des interactions critiques au sein du réseau de ceRNA associé à lncRNA. Les principales voies, y compris la signalisation calcique, la signalisation des jonctions lacunaires et l’interaction des récepteurs neuroactifs des ligands, ont été validées à l’aide de l’analyse par transfert de Western. Le réseau construit de ceRNA comprenait 334 ARNlnc, miARN et ARNm, avec une analyse d’enrichissement fonctionnel prédisant leurs rôles biologiques. Trois ARNlnc à haut degré de centralité ont été sélectionnés pour construire un sous-réseau représentatif de ceRNA. L’analyse par transfert Western a révélé que, par rapport au groupe fictif, les niveaux d’expression des protéines clés - CaMKII, calmoduline, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 et NPY1R étaient significativement régulés à la baisse dans le groupe modèle, tandis que l’expression de CaN était significativement régulée à la hausse (P < 0,05). Ces résultats suggèrent que les ARNlnc sont significativement impliqués dans la pathogenèse de l’AVC. En conclusion, les ARNlnc agissant comme des ARNce jouent un rôle régulateur essentiel dans la pathogenèse de l’AVC ischémique.

Introduction

L’accident vasculaire cérébral ischémique, un trouble neurologique répandu, entraîne des lésions cérébrales permanentes, une invalidité à long termeou la mort1,2,3,4. Les microARN (miARN ou miR), les longs ARN non codants (lncRNA) et les ARN messagers (ARNm) forment des réseaux régulateurs médiés par l’ARN 5,6,7,8. Ces molécules régulent les fonctions cellulaires par divers mécanismes complexes 9,10 sont de plus en plus reconnues comme contribuant à la physiopathologie de l’AVC ischémique. Cependant, malgré leur association croissante avec la maladie, les rôles précis de ces ARN non codants restent incertains. Des recherches plus approfondies sur de nouveaux ARN non codants sont essentielles pour clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’AVC ischémique.

Les ARNlnc agissent comme des régulateurs clés de l’expression des gènes au cours de l’initiation et de la progression de diverses conditions pathologiques. Servant d’ARN endogènes concurrents (ARNce), les ARNlnc se lient aux miARN pour exercer des effets régulateurs spécifiques11. Wei et al. rapportent que lncRNA AK038897 agit comme un ARNce en ciblant miR-26a-5p, modulant ainsi la protéine kinase 1 associée à la mort (DAPK1) pour exacerber les lésions d’ischémie-reperfusion cérébrale12. Des études montrent que l’ARN long non codant SNHG1 (lncRNA SNHG1) fonctionne comme un ARNce pour réguler les maladies cérébrovasculaires en modulant la voie de signalisation HIF-1α/VEGF par interaction avec miR-18a13. Des études supplémentaires montrent que le gène 3 de l’ARN long non codant exprimé par la mère (lncRNA MEG3) module l’apoptose neuronale par le biais de la cascade de signalisation miR-21/PDCD414. Bien que de nombreux ARNlnc, miARN et ARNm aient été identifiés par séquençage à haut débit ou analyse de microréseaux, les fonctions de ces molécules dans l’AVC restent incertaines, et la mise en place systématique de réseaux de régulation médiés par l’ARN est nécessaire de toute urgence.

Par conséquent, cette étude vise à construire un réseau complet d’ARNlnc-miARNm basé sur l’hypothèse de l’ARNc en utilisant des données précédemment collectées, et à analyser des sous-réseaux d’ARNc sélectionnés par le biais de l’ontologie génétique (GO) et de l’enrichissement de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) pour mieux comprendre les fonctions de l’ARNlnc. Les résultats pourraient révéler que plusieurs ARNlnc fonctionnent comme des ARNce, régulant potentiellement des miARN spécifiques et leurs ARNm cibles. L’enrichissement en GO pourrait mettre en évidence des processus biologiques clés, tels que le développement cellulaire, la transduction du signal et la régulation du cycle cellulaire, tandis que l’enrichissement des voies pourrait révéler leur implication dans les voies liées à l’AVC, les réponses immunitaires et le métabolisme. Ces résultats pourraient mettre en évidence les rôles potentiels des ARNlnc dans divers processus cellulaires et mécanismes pathologiques.

