Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Summary

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Abstract

Dans la recherche sur la pathogenèse du diabète post-aigu pancréatite sucrée (PPDM-A), une communication bidirectionnelle anormale entre les cellules acinaires pancréatiques (PAC) et les cellules des îlots est un axe clé. Cependant, les lignées cellulaires immortalisées ne peuvent pas reproduire les conditions pathophysiologiques, ce qui rend l’extraction de cellules primaires de haute qualité cruciale. Les méthodes actuelles pour extraire les îlots primaires de souris reposent principalement sur la perfusion pancréatique in vivo via la canulation des voies biliaires, qui présente une barrière technique élevée et n’est pas propice à l’exploitation par des chercheurs sans expérience.

Cette étude a modifié la méthode, éliminant le besoin de perfusion complexe in vivo . Des souris C57BL/6J de grade SPF (6-8 semaines) ont été anesthésiées puis euthanasiées, suivies d’un isolement pancréastique. Le pancréas a été digéré in vitro avec la collagénase P ; îlots primaires ont été séparés par centrifugation à gradient de densité de Ficoll, et des cellules acinaires ont été obtenues par filtration au tamis cellulaire et centrifugation. La viabilité et la fonction cellulaires ont été évaluées à l’aide de coloration calcinée/iodure de propidium (Calcéine/PI), d’un test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose et de détection de l’activité de l’amylase.

Les résultats ont montré que la méthode modifiée était facile à utiliser : le rendement par souris était de (120 ± 5) îlots primaires et de 1,6 à 1,95 × cellules acinaires ; Les taux de viabilité des îlots et des cellules acinaires étaient respectivement de (97,52 ± 0,16 %) et (96,55 ± 0,95 %). De plus, les îlots présentaient une capacité normale de sécrétion d’insuline, et les cellules acinaires étaient sensibles à la stimulation de la céruléine. Cette méthode est simple et fiable, fournissant un cadre réalisable pour étudier les interactions exocrine-endocrinienne pancréatiques et la PPDM-A. Cependant, il présente des limites, comme une application non validée chez les rats.

Introduction

La pancréatite aiguë (PA) peut perturber la fonction endocrinienne pancréatique par plusieurs voies, telles que la lésion parenchymatose pancréatique et les cascades inflammatoires, induisant ainsi une pancréatite aiguë diabète sucrée (PPDM-A)^1,2. Actuellement, la pathogenèse centrale de la PPDM-A reste incertaine, et une communication bidirectionnelle anormale entre les compartiments endocrinien et exocrine du pancréas constitue un axe de recherche^{clé 3}. Bien que les lignées β cellulaires immortalisées existantes (par exemple, INS-1, MIN6) soient des outils couramment utilisés pour les modèles cellulaires diabétiques in vitro, leur nature d’origine tumorale entraîne des différences significatives avec les îlots primaires normales en termes de réactivité au glucose et d’hétérogénéité cellulaire. En conséquence, ils ne peuvent pas vraiment reproduire l’état physiopathologique dans le microenvironnement de la pancréatite^{aiguë 4,5}. Par conséquent, l’obtention d’îlots primaires de haute qualité et de cellules acinaires est devenue la base technique centrale pour élucider le mécanisme de leur interaction.

Les méthodes actuelles pour isoler les îlots primaires des souris reposent principalement sur la technologie de canulation des canaux, qui consiste à localiser et à canuler précisément les voies biliaires pour injecter une solution de collagénase dans le parenchyme pancréatique pour une perfusion in^{vivo 6,7}. Cependant, pour l’isolement des îlots primaires de souris nouveau-nées, Huang et ^al.8 ont obtenu d’excellents résultats grâce à la digestion in vitro sans perfusion pancréatique in vivo. D’après l’expérience pratique de notre équipe de recherche, réaliser une perfusion pancréatique optimale par canulation des voies biliaires est difficile à réaliser rapidement et efficacement sans formation spécialisée. Inspirée par la méthode d’isolement des îlots primaires de souris nouveau-nées, notre équipe a modifié le protocole d’extraction pour le rendre plus simple et accessible aux chercheurs sans expérience en perfusion. Cette approche modifiée offre également une alternative plus simple pour isoler les îlots primaires des jeunes souris ou de celles présentant des canaux biliaires délicats. De plus, cette méthode offre des avantages tant dans l’efficacité d’isolement (quantité) que dans la pureté (qualité) des îlots et des cellules acinaires. Elle permet aux chercheurs de mener des expériences dans le même contexte pathologique et physiologique, facilitant une analyse approfondie du mécanisme d’interaction entre les îlots et les cellules acinaires.

