Method Article

Système intégré de détection moléculaire basé sur la PCR pour la détection simultanée de quatre parasites intestinaux zoonotiques provenant de sources multiples

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour détecter simultanément quatre parasites intestinaux zoonotiques provenant de plusieurs sources, basé sur une combinaison de système de détection moléculaire intégré basé sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les maladies infectieuses sont des facteurs critiques affectant la santé humaine, le développement économique et la stabilité sociale. Parmi elles, les maladies parasitaires intestinales zoonotiques sont de plus en plus préoccupantes à l’échelle mondiale en tant que maladies infectieuses émergentes et réémergentes, en particulier Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis et Giardia. Seules quelques études ont été publiées sur l’épidémiologie des parasites ci-dessus, accompagnées de problèmes tels que des cibles de détection uniques, de faibles taux de détection et des taux élevés de détection manquée. Cette étude vise à établir un système de détection moléculaire intégré basé sur une combinaison de tests PCR pour la détection simultanée des quatre parasites intestinaux zoonotiques ci-dessus dans des échantillons prélevés sur des souris sauvages, des animaux de compagnie et du bétail (bovins et ovins), afin de fournir un support technique efficace pour la détection systématique des parasites dans de multiples scénarios, y compris les interfaces animal-environnement, en particulier dans les installations de surveillance locales.

Dans cette étude, en prenant la détection d’Enterocytozoon bieneusi dans les matières fécales de 95 souris sauvages et de 30 chats et chiens (25 de chats et 5 de chiens) comme test primaire, lorsque deux séries d’amorces ont été utilisées pour amplifier le gène ITS, les résultats positifs de chaque PCR étaient exactement les mêmes (5,26 %), mais la combinaison de 2 séries de tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR) a donné un taux de positivité plus élevé (6,32  %) pour Enterocytozoon bieneusi. Dans le cas de Giardia, 9 échantillons positifs ont été détectés à l’aide du gène de la bêta-giardine (BG), tandis qu’aucun résultat positif n’a été détecté à l’aide des gènes de la glutamate déshydrogénase (GDH) et de la triose phosphate isomérase (TPI). Les résultats ci-dessus ont démontré qu’une combinaison de tests PCR pour plusieurs segments génétiques cibles améliorait la capacité de détection des agents pathogènes désignés, par rapport à tout test PCR unique. Les séquences cibles ont été confirmées par le séquençage de Sanger. Ce système a été conçu pour améliorer et faciliter la surveillance de l’état d’infection, de la distribution et de l’évolution phylogénétique des parasites intestinaux zoonotiques provenant de sources multiples, fournissant ainsi une base pour des avertissements précis et sensibles à un stade précoce. Il s’agit de jeter un pont technique pour atteindre l’objectif « Une seule santé » à travers les interfaces homme-animal-environnement.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis et Giardia sont des protozoaires pathogènes courants et facilement négligés avec une prévalence mondiale. Au cours des dernières années, en raison de facteurs tels que la récupération et l’intrusion dans les niches écologiques des foyers naturels, la popularité de l’élevage d’animaux de compagnie et le développement de l’élevage du bétail et de la volaille, la prévalence des maladies parasitaires intestinales zoonotiques multisources chez les rongeurs, les animaux de compagnie (chats et chiens) et le bétail (bovins et ovins) est devenue de plus en plus un centre d’intérêt pour l’émergence de l' et la réémergence de maladies infectieuses dans les zones domestiques et rurales, mettant gravement en danger la santé humaine et la sécurité de la santé publique mondiale 1,2,3,4.

Ces parasites ont des espèces intra-génériques complexes et une grande adaptabilité de l’hôte. Ils peuvent infecter non seulement les rongeurs, les animaux de compagnie, les ruminants du bétail, les volailles et les oiseaux, mais aussi les espèces zoonotiques, qui peuvent infecter les humains, provoquant des symptômes cliniques tels que des douleurs abdominales, de la diarrhée et des vomissements. Ils sont particulièrement sensibles chez les enfants, les personnes âgées, les femmes enceintes et les populations immunodéprimées, et peuvent être transmis par l’eau, la nourriture et l’air, ce qui pose d’importants risques zoonotiques pour la santé publique 3,5,6.