Plusieurs améliorations clés sont proposées par rapport aux méthodes d’analyse de réseau de CERNA existantes dans la recherche sur l’AVC ischémique, comme le confirment les comparaisons avec des études connexes : premièrement, intégrer la validation multicouche en combinant la construction de réseau avec la vérification des voies fonctionnelles ; contrairement à Li et al.15, qui se concentrent principalement sur le profilage bioinformatique des réseaux d’ARNce liés au système immunitaire à l’aide de données de transcriptome publiques, construire un réseau d’ARNce comprenant 334 ARNlnc, miARN et ARNm et valider les voies de signalisation critiques (signalisation calcique, signalisation de jonction lacunaire et interaction ligand-récepteur neuroactif) par transfert de Western, en abordant la limite de la dépendance excessive aux prédictions in silico comme on l’a vu dans Fan et al.16, qui construit un réseau de ceRNA associé à des circARN, mais qui n’a pas encore validé expérimentalement les voies en aval, et confirme la pertinence fonctionnelle du réseau prédit en quantifiant l’expression des protéines (p. ex., CaMKII, CX36, GRIA3) dans le groupe modèle et le groupe fictif ; se concentrer sur les ARNlnc de base ayant une grande importance topologique, ce qui renforce la spécificité des résultats ; contrairement à Cheng et al.17, qui construit un réseau d’ARNlnc-miARNm-ARNc avec 3 ARNlnc, 2 miARN et 24 ARNm, mais ne donne pas la priorité aux régulateurs clés, identifiez 3 ARNlnc à haut degré de centralité pour construire un sous-réseau représentatif, en veillant à ce que les informations mécanistes soient ancrées aux nœuds les plus influents et en améliorant l’interprétabilité par rapport à des réseaux plus larges et moins ciblés comme ceux décrits dans Li et al.18, qui comprend 62 ARNlnc, mais ne comporte pas d’analyse ciblée des sous-réseaux ; fournir des paramètres expérimentaux détaillés pour améliorer la reproductibilité : utiliser 500 ng-1 μg d’ARN total extrait des tissus cérébraux (6 rats par groupe : 20 modèles MCAO et 20 témoins simulés) pour la préparation de la banque, avec un numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) > 8,0 pour assurer la qualité, un détail non spécifié dans Wang et al.19, qui valide les biomarqueurs circARN mais omet les spécifications d’entrée de l’ARN ; utiliser des rats mâles SPF SD (220 ± 30 g) avec MCAO, un modèle largement utilisé, mais noter explicitement ses limites, il ne reproduit pas complètement la complexité vasculaire ou les réponses immunitaires de l’AVC ischémique humain comme souligné dans Li et al. - et atténuer cela en stratifiant les rats par scores neurologiques (1-3) pour normaliser la gravité de l’infarctus ; reconnaître les limites de l’étude : le réseau ceRNA pourrait ne pas saisir les modifications post-traductionnelles, et la taille de l’échantillon pour la validation par transfert Western (n = 6 par groupe) pourrait être élargie, avec des travaux futurs pour inclure des cohortes plus grandes et des analyses protéomiques pour combler ces lacunes.

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique expérimentale de l’Université de médecine chinoise de l’Anhui (numéro de licence : AHUCM-rats-2024006) et menées conformément aux directives institutionnelles et aux normes d’utilisation des animaux de JoVE. Quarante rats SD mâles de grade SPF (220 g ± 30 g) ont été utilisés dans cette étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Animaux d’expérimentation

  1. Hébergez les animaux dans le Centre d’expérimentation animale dans des conditions expérimentales standard. Maintenez un cycle lumière/obscurité de 12 heures, changez de litière tous les jours et donnez libre accès à la nourriture et à l’eau.
  2. Euthanasier les animaux à la fin de l’expérience en leur administrant 150 mg/kg de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale pour induire un état anesthésique profond (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Confirmez l’anesthésie profonde par l’absence de réponse réflexe au pincement de la patte, surveillez la respiration pour assurer la perte complète des signes vitaux, puis procédez à la décapitation.