La méthode nécessite un contrôle strict du temps de digestion pancréatique ; Réduire le pancréas avant la digestion est également une étape cruciale. De plus, il convient de prêter attention à l’intensité de la dispersion mécanique du tissu pancréatique après la digestion. Tous ces facteurs influencent la quantité et la qualité des îlots et cellules acinaires isolés. Cette méthode n’a pas été validée chez les rats et ne peut pas être mise à l’échelle pour la production à ce stade.

Protocol

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique ou le Comité d’éthique du Centre des animaux de laboratoire de l’hôpital Changhai (Approbation n° : CHEC (A.E)-2025-026). Les souris C57BL/6J de qualité SPF (6-8 semaines, pesant 18-25 g, mâles ou femelles, n = 3) ont été maintenues sur un cycle clair/obscur de 12 heures avec libre accès à la nourriture (régime d’entretien) et à l’eau.

Les déchets tranchants tels que les seringues et les aiguilles doivent être collectés dans les récipients dédiés au laboratoire et éliminés par des agences professionnelles qualifiées. Conformément aux Directives pour la conduite éthique dans le soin et l’utilisation des animaux non humains en recherche, les carcasses de souris doivent être placées dans le congélateur dédié du laboratoire et incinérées par des organismes professionnels.

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Des solutions comme le milieu à gradient de densité stérile doivent être collectées dans le « Tambour de collecte des déchets chimiques » du laboratoire. Tous les déchets chimiques doivent être éliminés par des organismes professionnels qualifiés, selon les dispositions du laboratoire.

1. Préparation de la solution de collagénase P
   1. Dans un tube centrifuge de 50 mL, pèser séquentiellement 25 mg de collagénase P, 42 mg de chlorure de calcium anhydre et 0,02 g d’inhibiteur de trypchine. Ajoutez 45,5 mL de solution salée équilibrée de Hank et 500 μL de solution HEPES, puis faites un vortex jusqu’à ce que la solution soit complètement dissoute. Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de 0,22 μm, puis transférer la solution filtrée dans un nouveau tube centrifuge stérile de 50 mL. Cela donne une solution de collagénase P à 0,5 mg/mL, utilisée pour la digestion ultérieure du tissu pancréatique.
2. Traitement de la solution à gradient de densité stérile
   1. Filtrez la solution du gradient de densité stérile à travers un filtre de 0,22 μm pour la stérilisation, puis transférez-la dans un nouveau tube centrifuge stérile de 50 mL. Étiquetez clairement les informations de la solution et stockez-les à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Dorénavant, il est appelé « Ficoll ».
3. Préparation du tampon d’arrêt et du milieu complet
   1. Ajouter 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine dans un milieu DMEM blanc et un milieu RPMI-1640, respectivement, pour préparer un milieu complet DMEM et un milieu complet RPMI-1640 (également le tampon d’arrêt pour la digestion pancréatique). Étiquetez clairement les informations de la solution et stockez à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
4. Préparation de solutions de glucose à différentes concentrations
   1. Dans un tube centrifugeuse de 50 mL, ajoutez 50 mL de tampon bicarbonate Krebs-Ringer HEPES (KRBH) et 0,25 g d’albumine sérique bovine (BSA)-V pour préparer une solution de KRBH contenant 0,5 % de BSA. Ensuite, dans 28,33 mL de la solution de KRBH contenant 0,5 % de BSA, ajoutez 168 μL de glucose (1 M) et 1,5 mL de solution de chlorure de calcium (50 mM) pour préparer une solution de glucose de 5,6 mM. Dans 9,28 mL de la solution de KRBH contenant 0,5 % de BSA, ajoutez 220 μL de glucose (1 M) et 500 μL de solution de chlorure de calcium (50 mM) pour préparer une solution de glucose de 22 mM.

2. Isolement des îlots pancréatiques et des cellules acinaires pancréatiques (PAC)

REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent subir une stérilisation par autoclave.

