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Article de méthode

Exploration de l’application de la biodétection basée sur la diffusion Raman améliorée en surface des sEVs individuels dans le diagnostic et la thérapie des maladies

405 vues

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DOI :

10.3791/69258

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13 mars 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour analyser les petites vésicules extracellulaires (sEV) individuelles à l’aide de spectroscopie Raman améliorée à surface sans marquage (SERS), permettant un diagnostic des maladies mini-invasifs et une évaluation des sEVs comme vecteurs thérapeutiques de délivrance.

Résumé

Ce protocole décrit une plateforme complète et sans marquage qui intègre la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) avec l’apprentissage automatique (ML) pour détecter et profiler moléculairement les petites vésicules extracellulaires (sEV) individuelles à des fins diagnostiques et thérapeutiques. La méthode commence par l’isolation des sEV utilisant soit la chromatographie d’exclusion de taille, soit l’ultracentrifugation. Des vésicules isolées sont ensuite analysées sur des substrats nanopyramidaux plasmonique en or 2D conçus capables d’une sensibilité à une seule vésicule. En tirant parti des empreintes biochimiques intrinsèques Raman, le protocole permet une détection à haute spécificité sans étiquettes externes. Après l’acquisition spectrale, les données sont prétraitées et analysées à l’aide d’algorithmes entraînés d’apprentissage automatique (par exemple, LDA, SVC) pour classifier les états pathologiques, distinguant ainsi avec succès le cancer gastrique des témoins sains utilisant des sEVs issus des tissus, du plasma et de la salive, avec des précisions de classification respectives de 90,1 %, 70,9 % et 60,7 %. De plus, son application thérapeutique est démontrée par la quantification de la charge en doxorubicine dans des sEVs uniques, une mesure renforcée par l’utilisation de substrats recouverts de graphène comme norme interne. Cette approche permet une analyse à haut débit qui capture l’hétérogénéité des populations essentielle à la détection précoce de la maladie et à la compréhension de l’efficacité du chargement médicamenteux au niveau de la vésicule unique.

Introduction

De petites vésicules extracellulaires (sEV), généralement de 30 à 200 nm de diamètre, sont naturellement sécrétées par les cellules dans des fluides biologiques et transportent des protéines, lipides et acides nucléiques indiquant leur cellule d’origine 1,2,3. Comme des biomarqueurs non invasifs sont présents dans la salive, l’urine et d’autres fluidescorporels 4, ils offrent un potentiel pour un diagnostic précoce de la maladie, un pronostic et un suivi thérapeutique, en particulier enoncologie 5,6,7. Cependant, leur traduction clinique est entravée par leur forte hétérogénéité et leur faible abondance dans les matrices biologiquescomplexes 8. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS), une méthode analytique puissante capable d’amplifier la diffusion Raman jusqu’à10, 10-10 11 fois via des substrats plasmoniques9, 10, 11. Le SERS capture les spectres moléculaires intrinsèques « empreintes digitales » des sEVs individuels en quelques secondes, permettant une analyse ultra-sensible à une vésicule unique tout en évitant de longs temps d’analyse.

Notre méthode combine synergiquement les SERS sans étiquette pour obtenir une caractérisation rapide et ultrasensible des SEVindividuels 12, 13, 14, 15, 16. Le SERS sans marque capture les signatures biochimiques intrinsèques et, lorsqu’il est associé à des modèles d’apprentissage automatique comme LDA, SVC, a démontré qu’il distingue les sEVs dérivés de cellules saines de cellules malades avec une hautespécificité 13. Pour améliorer encore la reproductibilité et la capacité quantitative de notre plateforme, notre méthode est entièrement compatible avec les substrats Ramanrecouverts de graphène 16. Le graphène monocouche offre une surface chimiquement uniforme qui stabilise les points chauds plasmoniques et améliore l’adsorptionmoléculaire 17,18, et plus important encore, le graphène monocouche sert de jauge « intégrée » des signauxSERS 12,19, ce qui permet la quantification des molécules détectées. Bien que le diamètre du faisceau laser Raman (~ 1 μm) soit supérieur à celui du sEV typique, notre plateforme atteint une résolution efficace à une seule vésicule grâce à l’interaction unique des mécanismes physiques et statistiques. Le substrat nanopyramidal d’or quasi-périodique génère des « points chauds » plasmoniques hautement localisés de tailles inférieures à 100 nm qui amplifient les signaux Raman de manière superlinéaire 12. En conséquence, le signal provenant du sEV le plus proche du point chaud le plus intense dans le faisceau domine le spectre. De plus, l’imagerie SEM confirme que les sEVs sont bien espacées (> 1 μm les unes des autres), minimisant le chevauchement spectral, tandis que les cartes d’intensité Raman révèlent une localisation du signal correspondant à la taille des vésiculesindividuelles 13,14. Ensemble, ces caractéristiques garantissent que chaque spectre collecté correspond principalement à une seule sEV, permettant une analyse statistiquement robuste et sans étiquetage à vésicule unique. Comparée aux approches conventionnelles, telles que le western blot, la spectrométrie de masse ou la diffusion Raman classique qui nécessitent de grands volumes d’échantillons et ne peuvent pas résoudre les vésiculesuniques 20, notre plateforme SERS à vésicule unique offre une sensibilité, un débit et une résolution moléculaire supérieurs. Ce flux de travail convient aux chercheurs souhaitant développer des outils diagnostiques à haute résolution minimement invasifs ou explorer l’hétérogénéité des sEV et l’efficacité du chargement médicamenteux dans des études thérapeutiques individualisées. Dans ce protocole, nous démontrons comment notre plateforme SERS utilise des sEVs individuels pour permettre la détection de maladies et des applications thérapeutiques, notamment dans le domaine du cancer, y compris l’ensemble du flux de travail d’isolement de vésicules, de préparation du substrat plasmonique, d’acquisition Raman et d’analyse de données par apprentissage automatique.

