Article de méthode

Détection d’altérations ciblables dans le cancer du poumon non à petites cellules à l’aide du séquençage de nouvelle génération

DOI :

10.3791/69091

⸱

10 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un flux de travail de séquençage de nouvelle génération automatisé et accrédité par ISO15189 pour détecter les altérations génomiques ciblables dans les tissus contenant de la paraffine fixée au formol pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le succès de la thérapie ciblée dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) dépend de l’identification précise des altérations motrices, y compris les mutations, les fusions de gènes et les amplifications. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est devenu un outil de diagnostic moléculaire complet, capable de détecter les aberrations génomiques connues et nouvelles, fournissant un soutien essentiel pour le traitement personnalisé du CPNPC. Cependant, le NGS reste une méthode complexe et techniquement difficile. Malgré son adoption généralisée, le NGS reste confronté à certains défis, notamment la complexité technique et les délais d’exécution prolongés. Ici, le flux de travail NGS certifié ISO15189 mis en œuvre dans le laboratoire clinique est introduit. Le protocole standardisé englobait l’évaluation de la cellularité tumorale (≥20 %), l’extraction d’ADN à partir de tissus fixés au formol (FFPE) (entrée d’ADN ≥ 50 ng), la préparation automatisée de banques et l’analyse bioinformatique. En intégrant des mesures strictes de contrôle de la qualité (CQ) à chaque étape, le flux de travail garantit une grande fiabilité des données. En outre, l’innovation clé dans le flux de travail a été l’automatisation de la construction de bibliothèques NGS. Le système automatisé de construction de bibliothèques NGS comprenait la réparation des extrémités, le A-tailing, la ligature de l’adaptateur, la capture d’hybridation et la purification, minimisant efficacement l’erreur humaine, améliorant la reproductibilité expérimentale, réduisant le temps de manipulation, et donc améliorant l’efficacité. L’expérience démontre qu’un contrôle qualité rigoureux et une préparation automatisée des banques sont essentiels pour maintenir la précision et l’évolutivité des tests NGS cliniques. Cette approche optimisée garantit non seulement la conformité aux normes ISO15189, mais répond également à la demande croissante d’oncologie de précision dans la prise en charge du CPNPC.

Introduction

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Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) représente 75 à 85 % de tous les cas de cancer du poumon, ce qui représente à la fois une priorité clinique et un défi thérapeutique 1,2,3. Au cours des dernières années, grâce au développement réussi et à l’application clinique de médicaments ciblant moléculairement tels que les inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR-TKI), le traitement du CPNPC avancé est entré dans l’ère des thérapies de précision personnalisées 4,5,6. La thérapie ciblée offre une efficacité précise, une spécificité élevée et des effets secondaires minimes 7,8. Ce changement dans le traitement a simultanément augmenté la demande de technologies de diagnostic moléculaire.

À l’heure actuelle, les tests complets ciblant les tumeurs sont devenus un élément indispensable de la pratique clinique qui peut aider à élucider des profils de mutation génétique précis et fournit ainsi une base fiable pour l’utilisation ultérieure de médicaments ciblés, la surveillance de la résistance aux médicaments et l’évaluation du pronostic des patients. En particulier, les tests multigéniques basés sur le NGS, tirant parti des avantages techniques à haut débit et à haute sensibilité, ont déjà été recommandés pour une application clinique 9,10,11,12.