1. Ajoutez la solution salée équilibrée de Hank et la solution de collagénase P à la plaque à 12 puits. Et ajoutez 3 mL de solution de collagénase P à un tube centrifugeuse de 50 mL pour la digestion ultérieure.
   REMARQUE : Ajoutez 2 mL de solution salée équilibrée de Hank dans trois puits et 2 mL de solution de collagénase P dans un puits.
2. Peser et anesthésier la souris avec une injection intraperitonéale de 1,25 % de tribromoéthanol à une dose de 0,025 mL/g avant l’opération, vérifier l’état anesthésique en pinçant le coussin de la souris : la profondeur de l’anesthésie est déterminée par une diminution progressive du rythme respiratoire et aucune réponse au pincement des coussinets du pied. Une fois l’anesthésie profonde confirmée, euthanasiez les souris par luxation cervicale. Immergez les souris dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 minutes pour désinfection, puis transférez-les dans une armoire de biosécurité pour l’isolement pancréatique.
   REMARQUE : Le tribromoéthanol (1,25 %) est fourni comme solution prépréparée à l’achat ; aucune préparation manuelle n’est requise. Les chercheurs doivent porter des gants et des masques tout au long de l’expérience. Si la peau est en contact lors de l’injection de tribromoéthanol à 1,25 %, essuyez immédiatement le réactif résiduel avec de l’éthanol anhydre, rincez à l’eau courante pendant 5 minutes, puis appliquez de la crème hydratante pour soulager la sécheresse. Aucun produit chimique corrosif n’est impliqué dans cette étude. Les réactifs chimiques résiduels, tels que le tribromoéthanol à 1,25 %, doivent être collectés dans des contenants scellés dédiés marqués « Déchets chimiques dangereux ».
3. Réalisez une incision abdominale en forme de « V » pour ouvrir la cavité abdominale de la souris. L’organe lymphoïde rouge foncé dans la région hypocondriaque gauche est la rate, et l’organe blanc attaché à la rate est le pancréas. Effectuez soigneusement une dissection contuse du pancréas le long du bord inférieur de l’estomac et de la jonction pancréaticoduodénale.
4. Lavez le tissu pancréatique isolé dans la solution salaire équilibrée de Hank et retirez les attaches mésentériques résiduelles, la rate et le tissu adipeux péripancréatique.
5. Déplacez le pancréas prétraité sur une plaque à 12 puits contenant 2 mL de solution de collagénase P. Maintenez le pancréas en place avec une pince à épiler de la main gauche, puis utilisez une seringue de 1 mL avec la main droite pour injecter une solution de collagénase P dans le parenchyme pancréatique jusqu’à ce que le tissu pancréatique paraisse translucide et œdémateux.
   REMARQUE : Le volume de solution de collagénase P pour la perfusion est de 600 à 800 μL.
6. Découpez rapidement le pancréas en morceaux de tissu de 1 à 2 mm³ avec des ciseaux chirurgicaux.
   REMARQUE : La taille des morceaux de tissu est approximativement égale au diamètre intérieur d’une pointe standard de pipette de 200 μL.
7. Coupez la pointe distale de 1 à 1,5 cm d’une pointe de pipette de 1 mL (pour agrandir l’ouverture) et utilisez cette pointe modifiée pour transférer les morceaux de tissu pancréatique avec 2 mL de solution de collagénase P dans un tube centrifuge de 50 mL préchargé de 3 mL de solution de collagénase P.
8. Incubez le tube de centrifugeuse dans un bain-marie à 37 °C pendant 12 minutes, en secouant doucement le tube toutes les 5-6 minutes pendant cette période.
   REMARQUE : Le but de secouer le tube centrifugeuse est d’assurer un contact complet entre le tissu pancréatique et la solution de collagénase P.
9. Ajoutez 10 mL de milieu complet RPMI-1640 pour arrêter l’effet digestif de la solution de collagénase P.
10. Pipette la pellete à plusieurs reprises avec une pipette Pasteur de 5 mL (15-20 mouvements de montée et descente) jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros amas de tissu visibles.
11. Ajoutez 10 mL de milieu complet RPMI-1640, puis centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant.
12. Resuspendez le plomb avec 20 mL de médium complet RPMI-1640. Filtrez la suspension à travers un tamis de 40 mailles, puis centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C.
13. Jetez doucement le surnageant, ajoutez 20 mL de solution Ficoll pour resuspendre la pastille, puis ajoutez lentement 15 mL de médium complet RPMI-1640.
    REMARQUE : À ce stade, une interface liquide claire peut être observée.
14. Centrifugez doucement à 640 × g pendant 20 minutes à 25 °C.
    REMARQUE : Évitez les tremblements violents lors de la centrifugation pour éviter les perturbations de l’interface.
15. Retirez soigneusement le tube centrifugeuse et aspirez la couche supérieure de médium rouge à l’aide d’une pipette Pasteur de 5 mL. Ensuite, aspirez soigneusement le liquide contenant les îlots à l’interface de la couche liquide et transférez-le dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 mL. Ajoutez 20 mL de milieu complet RPMI-1640, centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant.
16. Résuspendez le pellet avec 20 mL de milieu complet RPMI-1640, centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant.
17. Resuspendez la pellete avec 10 mL de milieu complet RPMI-1640 et transférez-la dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm.
18. Sous un microscope biologique inversé (grossissement 100x), choisissez manuellement les îlots à l’aide d’une pipette de 20 μL. Transférez les îlots sélectionnés sur une plaque de culture cellulaire à 24 puits préchargée de 500 μL de milieu complet RPMI-1640 par puits.
19. Éliminez la couche de solution de Ficoll, remettez la pellete (à partir de l’étape 2.15) avec 10 mL de milieu complet DMEM, filtrez à travers un filtre de cellules de 100 μm, centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant.
20. Resuspendez le pellet avec 10 mL de milieu complet DMEM, centrifugez à 180 × g pendant 2 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant. Ensuite, resuspendez la pellete avec 5 mL de milieu complet DMEM pour les expériences suivantes.