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Protocole

La collecte de spécimens humains a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) de l’UCLA. Tous les donneurs ont donné un consentement éclairé écrit avant leur participation à l’étude.

REMARQUE : Un total de 4 lignées cellulaires, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), toutes achetées auprès d’un vendeur commercial, ont été utilisées dans cette étude. Ces lignées cellulaires étaient cultivées et passées strictement selon les instructions et les réactifs du fabricant. Les milieux conditionnés étaient collectés et stockés à -20 °C avant d’être traités. Au Samsung Medical Center en Corée, les donneurs ont volontairement contribué à des échantillons de tissu, de plasma et de salive. Le tissu du cancer gastrique a été prélevé lors d’une résection chirurgicale, tandis que des biopsies provenant de témoins non cancéreuses ont été prélevées par endoscopie. Le plasma était prélevé dans des tubes EDTA selon les protocoles cliniques standards. Environ 5 mL de salive entière non stimulée ont été prélevés sur chaque sujet, puis centrifugés à 2 600 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Pour préserver l’ARN extracellulaire, le surnageant a été complété avec un inhibiteur de SUPERase-In RNase à 20 U/mL. Tous les spécimens étaient conservés à -80 °C jusqu’à un traitement supplémentaire. Les sEV ont été isolés à partir de milieux conditionnés et d’échantillons cliniques selon les protocolesétablis 21.

1. Isolation et caractérisation des sEV

  1. Préparez des échantillons de sEV
    1. Décongelez complètement le surnageant de culture cellulaire dégagée à température ambiante.
    2. Faites passer le surnageant à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 μm pour éliminer les débris et les contaminants plus importants.
    3. Équilibrer une colonne de chromatographie à exclusion de taille (SEC) de 35 nm avec une solution PBS de 1×.
    4. Appliquez 500 μL de l’échantillon filtré sur la colonne.
    5. Éluez l’échantillon avec 1x PBS selon les instructions du fabricant.
    6. Collectez les fractions enrichies en EV et stockez-les dans des fioles propres à −20 °C.
  2. Déterminer la concentration et la taille des particules
    1. Diluez les échantillons de sEVs dans des DPBS stériles jusqu’à une concentration finale de 107-10 9 particules/mL.
    2. À l’aide d’un outil de suivi de nanoparticules, enregistrez cinq vidéos de 60 s par échantillon. Utilisez un niveau de caméra à 14 et un débit constant à 25.
    3. Analysez les vidéos avec le logiciel de l’instrument, en appliquant le facteur de dilution pour déterminer la concentration finale de particules (particules/mL) et le diamètre moyen (nm).
  3. Caractériser l’expression de la tétraspanine
    1. Des puces de tétraspanine humaine pré-scan (1 cm × 1 cm, pré-recouvertes d’anti-CD9, anti-CD63 et anti-CD81) pour établir un signal de référence.
    2. Chargez des échantillons de sEV dilués sur les puces dans une plaque scellée à 24 puits et incubez toute la nuit à température ambiante.
    3. Ajoutez 35 μL d’anticorps de détection (anti-CD9 CF488, anti-CD63 CF647, anti-CD81 CF555) et incubez pendant 1 heure à température ambiante.
    4. Lavez les puces selon le protocole du fabricant.
    5. Mesurer l’expression vésiculaire de la tétraspanine à l’aide d’un lecteur de caractérisation de biomarqueurs et de son logiciel de balayage associé.
  4. Confirmer la morphologie du sEV avec le TEM
    1. Fixez des sEVs de ~100 μL avec ~100 μL de paraformoldéhyde à 4 % pendant 30 minutes.
    2. Chargez environ 100 μL de sEVs fixes sur des grilles en cuivre de 300 mailles et incubez pendant 5 minutes.
    3. Rincez les grilles avec de l’eau déionisée.
    4. Colorez les grilles avec une solution à 1 % d’acétate d’uranyle (~ 20 μL) dans de l’eau distillée.
    5. Effectuez un dernier rinçage à l’eau et laissez les grilles sécher complètement à l’air.
    6. Imagez les échantillons par microscopie électronique de transmission (TEM) pour confirmer la taille et la morphologie du sEV.

