Exploration de l’application de la biodétection basée sur la diffusion Raman améliorée en surface des sEVs individuels dans le diagnostic et la thérapie des maladies

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour analyser les petites vésicules extracellulaires (sEV) individuelles à l’aide de spectroscopie Raman améliorée à surface sans marquage (SERS), permettant un diagnostic des maladies mini-invasifs et une évaluation des sEVs comme vecteurs thérapeutiques de délivrance.

Abstract

Ce protocole décrit une plateforme complète et sans marquage qui intègre la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) avec l’apprentissage automatique (ML) pour détecter et profiler moléculairement les petites vésicules extracellulaires (sEV) individuelles à des fins diagnostiques et thérapeutiques. La méthode commence par l’isolation des sEV utilisant soit la chromatographie d’exclusion de taille, soit l’ultracentrifugation. Des vésicules isolées sont ensuite analysées sur des substrats nanopyramidaux plasmonique en or 2D conçus capables d’une sensibilité à une seule vésicule. En tirant parti des empreintes biochimiques intrinsèques Raman, le protocole permet une détection à haute spécificité sans étiquettes externes. Après l’acquisition spectrale, les données sont prétraitées et analysées à l’aide d’algorithmes entraînés d’apprentissage automatique (par exemple, LDA, SVC) pour classifier les états pathologiques, distinguant ainsi avec succès le cancer gastrique des témoins sains utilisant des sEVs issus des tissus, du plasma et de la salive, avec des précisions de classification respectives de 90,1 %, 70,9 % et 60,7 %. De plus, son application thérapeutique est démontrée par la quantification de la charge en doxorubicine dans des sEVs uniques, une mesure renforcée par l’utilisation de substrats recouverts de graphène comme norme interne. Cette approche permet une analyse à haut débit qui capture l’hétérogénéité des populations essentielle à la détection précoce de la maladie et à la compréhension de l’efficacité du chargement médicamenteux au niveau de la vésicule unique.

Introduction

De petites vésicules extracellulaires (sEV), généralement de 30 à 200 nm de diamètre, sont naturellement sécrétées par les cellules dans des fluides biologiques et transportent des protéines, lipides et acides nucléiques indiquant leur cellule ^{d’origine 1,2,3}. Comme des biomarqueurs non invasifs sont présents dans la salive, l’urine et d’autres fluides^{corporels 4}, ils offrent un potentiel pour un diagnostic précoce de la maladie, un pronostic et un suivi thérapeutique, en particulier en^oncologie....

Protocol

La collecte de spécimens humains a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) de l’UCLA. Tous les donneurs ont donné un consentement éclairé écrit avant leur participation à l’étude.

REMARQUE : Un total de 4 lignées cellulaires, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), toutes achetées auprès d’un vendeur commercial, ont été utilisées dans cette étude. Ces lignées cellulaires étaient cultivées et passées strictement selon les instructions et les réactifs du fabricant. Les milieux conditionnés ét....

Results

La mise en œuvre réussie du protocole SERS à vésicule unique permet de distinguer des spectres Raman distincts des sEVs individuels, permettant une classification diagnostique en aval et un suivi de la charge thérapeutique des médicaments. La figure 1 illustre respectivement le flux de travail de l’étude diagnostique pour le cancer gastrique et de l’application de surveillance des sEVs chargée en médicaments, utilisant notre protocole présenté ici.

Discussion

Un aspect central de ce protocole est la préparation du substrat et la purification du sEV. La performance du SERS sans marquage dépend fortement de la production de substrats plasmoniques uniformes et à haute conconformité, avec un « point chaud » d’amélioration élevé. De même, l’isolation de sEV à haute pureté via chromatographie d’exclusion de taille est essentielle pour rendre des spectres SERS fiables et reproductibles. Des impuretés telles que les agrégats protéiques ou le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196. AP
Grille en cuivre à 300 mailles	Sciences de la microscopie électronique	EMS200-Cu
Solution de paraformodéhyde à 4 %	Sigma Aldrich	1004960700
4&Prime ; Si wafers  ;	MSE Supplies	WA0810	(100) orienté   ;
Lignée cellulaire A549	ATCC	CCL-185  ;
Lignée cellulaire AGS	ATCC	CRL-1739
Rotor centrifugeuse F-35-6-30, 5430	Eppendorf	< fort>22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	Évaporation par faisceau électrique
Solution de gravure cr	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicine  ; D-4000	LC Laboratories	D-4000_3g
Système ExoView R100 et kit ExoView Human Tetraspanin	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
Solution FeCl3	Sigma Aldrich	451649
Solution HF	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int lignée cellulaire	ATCC	CRL-7869
dans le microscope Raman confocal via	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260 ?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solution KOH	Sigma Aldrich	417661
Shakers d’incubation/réfrigération MaxQ 4000 de laboratoire	Thermo Scientific	SHKA4000 (4320)
Incubateur MCO-19AIC	SANYO	8380-30-0035
Filtre Millex-GP	MilliporeSigma	SLGPM33RS	; 0,22 & micro ; m
Microscope NanoSEM 230	FEI	SEM-FEI-014  ;
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/support-produit /nanosight-range/nanosight-ns300
Lignée cellulaire NCI-N87	ATCC	CRL-5822
Ultracentrifugeuse Optima TLX	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ Produits/RIE/Plasmapro-800-RIE
Sphères en polystyrène	Alfa Aesar	< fort>AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
Graphène monocouche	MSE Supplies	ME0408
Flasque T-75	VWR	156800
TF20 EM haute résolution	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solution d’acétate d’uranyle	Sciences de la microscopie électronique	22400-1