3. Détection de viabilité des îlots pancréatiques et des cellules acinaires

1. Transférer les îlots isolés et un nombre approprié de cellules acinaires sur des plaques de culture cellulaire à 12 puits/24 puits contenant respectivement 1 mL de milieu complet RPMI-1640 et 1 mL de milieu complet DMEM. Placez les plaques dans un incubateur à cellules CO₂ à 37 °C et 5 % pendant 15 minutes pour qu’elles soient équilibrées.
2. Centrifugez les plaques de culture cellulaire à 12 puits et 24 puits à 180 × g pendant 30 s à 25 °C. Entre-temps, préparez le réactif de coloration selon les instructions du kit de test de viabilité cellulaire et de cytotoxicité à la calicéine/propidium iodure (Calcéine/PI) (protégez de la lumière pendant la préparation).
3. Jetez doucement le milieu, lavez les îlots et les cellules acinaires une fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS), puis centrifugez dans les mêmes conditions que l’étape 3.2.
4. Jetez le PBS et resuspendez les îlots et les cellules acinares avec le réactif colorant préparé. Enveloppez la plaque de culture dans du papier aluminium (pour la protéger de la lumière) et incubez dans un incubateur à cellules CO₂ à 37 °C et 5 % pendant 30 minutes.
5. Dans un environnement protégé par la lumière, capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement 100x) et effectuez une analyse de viabilité cellulaire via ImageJ.

4. Dosage de l’amylase acinaire

1. Semez les cellules acinaires dans une plaque de 12 puits à une densité de 1,5 × 10⁶ cellules par puits avec 1 mL de substrat. Configurez les cellules témoins (Ctrl) et stimulées par la céruléine (10 nM, 20 nM, 50 nM ; désignées C10, C20, C50). Après 30 minutes de stimulation, collectez des surnadants pour détecter l’activité de l’amylase selon les instructions du fabricant.

5. Essai de libération d’insuline stimulée par le glucose

1. Semez 10 îlots par puits dans une plaque à 24 puits. Stabiliser les îlots dans un milieu RPMI-1640 complet pendant 2 heures, puis jeter le milieu.
2. Incubez les îlots dans 1 mL de solution glucose à 5,6 mM pendant 1 heure. Récupérez le surnageant ensuite.
3. Lavez les îlots avec un tampon KRBH. Ensuite, incubez les îlots dans une solution de glucose de 22 mM pendant 1 h et récupérez à nouveau le surnageant.
4. Détectez les concentrations d’insuline chez les deux surnadants (issus des conditions de faible et de glucose élevé) à l’aide d’un kit ELISA INS (insuline) de souris. Calculez l’indice d’insuline stimulée par le glucose (GSI) :
   GSI = Concentration d’insuline dans un milieu à haute glycémie / Concentration d’insuline dans un milieu à faible glycémie

Results

Après centrifugation par gradient de densité de solution de Ficoll, des îlots ont été observés près de l’interface entre la couche liquide transparente et incolore et le milieu, avec des PACs présents sous forme de sédiments au fond du tube (Figure 1).