À l’heure actuelle, l’identification des quatre parasites ci-dessus repose principalement sur la morphologie, qui est sujette à des erreurs d’identification en raison de similitudes morphologiques au sein des genres et de facteurs subjectifs, en particulier pour distinguer les espèces et les génotypes. Les techniques de biologie moléculaire ont été largement utilisées pour identifier les espèces, les genres et les génotypes de ces parasites. Pour Blastocystis et Cryptosporidium, la détection se concentre principalement sur la petite sous-unité de l’acide ribonucléique ribonucléique ribosomique (ARNr SSU) gène 3,7,8 ; pour Enterocytozoon bieneusi, le gène 4,9 de l’espaceur transcrit interne (ITS) ; et pour Giardia, les gènes10,11 de la bêta-giardine (BG), de la glutamate déshydrogénase (GDH) et de la triose phosphate isomérase (TPI). Bien que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) conventionnelle emboîtée ait considérablement amélioré les capacités d’identification et de typage de ces quatre parasites, elle est insuffisante pour détecter les cas manqués et identifier de nouvelles espèces ou quasi-espèces présentant des caractéristiques génétiques significatives. Cela affecte souvent l’efficacité des enquêtes épidémiologiques, de la transmission et du contrôle des maladies chez les humains, les animaux et d’autres hôtes, ce qui pose de grands défis à la sécurité de la santé publique chez les humains, les animaux et l’environnement.

En raison des similitudes dans les symptômes, les voies de transmission et la gamme d’hôtes de ces quatre parasites, il n’existe pas encore de système moléculaire intégré pour une détection efficace tout en évitant de manquer la détection et en identifiant avec précision de nouvelles espèces ou quasi-espèces présentant des différences génétiques significatives. Cette étude a permis d’établir un système de détection moléculaire intégré mature basé sur la technologie de séquençage à haut débit par PCR en examinant la littérature, pour la détection simultanée des quatre parasites intestinaux zoonotiques dans des échantillons multi-sources (souris sauvages, animaux de compagnie, bovins et moutons). Combiné à l’analyse bioinformatique, ce système a été appliqué pour identifier les parasites intestinaux zoonotiques multisources, surveiller les facteurs épidémiologiques tels que la distribution des infections et l’évolution phylogénétique, et alerter rapidement des infections humaines et animales et de la contamination environnementale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude a été approuvée et menée par le comité d’éthique animale du Centre provincial de contrôle et de prévention des maladies du Jiangsu. Cette étude a été menée conformément à l’édition 2020 des directives de l’American Veterinary Medical Association sur l’euthanasie des animaux, aux principes directeurs du Règlement sur l’administration des animaux de laboratoire (ordonnance n° 2 de la Commission d’État des sciences et de la technologie de la République populaire de Chine, 1988) et aux Principes directeurs pour le traitement humain des animaux publiés par le ministère des Sciences et de la Technologie de la République populaire de Chine.

1. Préparation d’excréments frais de souris sauvages, d’animaux de compagnie et de bétail (bovins et ovins)

  1. Anesthésier les souris par inhalation de dioxyde de carbone à partir d’une source de dioxyde de carbone comprimé en conserve dans une boîte en plastique transparente et hermétique, avec un taux de remplacement de 30 à 70 % du volume du récipient par minute. Après une anesthésie complète et un coma, effectuez une luxation cervicale sur les souris.
  2. Prélèvement d’échantillons de matières fécales fraîches : Prélevez des échantillons de matières fécales de chiens, de chats, de bovins et de moutons dans l’heure suivant la défécation, avec un tube par excréments d’animal, et évitez la contamination croisée.
    1. Capturez les rongeurs à l’aide de cages d’appâts avec des dispositifs de libération dans différents habitats sauvages. Placez les souris capturées dans des sacs à souris et transportez-les rapidement au laboratoire. En opération stérile dans une enceinte de biosécurité, disséquez les souris pour recueillir le rectum contenant des matières fécales, placez-les dans un cryotube de 2 ml et conservez-les à -80 °C pour une détection ultérieure.
    2. Sélectionner des chiens et des chats dans des animaleries de différentes régions comme objets de recherche. Prélever immédiatement les matières fécales fraîchement excrétées dans des cryotubes de 5 mL, étiquetés avec des informations complètes sur l’échantillon, et les transporter rapidement au laboratoire pour les stocker à -80 °C.
    3. Sélectionner des bovins et des ovins issus d’élevages (intensifs ou en plein air) comme objets de recherche. Prélever immédiatement les matières fécales fraîchement excrétées dans des cryotubes de 50 mL, étiquetés avec des informations complètes sur l’échantillon, et les transporter rapidement au laboratoire pour les stocker à -80 °C.