2. Fabrication de substrats plasmoniques SERS 12,18,19

  1. Créer une monocouche de nanosphère
    1. Étalez des sphères de polystyrène de 500 nm de diamètre sur une surface d’eau à l’intérieur d’une abreuve de Langmuir-Blodgett.
    2. Comprimer doucement les sphères pour former une monocouche hexagonale compacte.
    3. Transférez la monocouche de sphère sur une plaquette de Si de 4 pouces (avec un SiO thermique2 de ~50 nm) en plongeant la plaquette dans la creuse et en la tirant lentement vers le haut.
  2. Réseau de nanosphères d’Etch
    1. Réduire le diamètre de la sphère de 500 nm à ~250 nm à l’aide d’un système de gravure ionique réactive avec plasma d’oxygène (débit de gazO2 à 100 sccm, 50 s, 200 W de puissance). Pour plus de détails sur le processus de fabrication, veuillez consulter la publication de notre travailprécédent 12, 18, 19.
    2. Déposez une couche de Cr de 50 nm sur le réseau de sphères rétrécies par évaporation par faisceau d’électrons à 1,5 Å par s.
    3. Soulevez les sphéros de polystyrène en utilisant de l’acétone pour laisser un masque Cr perforé sur la surface deSiO 2 .
    4. Gravez la couche deSiO 2 exposée dans les ouvertures Cr avec un mélange de 25 sccm Ar, 25 sccm CHF3, avec une puissance RIE à 200W pendant 2 minutes.
  3. Fabrication de pyramides inversées
    1. Immergez la plaquette dans un KOH à 60 % en poids à 60 °C pendant 2 minutes pour graver des fosses pyramidales inversées dans le silicium.
    2. Retirez le masque Cr avec un Crchant pendant 5 minutes.
    3. Retirez la couche deSiO 2 avec un graveur d’oxyde tamponné 6:1 jusqu’à ce que ce soit complètement dégagé.
    4. Déposez un film Au de 200 nm de manière conforme sur les pyramides inversées en utilisant l’évaporation par faisceau d’électrons.
  4. Finaliser le substrat plasmonique
    1. Appliquez de l’époxy à durcissement rapide (~1 mL) sur un substrat séparé deSiO 2/Si. Pressez la plaquette revêtue d’or sur l’époxy pour former une structure sandwich avec la couche dorée au centre.
    2. Décollez l’époxy du moule en silicium pour former un substrat Au plasmonique autonome après que l’époxy ait complètement durci.

3. Transfert de graphène vers un substrat plasmonique

  1. Préparez le film de graphène
    1. Préparez une solution de 1 M de FeCl3 (une solution de 1 M de chlorure ferrique anhydre a été préparée en dissolvant 81 g deFeCl 3 dans de l’eau déionisée et en la diluant jusqu’à un volume final de 500 mL) pour graver le substrat de cuivre à partir d’une feuille de graphène monocouche recouverte de PMMA.
    2. Placez la feuille de cuivre recouverte de graphène face cachée sur la surface de la solution de FeCl3 jusqu’à ce que le cuivre soit complètement dissous.
  2. Rinçage du film de graphène
    1. À l’aide d’une lame en verre propre, transférez soigneusement le film de graphène flottant dans un bain-marie déionisé pour rincer les résidus de gravure.
    2. Répétez cette étape de rinçage trois fois.
  3. Transférer le graphène au substrat
    1. Faites flotter le substrat plasmonique SERS sous le film de graphène dans le bain mariée DI final.
    2. Soulevez doucement le substrat pour que le graphène se dépose uniformément sur sa surface.
    3. Sécher à l’air libre le substrat recouvert de graphène à température ambiante pendant 1 heure.
    4. Transférez-le dans une chambre à vide et laissez-le sécher à pression réduite à 180 °C pendant 1 heure.
  4. Nettoyage du substrat final
    1. Immergez le substrat séché dans un bain d’acétone à 50 °C pendant 1 h pour dissoudre le PMMA.
    2. Rincez le substrat trois fois avec de l’alcool isopropylique.
    3. Séchez le substrat plasmonique transféré au graphène nettoyé dans un dessiccateur avant utilisation.