Au microscope optique, les îlots étaient généralement ronds ou ovales et de couleur brun doré, avec un rendement stable de (120 ± 5) îlots par souris (Figure 2A,B). Les PACs fraîchement isolés étaient sphériques et principalement répartis en amas (3 à 8 cellules acinaires par groupe). Les extrémités apicales des cellules acinaires étaient de couleur plus foncée, avec des granules de zymogène clairement visibles ; Aucun granule ni structure vésiculaire n’a été observé autour des cellules, et le fond de la solution était clair. Le rendement des cellules acinaires variait de 1,6 à 1,95 × 10⁷ cellules par souris [(1,77 × 10⁷) ± (1,75 × 10⁶)] (Figure 2C,D).

Les résultats de coloration Calcéine/PI des îlots et des cellules acinaires sont illustrés à la Figure 3A : Les cellules colorées à la Calcéine (vert) représentaient la majorité, tandis que les cellules colorées à la PI (rouge) étaient rares. L’analyse quantitative des images de coloration vivante/morte a été réalisée à l’aide d’ImageJ. Les résultats ont montré que les taux de viabilité des îlots isolés et des cellules acinaires étaient respectivement de (97,52 ± 0,16) % et (96,55 ± 0,95 %), respectivement (Figure 3B).

L’activité de l’amylase basale des cellules acinaires pancréatiques isolées était de (0,79 ± 0,01) U/mL. Après stimulation avec la céruleine à des concentrations de 10 nM, 20 nM et 50 nM, les activités amylases des cellules acinaires étaient respectivement (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL, et (1,39 ± 0,02) U/mL, respectivement. Les résultats unidirectionnels de l’ANOVA ont indiqué que, comparés au groupe témoin (Ctrl), tous les groupes stimulés à la céruleine présentaient des différences significatives dans l’activité de l’amylase (tous les P < 0,001). De plus, une différence significative d’activité de l’amylase a été observée entre les groupes de la céruléine à 20 nM et à 10 nM (P < 0,001) (Figure 4A).

Lorsqu’elle est stimulée avec une solution de glucose de 5,6 mM, la sécrétion d’insuline des îlots isolés était (0,27 ± 0,04) ng/mL/îlot/h. Lorsqu’elle est stimulée avec une solution de glucose de 22 mM, la sécrétion d’insuline des îlots isolés était (0,94 ± 0,04) ng/mL/îlot/h, avec un GSI de 3,44. Les résultats indiquent que les îlots isolés présentent une réponse typique et efficace à la sécrétion d’insuline sous stimulation avec des solutions de glucose de différentes concentrations (Figure 4B).

Les membres de notre équipe de recherche ont observé que la quantité et la qualité des îlots isolés et des cellules acinares sont étroitement liées au temps de digestion, qui nécessite un contrôle strict pendant le fonctionnement et est moins affecté par différents opérateurs. Par contre, les fluctuations de rendement et de viabilité sont également étroitement liées à la dissection complète du pancréas et à la séparation mécanique du tissu pancréatique, qui nécessite une attention particulière pendant le fonctionnement.

Figure 1 : Résultats de la centrifugation par gradient de densité de la solution de Ficoll. La couche d’îlots se trouve à l’interface entre la couche liquide transparente et incolore et le milieu de culture. Le précipité au fond du tube de centrifugeuse est constitué de PAC. Abréviation : PACs : cellules acinaires pancréatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Caractéristiques morphologiques et quantitatives des îlots et des PAC. (A) Morphologie des îlots isolés à partir de tissu pancréatique de souris. Barre-échelle = 100 μm. (B) Analyse quantitative du nombre d’îlots isolés dans le tissu pancréatique de la souris (n = 3). (C) Morphologie des PACs isolés dans le tissu pancréatique de la souris. Barre-échelle = 100 μm. (D) Analyse quantitative du nombre de PAC isolés dans le tissu pancréatique de la souris (n = 3). Toutes les données étaient exprimées en moyenne ± DS. Abréviation : PAC : cellules acinaires pancréatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Évaluation de la viabilité des îlots et des PAC. (A) Coloration par fluorescence d’iodure de calcéine/propidium pour évaluer la viabilité des îlots et PACs de souris. Vert : cellules vivantes. Red : cellules mortes. Barres d’échelle = 100 μm. (B) Analyse quantitative de la viabilité des îlots et des PACs (n = 3). Toutes les données étaient exprimées en moyenne ± SD. Abréviations : PACs : cellules acinaires pancréatiques ; PI = iodure de propidium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Évaluation de l’activité amylase des PACs et de la capacité de sécrétion d’insuline des îlots. (A) Activité de l’amylase des PACs sous stimulation avec différentes concentrations de céruleine (Ctrl : Groupe témoin ; C10, C20 et C50 : Les concentrations de céruléine étaient de 10 nM, 20 nM et 50 nM (n = 3). (B) Analyse quantitative des concentrations de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (n = 3). Toutes les données étaient exprimées en moyenne ± SD. ***P < 0,001. Abréviations : GSI = Indice d’insuline stimulé par le glucose ; AC : cellules acinaires pancréatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ces dernières années, le diabète sucré post-pancréatite (PPDM) a reçu une large attention ^1,9,10. L’étude des mécanismes moléculaires par lesquels les PAC affectent la sécrétion d’hormones des îlots dans le contexte de la PA est d’une grande importance.