Par rapport aux techniques de diagnostic moléculaire traditionnelles, le NGS présente des avantages révolutionnaires. Le principal avantage du NGS réside dans sa capacité à haut débit. Il permet la détection simultanée de plusieurs gènes, y compris des altérations génétiques connues et inconnues 13,14. Pendant ce temps, NGS réalise des tests complets en une seule fois, réduisant relativement les coûts, la consommation d’échantillons et le délai d’exécution des tests15,16. Compte tenu de ces avantages, le NGS est de plus en plus appliqué dans la pratique clinique. Cependant, les processus de NGS sont complexes, notamment l’évaluation de la cellularité tumorale, l’extraction des acides nucléiques, la préparation automatisée de banques et l’analyse bioinformatique. La qualité du traitement initial de l’échantillon affecte directement les performances des analyses bioinformatiques ultérieures17. En particulier, la préparation des banques implique une série d’étapes pour convertir les échantillons d’acides nucléiques bruts en banques standardisées compatibles avec les instruments de séquençage. La préparation de la bibliothèque comprend la fragmentation, la réparation des extrémités, la ligature de l’adaptateur et l’amplification par PCR18. Ce processus complexe introduit souvent divers biais techniques : par exemple, la fragmentation peut conduire à la sous-représentation des régions d’hétérochromatine ; la préférence de substrat de la ligase lors de la ligature de l’adaptateur peut entraîner la perte de certaines séquences ; et l’amplification par PCR a tendance à provoquer une couverture inégale dans les régions où le contenu en GC est extrême19. Ces biais systémiques réduisent non seulement la qualité des données de séquençage, mais peuvent également conduire à des conclusions erronées dans les analyses bioinformatiques ultérieures. Par conséquent, la mise en place d’un système de contrôle de la qualité rigoureux est essentielle pour garantir la fiabilité et la cohérence des résultats expérimentaux.

Pour relever ces défis techniques de longue date, le laboratoire a adopté un système NGS entièrement automatisé. Le système est conçu pour réduire le temps de traitement manuel et les délais d’exécution globaux. Il intègre des protocoles programmables pour garantir à la fois la flexibilité opérationnelle et la précision de traitement, tout en utilisant des modules et des unités intégrés pour minimiser efficacement les biais techniques potentiels à chaque étape. De plus, cette solution automatisée améliore non seulement la reproductibilité et le débit de la préparation des banques, mais surtout, garantit que les données de séquençage reflètent plus précisément la composition moléculaire des échantillons originaux. Ici, le laboratoire souhaite introduire le système par la détection des altérations du conducteur à l’aide du NGS basé sur l’ADN.

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Protocole

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Le protocole a reçu une dérogation de l’IRB pour les échantillons d’archives anonymisés.