4. Préparation d’échantillons SERS et acquisition de spectres

  1. Préparer l’échantillon sur le substrat
    1. Pipeter environ 5 μL de l’échantillon de sEV sur le substrat plasmonique approprié.
      REMARQUE : Pour la quantification des sEVs chargés en médicaments, appliquez des vésicules sur le substrat or-graphène. Pour toutes les autres expériences, utilisez un substrat plasmonique doré uni.
    2. Placez le substrat dans un dessiccateur et laissez la gouttelette sécher complètement (~15 min).
  2. Système Raman de calibration
    1. Transférez le substrat dans un microscope Raman confocal.
    2. Initiez la collecte de données à l’aide du logiciel de l’instrument (WiRE version 4.4).
    3. Réglez le laser d’excitation à 785 nm à 5 mW.
    4. Calibrez le système en alignant le pic de référence du silicium à 520 cm-1.
  3. Acquérir des spectres à partir d’un substrat doré (diagnostic)
    1. Effectuer un scan de reconnaissance sur une zone de 300 μm × 300 μm pour localiser des vésicules individuelles en mode statique avec les réglages suivants : 50 % de puissance, exposition de 0,1 s, pas de 10 μm.
    2. Après avoir localisé les sEV, effectuez une cartographie haute résolution en mode statique sur une grille de 5 × 5 en utilisant les réglages suivants : taille de pas de 1 μm, puissance de 50 %, exposition de 0,2 s par point.
  4. Acquérir des spectres à partir d’un substrat de graphène (thérapeutiques)
    1. Effectuer un scan de reconnaissance sur une zone de 300 μm × 300 μm pour localiser des vésicules individuelles en mode statique avec les réglages suivants : puissance laser à 50 %, exposition 0,1 s, pas de 10 μm.
    2. Effectuer une cartographie haute résolution en mode étendu avec une grille de 2 × 2 en utilisant les réglages suivants : pas de 1 μm, puissance laser de 1 %, exposition de 10 s.

5. Prétraitement des données

  1. Effectuer le contrôle spectrale de la qualité
    1. Criblez les spectres bruts initiaux pour exclure les signaux très bruyants ou les spectres présentant des formes anormales.
    2. Supprimer les pics isolés de rayons cosmiques en utilisant une détection basée sur le seuil ou un filtrage par déviation locale.
  2. Filtrer et normaliser les spectres
    1. Appliquez un filtre Savitzky-Golay à chaque spectre pour réduire le fond de fluorescence et lisser les données.
    2. Calculez le rapport signal/bruit (SNR) de chaque spectre, généralement en utilisant soit la méthode du rapport pic/ligne de base, soit la méthode de l’écart-type. Pour expliquer davantage, le SNR pour chaque spectre était généralement calculé comme le rapport entre l’intensité maximale (après soustraction de base) dans une bande Raman représentative et l’écart-type du bruit. Le bruit a été estimé à partir du spectre résiduel obtenu en soustrayant une version lissée par Savitzky-Golay du spectre (taille de la fenêtre = 11, ordre polynomial = 3) du spectre original, isolant ainsi les fluctuations des hautes fréquences. Pour déterminer empiriquement un seuil de SNR approprié, tous les spectres ont été classés par ordre croissant de SNR, et la persistance des pics biochimiques caractéristiques – en particulier la bande de phénylalanine (~1002 cm-1 , acide aminé), la bande amide I (~1650 cm-1 , protéine) et la bande de déformationCH-2 (~1440 cm-1 , lipides) – a été évaluée sur les spectres classés. Le seuil était fixé au point où chacun de ces pics diagnostiques disparaissait systématiquement dans le bruit de base. Pour notre substrat SERS en nanopyramide d’or et nos paramètres d’acquisition (excitation 785 nm, puissance laser de 5 mW, intégration de 0,2 s), cela correspondait empiriquement à un seuil SNR de 28.
    3. Excluez tout spectre qui se situe en dessous du seuil du SNR tel que décidé selon la 5.2.2 ci-dessus. Dans notre flux de travail, les spectres avec un SNR inférieur à 28 ont été exclus de l’ensemble de données d’entraînement, car fixer le seuil à ce niveau garantit que seuls des spectres de haute qualité sont conservés pour l’analyse en aval et l’amélioration de la robustesse du modèle.
    4. Normalisez chaque spectre soit à l’intensité maximale de pointe, soit à la surface totale sous la courbe.