La pathogenèse de la PA est principalement associée à une activation excessive des enzymes pancréatiques dans les cellules acinaires, ce qui conduit à l’autodigestion du tissu^{pancréastique 11,12}. Bien que des lignées cellulaires telles que AR42J, 266-6 (lignées acinaires) et MIN6, INS-1 (lignées β-cellulaires) soient actuellement disponibles, ces modèles cellulaires in vitro ne peuvent pas reproduire pleinement la complexité physiologique des cellules acinaires primaires et des îlots ^4,5. Par conséquent, l’isolement des cellules acinaires primaires et des îlots est crucial pour des études approfondies sur l’interaction entre les compartiments exocrine et endocrine du pancréas. Actuellement, les méthodes d’isolement des îlots sont bien établies ; Cependant, la plupart ne répondent pas aux besoins de recherche pour étudier l’interaction entre les îlots et les cellules acinaires^{pancréatiques 6,7,8}.

Ce protocole expérimental optimise la procédure de perfusion pancréatique, abaissant la barrière technique, permettant ainsi aux chercheurs sans formation spécialisée en canulation des voies biliaires de mener des expériences. Parallèlement, il garantit la quantité et la qualité des îlots isolés et des cellules acinares, offrant une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires de souris et des cellules acinaires pancréatiques primaires.

Bien que cette méthode simplifie le processus d’isolement des îlots, des étapes clés nécessitent encore un contrôle strict pour garantir des rendements élevés et une séparation efficace des îlots et des cellules acinaires pancréatiques. Ces étapes incluent une perfusion pancréatique adéquate, une perturbation tissulaire appropriée (assurant un hayage complet), la digestion pancréatique (contrôle précis du temps de digestion et des secouements manuels pendant la digestion) et le pipetage mécanique (contrôle du nombre et de l’intensité des mouvements de pipetage). Avant la sélection des îlots, les îlots en suspension doivent être stabilisés dans un incubateur cellulaire pendant environ 10 minutes afin de faciliter un ramassage plus efficace.

Il est important de noter que lors de la perfusion pancréatique, de meilleurs résultats sont obtenus lorsque des vésicules de liquide plus claires sont injectées ; L’ensemble du tissu pancréatique doit être entièrement perfusé, mais le temps de perfusion doit être contrôlé en 1 à 2 minutes. Si une faible viabilité cellulaire est détectée, ajustez le temps de contact entre le tissu pancréatique et la collagénase P (y compris le temps de perfusion et le temps de digestion au bain-marie). De plus, faites attention aux dommages mécaniques lors de l’isolement – par exemple, évitez une force excessive lors de la dispersion du tissu pancréatique. La technique aseptique doit être maintenue tout au long de l’isolement des îlots et des cellules acinaires afin d’éviter toute contamination. Les réactifs préparés doivent être filtrés à travers un filtre de 0,22 μm. Le processus d’isolation doit être effectué dans une armoire de biosécurité, et tous les instruments et consommables utilisés pendant l’isolement doivent être stériles. Les deux milieux complets préparés contiennent également une solution de pénicilline-streptomycine à 1 %.

Pour l’anesthésie de la souris : fixez la peau du cou de la souris avec le pouce et l’index gauches, et soutenez son abdomen avec l’annulaire et l’auriculaire (en gardant une posture tête baissée, abdomen vers le haut pour exposer la cavité abdominale). Tenir la seringue de la main droite, l’insérer à un angle de 30° dans la peau du bas gauche de l’abdomen de la souris (à 1 cm de l’aine et 0,5 cm de la ligne médiane), injecter lentement l’anesthésiant, puis presser le site d’injection avec un coton stérile pendant 10 secondes après le retrait de l’aiguille pour éviter toute fuite de médicament. Euthanasiez la souris uniquement par luxation cervicale une fois qu’elle est complètement anesthésée.