1. Étapes de pré-test et contrôle qualité

  1. Enregistrer les informations sur les échantillons dans le système de gestion de l’information du laboratoire (tableau 1). Remplissez le formulaire de consentement éclairé pour les tests de mutation génétique.
  2. Recevez un échantillon de PFNPC FFPE. Assurez-vous que l’échantillon utilisé pour le test est un échantillon de tissu de paraffine qui a été conservé pendant au plus 2 ans. S’assurer que les échantillons sont traités et entreposés conformément aux méthodes pathologiques standard.
    REMARQUE : Cette étude se concentre principalement sur le flux de travail méthodologique, plutôt que sur la réalisation d’une analyse clinique à grande échelle. Par conséquent, aucun nombre d’échantillon spécifique n’a été fixé pour cette phase de la recherche.
  3. Coupez des sections à l’aide de lames de microtome jetables. Changez les lames, les pinces et les microtubes de 1,5 ml entre les échantillons pour éviter la contamination croisée et éviter d’introduire des contaminants dérivés de l’opérateur (p. ex., cheveux, cellules de la peau, salive).
    REMARQUE : Grande taille d’échantillon (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, cinq feuilles ; petits échantillons (< 0,5 cm x 0,5 cm) et échantillons de perforation, 6-10 μL, 10 feuilles.
  4. Effectuez une coloration régulière à l’hématoxyline-éosine (HE) pour évaluer le contenu des cellules tumorales.
  5. Sélectionner des échantillons contenant ≥20 % de cellules tumorales malignes pour une analyse en aval. Le contenu tumoral est évalué par des pathologistes sur des lames de vitrailHE 20.
    REMARQUE : Si le contenu tumoral est inférieur à 20 %, sous la direction des régions tumorales marquées sur la lame HE, grattez la zone de tissu tumoral correspondante. Ce processus permet d’enrichir le tissu tumoral en éliminant efficacement les composants non néoplasiques environnants, augmentant ainsi considérablement le pourcentage de cellules tumorales dans le matériel collecté.
  6. Effectuez l’extraction des acides nucléiques à l’aide d’un système de purification automatisé comme décrit ci-dessous.
    1. Sectionnez le bloc FFPE à l’aide d’un microtome pour obtenir un ruban. Placez le ruban dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Transférez le ruban à l’emplacement d’entrée d’échantillon désigné sur l’instrument d’extraction automatisé.
    2. Utilisez un instrument d’extraction automatique avec un kit d’extraction automatique et remplacez le pipetage manuel par un système d’extraction automatique d’acide nucléique à billes magnétiques.
      REMARQUE : L’automatisation de cette étape permet d’assurer une extraction automatique afin d’assurer une production d’ADN de haute précision et reproductible pour les applications NGS en aval.
    3. Reportez-vous aux instructions du purificateur d’acide nucléique entièrement automatique et du réactif d’extraction d’acide nucléique pour extraire l’acide nucléique.
    4. Ensuite, sélectionnez le programme C1102, choisissez le temps d’incubation du déparaffinage de l’échantillon de 16 h et le volume d’élution de 100 μL.
      REMARQUE : Si la solution d’ADN extraite n’est pas immédiatement testée, elle doit être conservée à -20 °C pendant 6 mois au maximum.
  7. Évaluer la qualité des acides nucléiques (tableau 2) comme décrit ci-dessous.
    1. Utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose pour déterminer la taille des fragments d’ADN. Utilisez Agilent2100 et d’autres systèmes d’analyse par électrophorèse capillaire microfluidique pour les échantillons à faible entrée.
    2. Dissoudre 1 g d’agarose dans 100 mL de solution de TAE. Faites chauffer le mélange au bain-marie jusqu’à ce qu’il soit transparent. Refroidissez la solution à environ 60 °C.
    3. Connectez-vous à l’électrode positive (rouge) de l’instrument d’électrophorèse. Effectuez le pôle négatif (noir) à la tension 180 V, exécutez pendant 15 min21,22.
    4. Selon les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose, catégoriser la taille des fragments en quatre niveaux (A-D ; Tableau 3), et sélectionner l’acide nucléique des niveaux A-C pour les opérations ultérieures.
    5. Utilisez la spectrophotométrie pour vérifier la pureté. Assurer une OD260/OD280 > 1,8 ; OD260/OD230 > 2.0 pour indiquer les niveaux de contaminants acceptables23,24.
    6. Utilisez un kit de détection (table des matériaux) basé sur des colorants fluorescents spécifiques à une séquence pour le dosage fluorométrique afin de mesurer avec précision la concentration d’ADN.
    7. Ajoutez 1 μL d’ADN à tester à 199 μL de solution de travail, puis mélangez, centrifugez brièvement et mesurez sa concentration à l’aide d’un fluorimètre (Table des matériaux).