2. Induction du modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) chez le rat

  1. Induire l’anesthésie en administrant une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % à une dose de 40 mg/kg20 (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Évaluez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du pincement de l’orteil et des réflexes cornéens.
    1. Surveillez en permanence la fréquence respiratoire et cardiaque tout au long de la procédure. Appliquez une pommade oculaire stérile à base d’huile minérale immédiatement après l’induction de l’anesthésie pour la protection des yeux21.
  2. Une fois complètement anesthésié, faites une incision médiane du cou et exposez soigneusement l’artère carotide commune droite (ACC), l’artère carotide interne (ICA) et l’artère carotide externe (ECA). Dans le cadre d’une visualisation directe, utilisez des instruments microchirurgicaux appropriés (p. ex., des pinces et des ciseaux) pour séparer doucement le tissu conjonctif environnant et exposer complètement chaque artère.
    1. Après avoir exposé les artères, ligaturer l’ECA et l’ACC à l’aide de sutures chirurgicales. Faites des nœuds chirurgicaux sécurisés pour obstruer la circulation sanguine et minimiser les saignements lors des procédures ultérieures. Assurez-vous d’une tension appropriée pour créer un champ stable pour l’insertion de la suture.
    2. Faites une petite incision à la bifurcation de l’ECA et de l’ICA à l’aide de ciseaux ophtalmiques pour préparer l’insertion de la suture. Choisissez une suture en nylon d’un diamètre de 0,25 mm et d’une longueur de 18 mm à partir de l’extrémité arrondie (en forme de boule). Insérez la suture à travers le site d’incision à la jonction ECA-ICA et avancez-la doucement le long de l’ICA jusqu’à une profondeur d’environ 18,5 mm ± 0,5 mm pour obstruer l’artère cérébrale moyenne et induire une ischémie cérébrale focale.
    3. Fixez la suture en nylon insérée aux tissus ou aux vaisseaux sanguins environnants à l’aide de sutures chirurgicales pour éviter le déplacement. Après avoir maintenu le MCAO pendant 2 h, induire une ischémie/lésion de reperfusion. À l’aide d’une pince chirurgicale fine, saisissez doucement la suture en nylon et retirez-la lentement d’environ 5 mm pour rétablir partiellement le flux sanguin cérébral et induire une lésion de reperfusion. Dans le groupe fictif, ligaturer uniquement l’artère carotide sans insérer d’emboliefiletée 22.
  3. Une semaine après la mise en place réussie du modèle MCAO, anesthésier profondément les rats. Une fois qu’il n’y a pas de réponse à la pince de la patte, décapitez rapidement et récoltez les cerveaux. Rincez les tissus cérébraux avec une solution saline normale, puis conservez-les dans un réfrigérateur à -80 °C pour la cryoconservation23.
  4. Score de la fonction neurologique
    1. Évaluer la fonction neurologique à l’aide de la méthode de notation Longa pour déterminer le succès du modèle MCAO24. 24 h après la reperfusion, évaluer la fonction neurologique de chaque rat et attribuer un score en fonction des critères suivants : Score 0 : aucun déficit neurologique observable ; Score 1 : flexion du membre antérieur gauche lors de la suspension de la queue, membre antérieur pas complètement étendu ; Score 2 : flexion du membre antérieur gauche pendant la suspension de la queue avec une résistance nettement réduite du côté affecté (gauche) lorsqu’il est placé sur une surface plane ; Score 3 : identique au score 2, avec des mouvements de rotation involontaires ou des mouvements de rotation involontaires en rampant ; Score 4 : perte de conscience ou mort dans les 24 h.
      REMARQUE : Un score plus élevé indique un trouble du comportement plus grave et une déficience neurologique plus importante.
  5. Calculer le volume d’un infarctus cérébral à l’aide de la coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)
    1. Divisez chaque cerveau de rat ex vivo le long du plan coronal en cinq tranches d’épaisseur égale. Assurez-vous que chaque tranche a une épaisseur précise de 2,0 mm ± 0,1 mm. Immergez complètement les sections dans une solution de coloration TTC à 2 % (p/v) fraîchement préparée.
      1. Enveloppez le récipient de coloration dans une feuille d’aluminium pour protéger la solution de la lumière et incubez les échantillons dans un incubateur à température constante à 37 °C ± 0,5 °C pendant 30 min. Après la coloration, observez une coloration rouge rose dans le tissu cérébral normal, tandis que les zones infarctus ischémiques restent non colorées (blanches) en raison de la perte d’activité de la déshydrogénase.
    2. Transvaser les tranches de cerveau colorées au TTC dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % (p/v) et fixer à 4 °C pendant 24 h pour préserver la morphologie des tissus. Après la fixation, capturez des images numériques des tranches à l’aide d’un système d’imagerie haute résolution. Enregistrez et archivez les données 24 h après la fixation.
    3. Utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier le volume de l’infarctus et le volume total du tissu cérébral pour chaque groupe de rats après une coloration TTC. Calculer le pourcentage de volume corrigé de l’infarctus à l’aide de la formulesuivante 25 :
      Volume corrigé de l’infarctus ( %) = {[volume total de la lésion − (volume de l’hémisphère gauche − volume de l’hémisphère droit)] / volume de l’hémisphère droit} × 100 %.
    4. Utilisez le logiciel GraphPad Prism pour visualiser et analyser statistiquement les volumes d’infarctus corrigés via un test t non apparié. Définissez la signification statistique comme P < 0,05.