2. Extraction de l’ADN total à partir d’excréments frais de souris sauvages, d’animaux de compagnie et de bétail (bovins et ovins)

  1. Prétraitement fécal :
    REMARQUE : Le mini-kit de tabouret QIAamp Fast DNA a été utilisé.
    1. En fonctionnement stérile dans une enceinte de biosécurité, ajoutez environ 200 mg de matières fécales de différentes sources dans le tampon salin tamponné au phosphate (PBS), ajoutez des billes d’acier et homogénéisez soigneusement à l’aide d’un broyeur de tissus.
    2. Chauffez-le à 70 °C pendant 5 min et centrifugez-le à 10 000 × g pendant 10 min à température ambiante (15-25 °C).
    3. Ajouter 600 μL de surnageant dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 25 μL de protéinase K, ajouter 600 μL de tampon AL et agiter pendant 15 s.
    4. Incuber à 70 °C pendant 10 min. Ajouter 600 μL d’éthanol 100 % anhydre au lysat et au vortex pour mélanger.
  2. Ajouter délicatement 600 μL de lysat dans une colonne de centrifugation, centrifuger à 14000 × g pendant 1 min et placer la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de prélèvement de 2 ml. Répétez cette étape une fois de plus.
  3. Ouvrez délicatement la colonne d’essorage, ajoutez 500 μL de tampon AW1, centrifugez à vitesse maximale pendant 1 min et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml. Ouvrez délicatement la colonne d’essorage, ajoutez 500 μL de tampon AW2 et centrifugez à vitesse maximale pendant 3 min.
  4. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL (préparé séparément) et centrifugez à 14000 × g pendant 3 min. Placez la colonne de centrifugation dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL étiqueté et ajoutez 100 μL de tampon d’élution directement sur la membrane de la colonne de centrifugation.
  5. Incuber à température ambiante (15-25 °C) pendant 1 min, et centrifuger à 14000 × g pendant 1 min pour éluer l’ADN.
  6. Déterminez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre ultra-micro. Utilisez l’ADN extrait pour une détection ultérieure ou conservez-le à -20 °C pour une conservation à long terme.
    REMARQUE : Le rapport A260/A280 doit être de 1,8 à 2,0 pour garantir l’intégrité et la pureté de l’ADN extrait.

3. Détection par PCR conventionnelle imbriquée de Cryptosporidium et Blastocystis ciblant l’ARN ribosomique de petite sous-unité (ARNr SSU)

REMARQUE : Le mélange PCR Dream Taq Green a été utilisé pour cette étape.

  1. Préparez le système de réaction PCR sur glace à l’aide d’un mélange PCR : 25 μL de tampon 2× Taq, 2 μL de chacune des amorces avant et inverse, 16 μL de ddH2O et 5 μL de matrice, avec un volume total de 50 μL.
  2. Pour Cryptosporidium, suivez les étapes 3.2.1 à 3.2.2.
    1. Utilisez F1R11 et F-1R1-1 8,11 comme amorces de réaction de premier tour. Réglez le programme de réaction : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 90 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    2. Utilisez F2R21 et F-1R2-1 8,11 comme amorces de second tour, avec le programme de réaction suivant : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s, et extension à 72 °C pendant 1 min, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
  3. Pour Blastocystis, suivez les étapes 3.3.1 à 3.3.4.
    1. Utilisez F1R13 et F1-1R-1 3,12 comme amorces de réaction de premier tour. Réglez le programme de réaction de F1R1 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 60 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 100 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    2. Réglez le programme de réaction pour F1-1R-1 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 1 min, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    3. Utilisez F2R23 et F2-1R-1 3,12 comme amorces de deuxième tour. Réglez le programme de réaction pour F2R2 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 60 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 1 min, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    4. Réglez le programme de réaction pour F2-1R-1 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 50 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
      REMARQUE : Les séquences d’amorces sont illustrées dans le tableau 1 1,3,8,11,12.
PathogèneTaille prévue du produit (pb)Séquences d’amorces (5′-3′)Références
Cryptosporidium830F1 : CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1 : TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2 : AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2 : GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1 : GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1 : CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1 : TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis600F1 : GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1 : GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2 : ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2 : GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1 : TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1 : GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1 : ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tableau 1 : Séquences d’amorces pour l’ARNr SSU de Cryptosporidium et Blastocystis.