2. Préparation de la bibliothèque et contrôle de la qualité (Figure 1)

  1. Préparez le fragment d’ADN génomique à l’aide de l’échographie (tableau des matériaux) comme décrit ci-dessous.
    1. Mélangez 200 ng d’ADN génomique dans 50 μL de tampon Tris-EDTA (TE) faible. Ensuite, conservez le tube d’échantillon dans un support d’échantillon pré-refroidi (8 °C).
    2. Réglez les paramètres de l’instrument conformément au Tableau 4. Ensuite, lancez la fragmentation.
    3. Utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose pour vérifier l’effet de fragmentation. Cette étape génère des fragments d’ADN avec des extrémités endommagées qui nécessitent une réparation des extrémités pour les transformer en extrémités émoussées pour les étapes suivantes.
  2. Effectuer la réparation d’extrémité et l’ajout de A à 3' comme décrit ci-dessous.
    1. Réparez les extrémités endommagées de l’ADN FFPE avec des enzymes pour former des extrémités plates, assurant 3'-OH et 5'-P. Ajouter A aux extrémités aplaties à double brin de 3 pi.
    2. Préparez le mélange ERA en ajoutant 7 μL de tampon de réparation d’extrémité et 3 μL d’enzyme de réparation d’extrémité, effleurez doucement manuellement 3x-5x et centrifugez pendant 1-3 s.
    3. Ajouter le mélange ERA à 50 μL d’échantillon d’ADN cassé, mélanger doucement et centrifuger pendant 1 à 3 s.
    4. Placez-le dans l’instrument PCR et sélectionnez le programme ERA (20 °C pendant 30 min ; 65 °C pendant 30 min ; 4 °C Hold ; Couvercle 85 °C). Effectuez l’opération suivante dans les 2 h.
  3. Effectuez la ligature de l’adaptateur comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez le mélange LIG du système réactionnel en ajoutant 30 μL de tampon de ligature, 10 μL d’ADN ligase et 10 μL d’adaptateur d’ADN. Ensuite, effleurez légèrement manuellement 3x-5x et centrifugez pendant 1-3 s.
    2. Ajoutez 50 μL de mélange LIG au produit de 60 μL de l’étape précédente, mélangez délicatement, puis centrifugez pendant 1 à 3 s.
    3. Placez le mélange dans un instrument PCR, puis sélectionnez le programme LIG (20 °C pendant 15 min sans chauffer le couvercle ; 70 °C pendant 10 min (couvercle chauffant) ; 4 °C Hold ; Couvercle 85 °C).
  4. Effectuer la purification par billes magnétiques.
    1. Prendre 1,5 mL d’un tube à centrifuger à faible adsorption et ajouter 88 μL de billes magnétiques homogénéisées et 110 μL de produit ligaturé par adaptateur. Agitez et mélangez bien, et incubez à température ambiante pendant 5 min.
    2. Centrifugez immédiatement l’échantillon incubé pendant 1 à 3 s et placez le tube de centrifugation sur une grille magnétique. Attendez que la solution soit claire (environ 3 à 5 minutes).
    3. Une fois le tube fixé sur l’aimant, ouvrez le capuchon et aspirez soigneusement le surnageant éliminé à l’aide d’une pipette sans perturber la pastille de bille.
    4. Gardez le tube sur l’aimant et ajoutez 300 μL d’éthanol à 75 % fraîchement préparé dans chaque tube.
    5. Attendez 1 minute pour permettre aux billes magnétiques de se déposer complètement. Tournez lentement le tube de centrifugation horizontalement une fois pour absorber l’éthanol.
    6. Répétez les étapes 2.4.4 et 2.4.5 une fois, pour un total de 2x.
    7. Effectuez une centrifugation instantanée pendant 1 à 3 s, remettez le tube dans la crémaillère magnétique et attendez 30 s. À l’aide d’une pipette, vous pouvez enlever tout résidu d’éthanol et gardez le couvercle du tube ouvert.
    8. Faites sécher les billes magnétiques à température ambiante pendant 2 minutes jusqu’à ce que la surface de la perle apparaisse mate et ne présente aucune fissure.
    9. Éluer le produit de ligature avec 28 μL de tampon d’élution (EB).
      REMARQUE : Les billes magnétiques doivent être équilibrées à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
  5. Amplifiez et purifiez la prébibliothèque comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez le prémélange du système réactionnel en ajoutant 10 μL de tampon PCR, 10 μL d’amorces PCR, 1,5 μL de mélange dNTP, 1 μL d’enzyme PCR. Tapotez doucement manuellement 3x-5x et centrifugez pendant 1-3 s.
    2. Ajouter 22,5 μL de pré-mélange à 27,5 μL du produit purifié de l’étape précédente, mélanger délicatement, puis centrifuger pendant 1 à 3 s.