3. Séquençage à haut débit de l’ARN

  1. Sélectionnez des tissus cérébraux de trois rats de chaque groupe. Retirer l’ARN ribosomique (ARNr) des échantillons d’ARN totaux à l’aide de la trousse d’élimination de l’ARNr Ribo-Zero, conformément aux instructions du fabricant.
    1. Construisez des banques d’ADN complémentaires (ADNc) à l’aide du kit de préparation de banques d’ARN TruSeq en suivant le protocole standard. Utilisez des banques d’ADNc purifiés pour la génération et le séquençage des clusters.
  2. Utiliser les données de base précédemment générées26, qui ont fourni toutes les bibliothèques et tous les ensembles de données de séquençage pour cette étude, sans dépendre des bibliothèques nouvellement construites. Concentrez les travaux actuels sur l’analyse de fusion intégrée de ces ensembles de données existants sans générer de nouvelles bibliothèques de séquençage d’ARN ou de données de séquençage.
    1. Confirmer l’approbation de l’étude précédente par les comités d’éthique institutionnels pertinents. Effectuer un séquençage à haut débit pour évaluer systématiquement le profil d’expression des miARN chez les rats atteints de MCAO, en respectant les protocoles normalisés décrits précédemment27.
      REMARQUE : Les données de contrôle de la qualité de la banque de séquençage de l’ARN sont fournies dans le fichier supplémentaire 1.

4. Analyse différentielle de l’expression d’ARN longs non codants, de microARN et d’ARN messagers

  1. Obtenez des annotations pour les gènes codant pour les protéines, les miARN et les ARNlnc à partir d’Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), de miRBase (https://www.mirbase.org/) et de NONCODE (http://www.noncode.org/), selon le cas 28,29,30. Quantifiez l’expression des gènes à l’aide de StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Assemblez les lectures alignées de chaque échantillon en transcriptomes à l’aide de l’assembleur StringTie. Utilisez le module de fusion StringTie pour intégrer les assemblages de transcriptome de tous les échantillons, générant ainsi un ensemble unifié de transcrits cohérents dans toute la cohorte. Utilisez ce transcriptome fusionné pour estimer l’abondance des transcrits32.
    2. Effectuez la quantification des gènes codant pour les protéines et des ARNlnc en appliquant la normalisation TMM (Trimmed Mean of M-values) et en calculant le nombre de fragments par kilobase de transcrit par million de lectures mappées (FPKM) pour chaque transcrit33,34.
  2. Effectuez une analyse d’expression différentielle à l’aide du package edgeR (https://bioconductor.org/) pour identifier les ARNlnc, les miARN (DEMis) et les ARNm (DEM) exprimés de manière différentielle entre le MCAO et les groupes témoins. Convertissez la matrice de comptage brut filtrée en un objet edgeR DGEList. Estimez la dispersion commune et attribuez la même valeur de dispersion à chaque gène ou miARN.
    1. Effectuez un test exact pour comparer l’expression des gènes entre les groupes. Récupérez le changement de multiplication log2 (log2FC), le nombre de logarithmes par million (logCPM), les valeurs P et les valeurs P ajustées au taux de fausses découvertes (FDR) pour chaque gène35 exprimé de manière différentielle. Définir la signification statistique comme P < 0,05 avec un seuil de changement de pli de |log2(FC)| > 1.