Si vous êtes piqué par une aiguille contaminée (exposée au sang ou tissu de la souris) ou mordu par une souris, pressez immédiatement la zone autour de la plaie au niveau du lavabo le plus proche (pressez de l’extrémité proximale à distale de la plaie pour expulser une petite quantité de sang), rincez la plaie en continu avec de l’eau courante pendant 15 minutes, puis désinfectez-la avec 75 % d’éthanol ou 0,5 % d’iode povidone.

Les résultats des tests d’activité de l’amylase des cellules acinaires ont montré que les cellules acinaires pancréatiques isolées présentaient un faible niveau d’activation basale et étaient sensibles à la stimulation de la céruleine : l’activité de l’amylase augmentait progressivement avec la concentration de céruléine, atteignait le niveau le plus élevé à 20 nM de céruléine, et diminuait légèrement lorsque la concentration de céruléine était de 50 nM. Les résultats du test de sécrétion d’insuline stimulé par le glucose ont montré que les îlots isolés présentaient une réponse typique et efficace à la sécrétion d’insuline sous stimulation avec des solutions de glucose de différentes concentrations. Ces résultats indiquent que les cellules acinaires et îlots extraits par ce protocole sont adaptés à des expériences in vitro ultérieures.

La procédure d’isolation des îlots et des cellules acinaires de ce protocole expérimental est facile à utiliser. Les résultats expérimentaux montrent que les îlots et les cellules acinares isolés via ce protocole présentent une excellente quantité et une excellente viabilité. De plus, plusieurs membres de notre équipe ont validé ce protocole en utilisant plusieurs souris ; Les résultats de validation indiquent qu’il présente une bonne reproductibilité, des données fiables et des fluctuations minimales du rendement cellulaire. Cependant, ce protocole présente aussi certaines limitations. Bien qu’il dépende peu des compétences techniques de l’opérateur, il nécessite néanmoins que l’opérateur possède des connaissances de base en anatomie de la souris pour disséquer complètement le pancréas de la souris – c’est une condition préalable à tout le processus d’isolement. Si l’on isole simultanément les tissus pancréatiques de plusieurs souris, la quantité de solution de collagénase P et d’autres réactifs doit être ajustée en conséquence. De plus, l’isolement simultané de plus de deux souris n’est pas recommandé : la différence de temps entre le traitement des tissus pancréatiques de différentes souris lors de la dissection, de la perfusion et du hachéage affectera le temps de contact entre le tissu pancréatique et la collagénase P, ce qui nuit à l’efficacité et à la viabilité de l’isolement cellulaire. Ainsi, son application à grande échelle peut être limitée. De plus, ce protocole n’a pas été validé chez les rats. Si l’on isole des îlots et des cellules acinaires de rats, la posologie de certains réactifs et le temps de digestion peuvent nécessiter un ajustement supplémentaire.

En conclusion, ce protocole expérimental fournit une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires de souris et des cellules acinaires pancréatiques primaires. Il convient davantage aux chercheurs inexpérimentés de pratiquer l’isolement des îlots et des cellules acinaires, tout en offrant un cadre expérimental pratique pour les études in vitro sur les interactions exocrine-endocrinienne pancréatiques.