    3. Sélectionnez le programme PRE : 98 °C 45 s ; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cycles ; 72 °C 2 min ; 4 °C Tenir ; Couvercle 105 °C.
    4. Une fois le programme PCR terminé, effectuez une purification par billes magnétiques à l’aide d’éthanol à 75 % fraîchement préparé. Éluer le produit avec 18 μL d’EB.
  6. Capturez l’hybride comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez le système réactionnel A en ajoutant 15 μL de prébibliothèque et 4 μL de mélange bloquant.
    2. Placez sur PCR et exécutez le programme PCR HYB (95 °C pendant 5 min ; 65 °C Hold ; Couvercle 105 °C).
    3. Préparez le mélange HYB du système réactionnel B en ajoutant 10 μL de tampon d’hybridation, 0,5 μL d’inhibiteur de la RNase et 1 μL de sonde. Agitez doucement 3x-5x et centrifugez pendant 1-3 s.
      REMARQUE : Le nom de la sonde est LCOO1 et les gènes de la sonde incluent EGFR, KRAS, BRAF, ALK, ETC.
    4. Lorsque la température de l’instrument de PCR descend à 65 °C, ajoutez 11,5 μL de mélange HYB au système de réaction A, mélangez doucement, puis couvrez le couvercle de l’instrument PCR et poursuivez l’incubation pendant 16 à 24 h.
    5. Incuber le tampon de lavage 2 dans un tube conique de 15 mL avec un élément chauffant en métal à 65 °C à un dosage de 600 μL par échantillon.
    6. Récupérez les billes magnétiques SCB, inversez-les et mélangez-les 5x, agitez-les pendant 10 s et équilibrez-les à température ambiante pendant 30 min. Agiter pendant 10 s, transférer 25 μL dans un tube à centrifuger à faible adsorption de 1,5 mL, placer sur une grille magnétique pendant 3 min et jeter le surnageant.
    7. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage des billes aux billes magnétiques SCB de 25 μL, utilisez un vortex et mélangez pendant 3 s, centrifugez momentanément pendant 1 à 3 s, laissez reposer sur la grille magnétique pendant 3 min et jetez le surnageant.
    8. Répétez l’étape 2.6.7 2 fois, pour un total de trois fois.
    9. Ajouter 200 μL de tampon de lavage de billes aux billes magnétiques, agiter et mélanger pendant 3 s, remettre en suspension pour une utilisation ultérieure.
    10. Transvaser environ 30 μL de l’échantillon hybride dans des billes magnétiques SCB remises en suspension, vortex et mélanger, placer sur un mélangeur rotatif, incuber à température ambiante pendant 30 minutes et centrifuger pendant 1 à 3 s.
    11. Placez le tube de mélange sur une grille magnétique pendant 3 min, puis aspirez environ 230 μL de surnageant. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 1, agiter pendant 5 s, placer sur un mélangeur rotatif, puis incuber à température ambiante pendant 15 min. Centrifugeuse instantanée pendant 1 à 3 s.
    12. Placez le tube de mélange d’échantillon de billes magnétiques sur une grille magnétique et laissez-le reposer pendant 3 min. Ensuite, aspirez environ 500 μL de liquide surnageant et résiduel.
    13. Préchauffer 150 μL de tampon de lavage de 2 à 65 °C, agiter pendant 10 s, placer sur un mélangeur à température constante, agiter et incuber à 65 °C pendant 10 min à une vitesse de 600 tr/min. Effectuer une centrifugation instantanée pendant 1 à 3 s, placer sur une grille magnétique pendant 3 min et aspirer environ 150 μL de liquide surnageant et résiduel.
    14. Répétez l’étape 2.6.13 3 fois, pour un total de quatre fois.
    15. Centrifuger instantanément pendant 1 à 3 s pour éliminer tout liquide résiduel du tube d’échantillon. Ajouter 20 μL d’EB, mélanger de haut en bas 8x-10x, bien mélanger et placer sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
  7. Préparation et purification de la bibliothèque finale.
    1. Préparez le mélange d’auto-test de démarrage du système réactionnel en ajoutant 25 μL de mélange d’amplification, 5 μL d’indice et 20 μL de bibliothèque de billes magnétiques. Tapotez doucement 3x-5x et centrifugez pendant 1-3 s. Mélanger délicatement, centrifuger pendant 1 à 3 s.
    2. Choisissez le programme POST : 98 °C 45 s ; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cycles ; 72 °C 10 min ; 4 °C Tenir ; Couvercle 105 °C.
    3. Une fois le programme PCR terminé, effectuez une purification par billes magnétiques à l’aide d’éthanol à 75 % fraîchement préparé. Éluer la bibliothèque finale avec 20 μL d’EB.