4. Détection par PCR conventionnelle imbriquée du gène ITS d’Enterocytozoon bieneusi et des gènes Giardia BG, GDH et TPI

REMARQUE : Le mélange PCR Dream Taq Green a été utilisé pour cette étape.

  1. Préparez le système de réaction PCR sur glace à l’aide d’un mélange PCR : 25 μL de tampon 2× Taq, 2 μL d’amorces avant et inverse, 16 μL de ddH2O et 5 μL de matrice, avec un volume total de 50 μL.
  2. Pour Enterocytozoon bieneusi, suivez les étapes 4.2.1 à 4.2.2.
    1. Utilisez F1R19 et F1-1R1-12 comme amorces de réaction de premier tour. Réglez le programme de réaction comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 50 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    2. Utilisez F2R29 et F2-1R2-12 comme amorces de second tour, avec le programme de réaction suivant : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s, et extension à 72 °C pendant 50 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
  3. Pour Giardia, suivez les étapes 4.3.1 à 4.3.3.
    1. Utilisez BG-F1R1, GDH-F1R1 et TPI-F1R1 2,10 comme amorces de réaction de premier tour pour les trois gènes cibles. Réglez le programme de réaction de premier tour pour tous comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 50 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 1 min, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    2. Réglez le programme de réaction de second tour pour BG-F2R2 2,10 et TPI-F2R2 2,10 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 55 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 50 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
    3. Réglez le programme de réaction de second tour pour GDH-F2R2 2,10 comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 40 s, recuit à 60 °C pendant 40 s et extension à 72 °C pendant 50 s, avec un allongement final à 72 °C pendant 7 min.
      REMARQUE : Les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau 22, 9, 10.
PathogèneTaille prévue du produit (pb)Séquences d’amorces (5′-3′)Références
Enterocytozoon bieneusi390F1 : GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1 : TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2 : GCTCTGAATATCTATGGCT
R2 : ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1 : GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1 : TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1 : AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1 : AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1 : AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1 : GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2 : GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2 : CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1 : TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1 : ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2 : ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2 : GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1 : AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1 : CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2 : CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2 : GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tableau 2 : Séquences d’amorces pour le gène ITS d’Enterocytozoon bieneusi et les gènes BG, GDH et TPI de Giardia .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Résultats des tests PCR de souris Cryptosporidium, gène ARNr de Blastocystis SSU, gène ITS d’Enterocytozoon bieneusi et gène Giardia BG
Les 95 échantillons fécaux rectaux de souris ont été testés pour le gène ITS d’Enterocytozoon bieneusi à l’aide de deux séries d’amorces, ce qui a donné 5 échantillons positifs pour chaq...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis et Giardia sont des parasites intestinaux zoonotiques courants ; les deux premiers sont classés comme agents pathogènes biologiques de catégorie B par les National Institutes of Health (NIH) des États-Unis, et tous les quatre sont répertoriés par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme 24 des parasites d’origine alimentaire les plus importants dans le monde. Ils peuvent potentiellement infe...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par la Commission provinciale de la santé du Jiangsu (subvention nos. Ym2023024), Projet municipal de recherche médicale de Yancheng (subvention n°. YK2023085) et le Fonds ouvert du Key Laboratory of Pathogenic Microbiology for Emerging and Re-emerging Infectious Diseases (Centre provincial de contrôle et de prévention des maladies du Jiangsu) (PM202402).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose  ;Qingke TechTSJ001
Kit d’extraction par gel QiaquickQiagen  ;28704Kit d’extraction de gel d’ADN
Échelle ADN à 100 pb et plusTransGen  ; BiotechnologieBM311Échelle ADN
Coloration 4S Green Plus Acides NucléiquesBBIA616696-0500Coloration ADN
10 et fois ; Tampon TBESolarbioT1051Tampon d’électrophoréisie
Qubit 4.0Thermohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/spectroscopy-elemental
-isotope-analysis/molecular-spectroscopy/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html ?
ef_id= :G :s& s_kwcid=AL !3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& CID=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Instrument quantitatif de fluorescence
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST ?ID=3040&
TYPE=DÉTAIL		Imageur gel
  ; Mini-kit de selles à ADN rapide pour extraction d’ADNQIAGEN51604Kit d’extraction d’acides nucléiques
ProFlex BaseThermohttps://www.thermofisher.com/
en/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixThermoK1082Amplification PCR & nbsp ;

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