6. Analyse spectrale avec apprentissage automatique

  1. Entraîner le modèle
    1. Attribuez une étiquette à chaque mesure spectrale correspondant à son origine (par exemple, patient atteint d’un cancer gastrique vs. témoins sain).
    2. Entrer les données spectrales dans un classificateur de vecteurs de support (SVC) avec un noyau linéaire.
    3. Utilisez un split stratifié pour une validation croisée en 5 parties.
    4. Moyennez les métriques de précision de chaque pli pour évaluer la performance du modèle.
  2. Réduire la dimensionnalité et classifier
    1. Utilisez l’analyse discriminante linéaire (LDA) pour visualiser des données SERS de haute dimension en dimensions réduites.
    2. Utilisez le modèle LDA pour une classification directe entre groupes d’échantillons.
  3. Évaluer le modèle
    1. Évaluer les modèles entraînés sur un ensemble de patients aveugles pour simuler un scénario diagnostique réel. Pour plus d’informations, veuillez consulter ces publications de notre groupe13, 15, 22.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes avec des outils propres dans un environnement sans poussière. Le graphène monocouche a été cultivé ou extrait sur un substrat en cuivre et recouvert d’une couche de PMMA pour le protéger lors du transfert.

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Résultats

La mise en œuvre réussie du protocole SERS à vésicule unique permet de distinguer des spectres Raman distincts des sEVs individuels, permettant une classification diagnostique en aval et un suivi de la charge thérapeutique des médicaments. La figure 1 illustre respectivement le flux de travail de l’étude diagnostique pour le cancer gastrique et de l’application de surveillance des sEVs chargée en médicaments, utilisant notre protocole présenté ici.

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Discussion

Un aspect central de ce protocole est la préparation du substrat et la purification du sEV. La performance du SERS sans marquage dépend fortement de la production de substrats plasmoniques uniformes et à haute conconformité, avec un « point chaud » d’amélioration élevé. De même, l’isolation de sEV à haute pureté via chromatographie d’exclusion de taille est essentielle pour rendre des spectres SERS fiables et reproductibles. Des impuretés telles que les agrégats protéiques ou le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette œuvre.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Center for Advancing Translational Sciences des National Institutes of Health sous les numéros de subvention 4UH3TR002978-03 et 1U18TR003778-01, ainsi que par une subvention du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (Grant Number TRAN1-14649).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Grille en cuivre à 300 maillesSciences de la microscopie électroniqueEMS200-Cu
Solution de paraformodéhyde à 4 %Sigma Aldrich1004960700
4&Prime ; Si wafers  ;MSE SuppliesWA0810(100) orienté   ;
Lignée cellulaire A549ATCCCCL-185  ;
Lignée cellulaire AGSATCCCRL-1739
Rotor centrifugeuse F-35-6-30, 5430Eppendorf< fort>22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Évaporation par faisceau électrique
Solution de gravure crSigma Aldrich651826-500ML
Doxorubicine  ; D-4000LC LaboratoriesD-4000_3g
Système ExoView R100 et kit ExoView Human TetraspaninNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Solution FeCl3Sigma Aldrich451649
Solution HFSigma Aldrich695068-500ML
Hs 738.St/Int lignée cellulaireATCCCRL-7869
dans le microscope Raman confocal viaRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260 ?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solution KOHSigma Aldrich417661
Shakers d’incubation/réfrigération MaxQ 4000 de laboratoireThermo ScientificSHKA4000 (4320)
Incubateur MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtre Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  ; 0,22 & micro ; m
Microscope NanoSEM 230FEISEM-FEI-014  ;
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/support-produit
/nanosight-range/nanosight-ns300
Lignée cellulaire NCI-N87ATCCCRL-5822
Ultracentrifugeuse Optima TLXBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
Produits/RIE/Plasmapro-800-RIE
Sphères en polystyrèneAlfa Aesar< fort>AA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Graphène monocoucheMSE SuppliesME0408
Flasque T-75VWR156800
TF20 EM haute résolutionFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solution d’acétate d’uranyleSciences de la microscopie électronique22400-1

Références

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