5. Prédiction de cibles d’ARN longs non codants et d’ARN messager de microARN exprimés de manière différentielle

  1. Récupérez les séquences de DEMis et de DELs à partir des bases de données appropriées. Utilisez les outils de prédiction d’interaction miARN-ARNlnc miRanda36 et RNAhybrid37 pour identifier les interactions potentielles entre les DEMis et les DEL. Obtenir des paires d’interactions miARN-ARNm à partir de la base de données miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Construction du réseau de régulation ARN long non codant - microARN - ARN messager

  1. Construire le réseau de régulation lncRNA-miRNA-mRNA sur la base de l’hypothèse ceRNA39,40.
    1. Calculer le coefficient de corrélation de Pearson (PCC) entre les LEPP et les MNE. Sélectionnez les paires lncRNA-ARNm pour une analyse plus approfondie si PCC > 0,99 et P < 0,01.
    2. Pour chaque paire ARNlnc-ARNm co-exprimée, identifiez les miARN partagés ciblant les deux transcrits. Utilisez ces miARN partagés pour construire le réseau de co-expression miARN-ARNm-ARNlnc.
    3. Utilisez Cytoscape (https://cytoscape.org/) pour construire et visualiser le réseau d’interaction lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Procédez comme suit :
      1. Utilisez le plug-in CytoNCA pour calculer la centralité d’intermédiarité (BC), la centralité de proximité (CC) et la centralité de degré (DC) pour chaque nœud.
      2. Sélectionnez les gènes dont les scores de centralité dépassent les valeurs médianes des trois paramètres pour construire le sous-réseau clé final.
      3. Utilisez le plug-in CytoHubba pour identifier les 10 principaux gènes pivots du réseau d’interaction protéine-protéine et extraire les nœuds clés identifiés à l’étape 2.
      4. Calculez le degré de nœud pour chaque composant du réseau ceRNA.

7. Analyses d’enrichissement fonctionnel

  1. Effectuer des analyses d’enrichissement des voies GO et KEGG pour étudier plus en détail la fonction de l’ARN43. Utilisez le package clusterProfiler (https://bioconductor.org/) pour visualiser les résultats de l’enrichissement44.

8. Analyse par transfert Western pour détecter les niveaux d’expression des protéines clés impliquées dans les voies liées à lncRNA - ceRNA