3. Préparation entièrement automatisée de la bibliothèque (tableau 5)

  1. Appuyez sur le bouton d’alimentation pour activer le système et attendez l’initialisation. Accédez aux paramètres du programme et sélectionnez Exécuter le protocole, puis Protocole : Burning Rock HS.
  2. Réglez les paramètres de contrôle qualité de l’aliquote comme Type d’échantillon : ADN de haute qualité ; Quantité d’entrée (ng) : 50 ; Cycles pré-PCR : 12 ; Cycles post-PCR : 12. Cliquez sur EXÉCUTER.
  3. Insérez la cartouche de réactif préemballée dans l’emplacement désigné (valide automatiquement le placement et l’état du réactif).
  4. Après avoir chargé les échantillons, appuyez sur Démarrer pour que le système s’exécute de manière autonome. Observez les indicateurs LED pour surveiller la progression.
  5. Une fois le programme terminé, cliquez sur OK et le programme transférera automatiquement la bibliothèque finale dans le tube de bibliothèque, finalisant ainsi la préparation de la bibliothèque.

4. Séquençage et contrôle qualité

  1. Effectuez la quantification de la bibliothèque et le contrôle qualité comme décrit ci-dessous.
    1. Mesurez la concentration avant la bibliothèque et la concentration totale de la bibliothèque à l’aide de la fluorométrie.
    2. Détectez la taille du fragment de la bibliothèque. Utilisez un kit pour évaluer la taille du fragment de la bibliothèque et la présence d’adaptateurs (Table des matériaux).
      REMARQUE : Si la bibliothèque finale contient des dimères d’amorce, une étape de purification supplémentaire doit être ajoutée avant de mélanger les échantillons sur la machine. La norme qualifiée pour l’insertion de fragments est ≥ 150 pb et l’efficacité de capture attendue est de ≥ 40 %.
    3. Diluer la bibliothèque de séquençage à 1,6 pM et 1300 μL pour les opérations de séquençage.
  2. Effectuez la surveillance de l’environnement de séquençage comme décrit ci-dessous.
    1. Contrôlez l’environnement de séquençage, y compris la température intérieure (19-25 °C), l’humidité intérieure (20 %-80 %).
    2. Données de sortie complètes de l’instrument QC, y compris la base au-dessus de Q30 et le filtre de passage de densité de cluster (PF).