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List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 & mu ; Filtre m	Millex	SLGPR33RB	Filtrez la solution de collagénase P préparée
0,25 M chlorure de calcium (stérile)	Beyotime	ST365	Voie de signalisation dépendante du calcium pour activer la sécrétion d’insuline
1 ml de seringue	Jierui	10084692516405	Utilisé pour la perfusion de collagénase P dans le tissu pancréatique.
Solution de tribromoéthanol à 1,25 %	Beijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.	JT0781	Anesthésie
Tube centrifugeuse de 1,5 mL	Eppendorf	30121589	Collectez le surnageant de la cellule pour centrifugation et stockage.
1x Hank' Solution salée équilibrée s	Biosharp	BL561A	Préparez la solution de collagénase P et rincez le tissu pancréatique
Plaque de culture cellulaire à 12 puits	SARSTEDT	83.3921	Conservez le tissu pancréatique et l’acinaire extrait de la culture
Tube centrifugeuse de 15 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A	Maintien des solutions pendant l’expérience
Plaque de culture cellulaire à 24 puits	SARSTEDT	83.3922	Culture des îlots extraits
40-maillage  ; Tamis	Weidan Instruments	N/A	Filtrer le tissu pancréatique
Pipette Pasteur de 5 mL	Biosharp	BS-XG-03L	Pipettage des liquides et perturbation physique du tissu pancréatique
Tube centrifugeuse de 50 mL	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A	Maintenir les solutions pendant l’expérience, contenir les tissus et centrifuger
Antennes de culture cellulaire de 60 mm	Beijing Labgic Technology Co., Ltd.	12211	Contenant pour stocker un milieu de culture contenant des îlots pour faciliter la cueillette
Solution d’éthanol à 75 %	HYNAUT	N/A	Faites tremper les souris pour les désinfecter.
Adobe Photoshop 2023	Adobe Inc.	N/A	Générez des images.
Centrifugeuse Beckman Allegra X-12/X-12R	BECKMAN	Allegra X-12/X-12R	Centrifugeuse
Albumine sérique bovine (BSA)-V	Solarbio	A8020	Maintenez la fonction physiologique normale des îlots et utilisez (it/this) pour préparer des solutions de glucose à différentes concentrations.
C57BL/6J, SPF, 6 et ndash ; 8 semaines, 18 ans et dash ; 25 g	Centre des animaux de laboratoire de l’Université médicale navale & nbsp ;
Kit de test de viabilité et cytotoxicité des cellules de calcéine/PI	Beyotime	C2015L	Détecter la viabilité cellulaire et la cytotoxicité des cellules animales à partir de la coloration à double fluorescence de Calcein-AM (Calcein AM) et de Propidium iodure (PI) simultanément des cellules viables et mortes.
Chlorure de calcium (anhydre)	Sangon Biotech	10043-52-4	Préparez la solution de collagénase P
Filtre cellulaire (100 et mu ; m)	Biosharp	BS-100-XBS	Filtrage des cellules acinaires
Colagnase P	Sigma	11213857001	Tissu pancréatique digestif
Solution D-(+)-glucose (20 %, stérile)	Beyotime	ST491	Stimulez la sécrétion d’insuline des îlots.
DMEM de base (1x) (Dulbecco' s Eagle Medium modifié)	Gibco	C11995500BT	Culture des cellules acinaires
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biowest	S140B-500	Préparez le support culturel
Solution stérile PREMIUM Ficoll-Paque	Cytiva	17544203	Milieu du gradient de densité pour la stratification du gradient de densité
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software, LLC	N/A	Générer des images et effectuer des analyses statistiques.
HEPES solution (1 M)	Biosharp	BL1061A	Préparez la solution de collagénase P
Centrifugeuse à grande vitesse/réfrigérée	Sigma	3K15	Centrifugeuse
ImageJ	Laboratoire des Instituts Nationaux de Santé pour l’Instrumentation Optique et Computationnelle (LOCI)	N/A	Analyser les images de fluorescence cellulaire et calculer la viabilité cellulaire.
Microscope biologique inversé	Leica	N/A	Observez la morphologie cellulaire et sélectionnez les îlots.
Microscope à fluorescence inversée	OLYMPUS	IX73	Observez les signaux fluorescents cellulaires et capturez des images fluorescentes.
Tampon Krebs-Ringer bicarbonate HEPES	LEAGENE	CZ0103	Maintenez la fonction physiologique normale des îlots et utilisez (it/this) pour préparer des solutions de glucose à différentes concentrations.
Kit ELISA INS (insuline) de souris	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	EM0260	Détectez le niveau de sécrétion d’insuline des îlots.
Pinces ophtalmiques (10 cm, courbées avec crochet)	Dispositifs médicaux Qingyi	N/A	Assistez à la dissection
Pinces ophtalmiques (10 cm, droites avec dent)	Dispositifs médicaux Qingyi	N/A	Assister à la dissection et à la séparation soudaine du tissu pancréatique ainsi qu’à l’extraction du tissu pancréatique
Solution de pénicilline et de streptomycine	Gibco	15140-122	Préparez le milieu de culture pour prévenir la contamination
RPMI-1640 moyen,	KeyGEN BioTECH	KGL1501-500	Terminez la solution digestive P de collagénase et cultivez les îlots
Inhibiteur de la trypsine de Glycine max (soja)	Sigma	T6522	Préparez la solution de collagénase P
Ciseaux chirurgicaux (10 cm, pointe droite)	Dispositifs médicaux Qingyi	N/A	Assistance anatomique et découpe du tissu pancréatique en petits morceaux
Bain d’eau	OAICLAB	AÏE-HUM	Maintenez la température de digestion.
Kit d’évaluation d’activité &alpha ;-amylase et &beta ;-amylase	Elabscience	E-BC-K006-M	Détecter les niveaux d’amylase sécrétés par les cellules acinaires dans différentes conditions