  1. Sous anesthésie profonde, retirez rapidement tout le cerveau. Après avoir soigneusement retiré les méninges et les vaisseaux sanguins, isolez le tissu cortical dans la zone infarctus du rat45. À l’aide de ciseaux fins, coupez le tissu en petits morceaux, en veillant à ce que chaque morceau pèse entre 50 mg et 100 mg. Transférez les échantillons de tissus pesés dans des tubes d’homogénéisation pré-refroidis.
    1. Préparez le tampon de lyse des protéines à un rapport de volume de PMSF à tampon de lyse RIPA de 1:100 (concentration finale de 1 mM PMSF). Ajouter le tampon de lyse à raison de 200 μL pour 20 mg de tissu. Homogénéisez soigneusement les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur en verre stérilisé à la chaleur jusqu’à ce que le tissu soit finement décomposé.
    2. Incuber les homogénats sur glace pendant 30 min, en agitant doucement toutes les 10 min pour faciliter la lyse complète. Centrifuger les échantillons à 28 656,6 × g pendant 15 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant contenant la protéine totale sans perturber la pastille.
  2. Ajouter 5× tampon de charge par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) à l’échantillon de protéines dans un rapport de 1:4 (1 volume de 5× tampon pour 4 volumes d’échantillon de protéines). Après dilution, la concentration de travail finale du tampon de chargement SDS-PAGE est de 1×.
    1. Bien mélanger et chauffer au bain-marie bouillant pendant 10 min pour dénaturer complètement les protéines. Laissez les échantillons refroidir à température ambiante. Chargez 30 μg de chaque échantillon dans les puits de gel SDS-PAGE.
    2. Effectuez l’électrophorèse en deux étapes : appliquez 80 V pendant 30 min pour résoudre les protéines à travers le gel d’empilement, puis augmentez à 120 V pendant 1 h pour séparer les protéines dans le gel de résolution.
  3. Préparez du papier filtre prédécoupé et des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) pour correspondre à la taille du gel. Faites tremper la membrane PVDF dans du méthanol pendant 3 min pour l’activer. Plongez la membrane PVDF et le papier filtre dans le tampon de transfert pendant 5 min.
    1. Assemblez le sandwich de transfert dans l’ordre suivant (de haut en bas) : plaque d’anode, trois couches de papier filtre, membrane PVDF, gel, trois couches de papier filtre, plaque cathodique. Assurez-vous d’un bon alignement des couches de gel, de membrane et de papier filtre. Retirez toutes les bulles d’air à chaque étape pour assurer un transfert uniforme.
  4. Immédiatement après le transfert de protéines, rincez la membrane PVDF dans un tampon de lavage Western pendant 5 minutes pour éliminer le tampon de transfert résiduel. Bloquez la membrane à température ambiante pendant 2 h en l’agitant doucement dans un tampon de blocage Western contenant 5 % de lait écrémé en poudre, ou utilisez 5 % de BSA si vous détectez des protéines phosphorylées.
  5. Après le blocage, incuber la membrane avec l’anticorps primaire (1:1000) à 4 °C pendant la nuit en secouant doucement. Le lendemain, incuber la membrane avec l’anticorps secondaire (1:10 000) pendant 2 h à température ambiante.
  6. Effectuez la détection chimiluminescente dans une pièce sombre pour éviter les interférences lumineuses. Placez le côté protéique de la membrane PVDF à plat au centre de la plaque d’exposition dans le système d’imagerie automatique.
    1. Mélangez des volumes égaux de réactif ECL A et de réactif ECL B dans un tube à centrifuger propre immédiatement avant utilisation. Appliquez la solution mélangée d’ECL uniformément sur la surface de la membrane pour initier la réaction luminescente.
    2. Après 1 à 2 minutes d’incubation à température ambiante, retirez délicatement l’excès de liquide sans perturber la surface de la membrane. Ajustez les paramètres d’exposition sur le système d’imagerie en fonction de l’intensité de la luminescence afin d’optimiser la capture du signal.

9. Analyse statistique

  1. Analysez les résultats du transfert Western à l’aide du logiciel ImageJ pour quantifier les valeurs de bande grise. Utilisez GraphPad Prism pour l’analyse statistique des données expérimentales. Exprimez toutes les données en moyenne ± en écart-type (x ± écart-type). Évaluez les différences statistiques entre les groupes à l’aide d’un test t non apparié.
    1. Entrez les données des deux groupes d’échantillons indépendants dans la table de données du logiciel, chaque groupe correspondant à une colonne distincte et les échantillons indépendants les uns des autres. Vérifiez la normalité en sélectionnant « Tests de normalité et de symétrie » sous la fonction « Analyser » et en appliquant le test de Shapiro-Wilk aux deux groupes.
    2. Si P > 0,05 pour les deux groupes, considérons les données normalement distribuées. Sur cette base, sélectionnez Test t non apparié sous Tests t dans la fonction Analyser pour effectuer l’analyse. Définir la signification statistique comme P < 0,05.