5. Séquençage, analyse des données et contrôle qualité

  1. Effectuez le traitement des données brutes et le profilage moléculaire comme décrit ci-dessous.
    1. Utilisez l’aligneur Burrows-Wheeler (version 0.7.10) pour aligner les données de séquençage sur hg19.
    2. Effectuez l’alignement local, l’optimisation, le marquage de duplication et l’appel de variants à l’aide du kit d’outils d’analyse du génome (version 3.2) et de Vardict (version 1.5.1).
    3. Filtrez les variantes à l’aide du pipeline fpfilter VarScan (version 2.4.3) et supprimez les loci dont la profondeur est inférieure à 50. Classifiez et excluez les variants dont la fréquence de population est supérieure à 0,1 % dans les bases de données ExAC, 1000 Genomes, dbSNP ou ESP6500SI-V2 en tant que polymorphismes mononucléotidiques (SNP).
    4. Annotez les variantes restantes à l’aide de SnpEff (version 3.6).
    5. Analysez les variants structurels (SV), y compris les grands réarrangements génomiques (LGR), à l’aide de MarkSV (outil d’algorithme Burning Rock). Analysez les variantes du nombre de copies (CNV) en fonction de la profondeur des données de couverture des intervalles de capture.
    6. Des données de couverture correctes pour les biais de séquençage résultant de la teneur en guanine-cytosine et de la conception de la sonde.
  2. Évaluez la qualité de l’échantillon, y compris la profondeur moyenne, la profondeur médiane, la profondeur unique, la taille de l’insert, la complexité de la bibliothèque, la couverture, le rapport Q30 et le rapport de corrélation des échantillons appariés, comme décrit aupoint 25.
  3. Pour la génération du rapport, vérifiez la version et les paramètres du pipeline pour terminer l’examen bioinformatique. Utiliser des lignes directrices pertinentes pour évaluer la pathogénicité des mutations26,27. Publier le rapport final.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’aide d’un flux de travail automatisé d’analyse NGS avec des contrôles de qualité rigoureux, le laboratoire a effectué un profilage génomique complet des échantillons de CPNPC. Le flux de travail de détection optimisé (Figure 2) a permis d’identifier de manière fiable plusieurs altérations génomiques cliniquement exploitables dans des échantillons tumoraux représentatifs (Figure 3).

Les résultats d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tout rapport NGS qualifié est le fruit d’un processus rigoureux, qui reste complexe et chronophage28. Pour résoudre ces problèmes, le laboratoire a développé un système NGS entièrement automatisé. Cette opération réduit considérablement les interventions manuelles, minimise les erreurs expérimentales et raccourcit considérablement les délais d’exécution. Par conséquent, ce système a fourni une stratégie plus fiable et plus efficace pour le NGS, établissant une nou...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Pékin de la République populaire de Chine (7252122), de la Fondation de recherche clinique en oncologie Xisike de la République populaire de Chine (Y-HS202402-0021), du Fonds de recherche sur l’enseignement de la formation des résidents de l’hôpital du cancer, de l’Académie chinoise des sciences médicales et du Collège médical de l’Union de Pékin (E2025004), ainsi que du financement national de la recherche clinique hospitalière de haut niveau (2025-LYZX-R-B03).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; Agilent  ; Kit d’ADN à haute sensibilité  ; Agilent5067-4626Pour une utilisation avec le   ; Système bioanalyseur Agilent 2100
  ; Kit de réactifs Agilent DNA 1000  ; Agilent5067-1504Pour une utilisation avec le   ; Système bioanalyseur Agilent 2100
Bioanalyseur Agilent 2100AgilentG2939AÉvaluer la taille du fragment de la bibliothèque et la présence d’adaptateurs.
Concert : Instrument de purification entièrement automatique des acides nucléiquesCONCERTMC1002Utilisation pour l’extraction d’ADN
Égal 1 et fois ; Kit dsDNA HS AssayVazymeEQ121-02-AAPour une utilisation avec le   ; Fluoromètre Qubit 3.0
Kit de détection combinée des mutations du gène EGRR/KRAS/BRAF/ALK chez l’humainBurning RockBR-LC00102Construction de la bibliothèque
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AAPréparation automatisée de bibliothèques NGS
Ultrasonicateur focalisé ME220Covaris500396Ultrasonication
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-UN-WDétection spectrophotométrique visible UV à pleine longueur d’onde
NextSeq 550DxIllumina20005715séquence
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Pour une utilisation avec le NextSeq 550Dx
Réactif d’extraction d’acides nucléiquesCONCERTRC1102Utilisation pour l’extraction d’ADN
Fluoromètre Qubit 3.0VieQ33216Utilisé pour la détection des concentrations d’acides nucléiques ou de bibliothèques
Kit d’analyse HS Qubit dsDNAVieQ32851Pour une utilisation avec le   ; Fluoromètre Qubit 3.0

Références

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