Détection d’altérations ciblables dans le cancer du poumon non à petites cellules à l’aide du séquençage de nouvelle génération

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail de séquençage de nouvelle génération automatisé et accrédité par ISO15189 pour détecter les altérations génomiques ciblables dans les tissus contenant de la paraffine fixée au formol pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC).

Résumé

Le succès de la thérapie ciblée dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) dépend de l’identification précise des altérations motrices, y compris les mutations, les fusions de gènes et les amplifications. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est devenu un outil de diagnostic moléculaire complet, capable de détecter les aberrations génomiques connues et nouvelles, fournissant un soutien essentiel pour le traitement personnalisé du CPNPC. Cependant, le NGS reste une méthode complexe et techniquement difficile. Malgré son adoption généralisée, le NGS reste confronté à certains défis, notamment la complexité technique et les délais d’exécution prolongés. Ici, le flux de travail NGS certifié ISO15189 mis en œuvre dans le laboratoire clinique est introduit. Le protocole standardisé englobait l’évaluation de la cellularité tumorale (≥20 %), l’extraction d’ADN à partir de tissus fixés au formol (FFPE) (entrée d’ADN ≥ 50 ng), la préparation automatisée de banques et l’analyse bioinformatique. En intégrant des mesures strictes de contrôle de la qualité (CQ) à chaque étape, le flux de travail garantit une grande fiabilité des données. En outre, l’innovation clé dans le flux de travail a été l’automatisation de la construction de bibliothèques NGS. Le système automatisé de construction de bibliothèques NGS comprenait la réparation des extrémités, le A-tailing, la ligature de l’adaptateur, la capture d’hybridation et la purification, minimisant efficacement l’erreur humaine, améliorant la reproductibilité expérimentale, réduisant le temps de manipulation, et donc améliorant l’efficacité. L’expérience démontre qu’un contrôle qualité rigoureux et une préparation automatisée des banques sont essentiels pour maintenir la précision et l’évolutivité des tests NGS cliniques. Cette approche optimisée garantit non seulement la conformité aux normes ISO15189, mais répond également à la demande croissante d’oncologie de précision dans la prise en charge du CPNPC.

Introduction

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente 75 à 85 % de tous les cas de cancer du poumon, ce qui représente à la fois une priorité clinique et un défi thérapeutique ^1,2,3. Au cours des dernières années, grâce au développement réussi et à l’application clinique de médicaments ciblant moléculairement tels que les inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR-TKI), le traitement du CPNPC avancé est entré dans l’ère des thérapies de précision personnalisées ^4,5,6

Protocole

Le protocole a reçu une dérogation de l’IRB pour les échantillons d’archives anonymisés.

1. Étapes de pré-test et contrôle qualité

1. Enregistrer les informations sur les échantillons dans le système de gestion de l’information du laboratoire (tableau 1). Remplissez le formulaire de consentement éclairé pour les tests de mutation génétique.
2. Recevez un échantillon de PFNPC FFPE. Assurez-vous que l’échantillon utilisé pour le test est un échantillon de tissu de paraffine qui a été conservé pendant au plus 2 ans. S’assurer que les échantillons sont traités e....

Résultats

À l’aide d’un flux de travail automatisé d’analyse NGS avec des contrôles de qualité rigoureux, le laboratoire a effectué un profilage génomique complet des échantillons de CPNPC. Le flux de travail de détection optimisé (Figure 2) a permis d’identifier de manière fiable plusieurs altérations génomiques cliniquement exploitables dans des échantillons tumoraux représentatifs (Figure 3).

Les résultats d.......

Discussion

Tout rapport NGS qualifié est le fruit d’un processus rigoureux, qui reste complexe et chronophage²⁸. Pour résoudre ces problèmes, le laboratoire a développé un système NGS entièrement automatisé. Cette opération réduit considérablement les interventions manuelles, minimise les erreurs expérimentales et raccourcit considérablement les délais d’exécution. Par conséquent, ce système a fourni une stratégie plus fiable et plus efficace pour le NGS, établissant une nou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Agilent  ; Kit d’ADN à haute sensibilité	; Agilent	5067-4626	Pour une utilisation avec le   ; Système bioanalyseur Agilent 2100
; Kit de réactifs Agilent DNA 1000	; Agilent	5067-1504	Pour une utilisation avec le   ; Système bioanalyseur Agilent 2100
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent	G2939A	Évaluer la taille du fragment de la bibliothèque et la présence d’adaptateurs.
Concert : Instrument de purification entièrement automatique des acides nucléiques	CONCERT	MC1002	Utilisation pour l’extraction d’ADN
Égal 1 et fois ; Kit dsDNA HS Assay	Vazyme	EQ121-02-AA	Pour une utilisation avec le   ; Fluoromètre Qubit 3.0
Kit de détection combinée des mutations du gène EGRR/KRAS/BRAF/ALK chez l’humain	Burning Rock	BR-LC00102	Construction de la bibliothèque
Magnis BR	Agilent Technologies	G7595AA	Préparation automatisée de bibliothèques NGS
Ultrasonicateur focalisé ME220	Covaris	500396	Ultrasonication
NanoDrop One/OneC	Thermo Fisher	ND-UN-W	Détection spectrophotométrique visible UV à pleine longueur d’onde
NextSeq 550Dx	Illumina	20005715	séquence
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)	Illumina	20024908	Pour une utilisation avec le NextSeq 550Dx
Réactif d’extraction d’acides nucléiques	CONCERT	RC1102	Utilisation pour l’extraction d’ADN
Fluoromètre Qubit 3.0	Vie	Q33216	Utilisé pour la détection des concentrations d’acides nucléiques ou de bibliothèques
Kit d’analyse HS Qubit dsDNA	Vie	Q32851	Pour une utilisation avec le   ; Fluoromètre Qubit 3.0