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Résultats

Les résultats expérimentaux de vérification du taux de réussite de chaque groupe de modèles de rats sont illustrés à la figure 1. Après modélisation, l’évaluation de la fonction neurologique a été effectuée sur les rats (Figure 1A). Le groupe modèle présentait de graves déficits neurologiques, et ceux avec des scores allant de 1 à 3 ont été inclus dans des expériences ultérieures. Les figures 1B et C montrent les résultats de la col...

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Discussion

Afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathogenèse de l’AVC et d’identifier des cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles, des analyses RNA-Seq et smallRNA-Seq (sRNA-Seq) ont été effectuées sur des tissus cérébraux de rats après MCAO. Cette étude vise principalement à étudier les réseaux régulateurs complexes impliquant les ARNlnc, les miARN et les ARNm. Une analyse complète des ensembles de données RNA-Seq et sRNA-Seq des tissus cérébraux de rat induits p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs affirment qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce manuscrit a été soutenu par le projet de financement des candidats à la réserve de leaders académiques de la province d’Anhui (n° 2022H287), le projet clé de recherche en santé de la province d’Anhui (référence : AHWJ2022a013), le projet clé de recherche en sciences naturelles du collège provincial de l’Anhui (n° 2023AH050745) et le projet provincial d’hygiène et de santé des talents exceptionnels de la province de l’Anhui (n° ahsjhmypygc20230074).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 % (p/v) de solution de coloration TTCBeijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd.20230805Coloration TTC
Solution de paraformaldéhyde à 4 % (p/v)BeyotimeRéf. P0099Tissu cérébral fixe
40 rats SD mâles de qualité SPFHagzhou Ziyuan Laboratory Animal Breeding Co., LtdSCXK [zhe] 2024-0004Animal de laboratoire
5 % de lait écrémé en poudrePhygène scientifiqueRéf. PH1519WB
Système d’électrophorèse à agaroseBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYCP-44PWB
Instrument d’exposition automatiqueShanghai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Posemètre automatiqueShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Machine à glaçons automatiqueChangshu City Xueke Electric Appliance Co., LTDIMS-20 (en anglais)WB
CalmodulineAffinitéRéf. 49B2443WB
CamKIIAffinitéRéférence 14G0796WB
centrifugeuseHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
Package clusterProfilerBioconducteurclusterProfiler_4.17Analyses d’enrichissement
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
Kit de chimiluminescence ultra-sensible ECLBiosharpBL520BWB
Four de séchage à air thermostatique électriqueShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070WB
Appareil d’électrophorèseShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
Appareil d’électrophorèseShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.EPS300WB
cuve d’électrophorèseShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6AffinitéRéf. 46V5371WB
IgG anti-souris de chèvreZs-BIO142637WB
IgG anti-lapin de chèvreZs-BIO139931WB
GRIA3AffinitéRéférence 0C33051WB
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseAnhui Jiawen instrument equipment Co., LTDJW-3021HRWB
Système HiSeq 2500Illumina/Séquençage à haut débit de l’ARN
Logiciel ImageJInstituts nationaux de la santéImageJ 1,54 kColoration TTC
Agitateur chauffant magnétiqueVille de Changzhou et usine d’instrumentsJJ-79-1WB
MicropipetteAllemagne Eppendorf/WB
Micro-centrifugeuse à température normaleHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAffinitéRéférence 2D38248WB
pipetteEppendorf0,5 à 10 ulWB
PKCAffinitéRéférence 17E3745WB
Marqueur protéique pré-coloréBiosharpBL712CWB
Membrane PVDFMilliporeIPVH00010WB
Kit de retrait de l’ARNr Ribo-ZeroIllumina, San Diego, Californie, États-Unis/Extraction de l’ARN
Lysat RIPABiosharpBL504AWB
Pentobarbital de sodiumBeijing Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKanesthésique
Instrument à membrane de transfertShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.VE-186WB
Appareil transmembranaireShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
&bêta ;-actineZs-BIORéférence 19AW0505WB

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Accident vasculaire c r bral isch miqueexpression des lncRNAexpression des miRNAr seau ceRNAenrichissement fonctionnelsignalisation calciquesignalisation des jonctions communicantesWestern Blot

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