Le jaune de carthame hydroxyle A (HSYA) atténue l’arthrose du genou en améliorant l’autophagie et la prolifération des chondrocytes tout en supprimant l’apoptose et l’inflammation via l’inhibition de la voie HIF-1α/BNIP3.
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Article de recherche
Le jaune de carthame hydroxyle A (HSYA) atténue l’arthrose du genou en améliorant l’autophagie et la prolifération des chondrocytes tout en supprimant l’apoptose et l’inflammation via l’inhibition de la voie HIF-1α/BNIP3.
La réduction de l’autophagie dans le tissu cartilagineux est étroitement liée au développement de l’arthrose du genou (KOA), mais les mécanismes par lesquels l’hydroxyle carthame jaune A (HSYA) exerce des effets protecteurs restent incomplètement compris. Dans cette étude, les chondrocytes KOA humains ont été isolés et assignés à différents groupes de traitement, y compris le contrôle normal, le modèle à blanc, le HSYA, l’inhibiteur du facteur 1α induit par l’hypoxie (HIF-1α), l’inducteur de l’autophagie, le HSYA combiné à l’inhibiteur de HIF-1α et le HSYA combiné à l’inducteur de l’autophagie. Les cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α, IL-6) ont été quantifiées par ELISA, l’expression protéique de HIF-1α, BNIP3 et les marqueurs liés à l’autophagie a été examinée par Western blot, et les vésicules autophagiques dans les mitochondries ont été évaluées à l’aide de la coloration monodansylcadavérine et de la microscopie électronique à transmission. Par rapport au témoin normal, le groupe modèle à blanc a montré une augmentation significative des niveaux d’IL-1β, de TNF-α, d’IL-6 et de HIF-1α, accompagnée de taux d’apoptose plus élevés, d’une prolifération réduite et d’une régulation négative des protéines liées à l’autophagie (P < 0,05). Le traitement par HSYA, inhibiteur de HIF-1α ou inducteur d’autophagie a significativement régulé à la hausse l’expression des protéines liées à l’autophagie et réduit les niveaux de cytokines inflammatoires. De plus, HSYA combiné à un inhibiteur de HIF-1α ou à un inducteur d’autophagie a produit les effets les plus prononcés, avec des réductions marquées de la libération de cytokines et de l’apoptose, ainsi qu’une prolifération accrue des chondrocytes et la formation de vésicules autophagiques mitochondriales (P < 0,05). Ces résultats démontrent que HSYA exerce des effets chondroprotecteurs dans les KOA, au moins en partie, par l’inhibition de la voie HIF-1α/BNIP3, favorisant ainsi l’autophagie et atténuant les lésions inflammatoires dans les chondrocytes.
En tant que maladie orthopédique chronique répandue, l’arthrose du genou (KOA) touche les personnes d’âge moyen et les personnes âgées, ce qui a un impact significatif sur leur qualité devie1,2. Malgré sa présence généralisée, l’étiologie précise et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à l’KOA restent incomplètement compris. De plus, tant pour la prévention que pour le traitement curatif, souligne l’urgence de démêler les fondements pathologiques complexes de cette maladie. Un domaine d’intérêt émergent est le rôle de l’autophagie dans l’homéostasie du cartilage, avec des preuves de plus en plus nombreuses suggérant qu’une autophagie réduite dans le tissu cartilagineux contribue à sa dégénérescence dans le KOA 3,4.
L’autophagie, un processus de dégradation cellulaire vital pour le maintien de l’homéostasie cellulaire, est d’une grande importance dans l’entretien et la réparation du cartilage. Dans le microenvironnement hypoxique qui prévaut dans le cartilage articulaire, la voie de signalisation du facteur 1α inductible par l’hypoxie (HIF-1α)/adénovirus E1B 19 kDa (BNIP3) apparaît comme un régulateur essentiel de l’autophagie. Une expression élevée de HIF-1α a été observée chez les patients atteints de KOA, ce qui suggère qu’une dérégulation de cette voie peut contribuer à une altération de l’autophagie et à la dégénérescence ultérieure du cartilage 5,6,7.
L’acupuncture, la moxibustion, les herbes et le massage sont quatre méthodes classiques de la médecine traditionnelle chinoise pour traiter l’arthrite du genou. Les traitements actuels, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les injections d’acide hyaluronique et l’arthroplastie, se sont avérés utiles mais également associés à certains effets secondaires8. De plus, il n’existe pas de traitement de routine recommandé pour l’arthrose du genou. Au fil du temps, en tant que thérapie complémentaire courante pour le KOA, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a développé de nombreux remèdes à base de plantes qui sont prometteurs dans le traitement du KOA9. Parmi ceux-ci, l’hydroxyle carthame jaune A a suscité une attention considérable en raison de ses propriétés anti-inflammatoires et modulatrices de l’autophagie10,11. Cependant, les mécanismes exacts par lesquels HSYA exerce son influence thérapeutique sur l’arthrose du genou (KOA), notamment en termes de régulation de l’autophagie par la voie HIF-1α/BNIP3, restent incertains. Par conséquent, nous étudions le mécanisme des effets thérapeutiques de HSYA dans le KOA en nous concentrant sur son impact sur l’autophagie des chondrocytes et son interaction avec la voie HIF-1α/BNIP3. Nous émettons l’hypothèse que l’HSYA atténue l’arthrose du genou en améliorant l’autophagie et la prolifération des chondrocytes tout en supprimant l’apoptose et l’inflammation via l’inhibition de la voie HIF-1α/BNIP3.
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Toutes les procédures impliquant des échantillons humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire central de Zhanjiang (approbation n°. KY-YS-2021-09). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant le prélèvement de l’échantillon. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Patients et conception de l’étude
Une trentaine de patients diagnostiqués avec une arthrose du genou (AOK) et subissant une arthroplastie totale du genou ont été recrutés. La cohorte comprenait 14 hommes et 16 femmes, âgés de 52 à 75 ans (moyenne ± ET : 64,3 ± 12,6 ans), tous répondant au critère12 de l’American College of Rheumatology KOA. Les patients ont été exclus s’ils avaient reçu des anti-inflammatoires non stéroïdiens ou des stéroïdes dans les 2 semaines précédant la chirurgie ou des injections intra-articulaires dans un délai d’un mois.
2. Culture primaire de chondrocytes
Le cartilage articulaire a été prélevé dans des conditions stériles immédiatement après l’opération et placé dans du PBS froid. À l’aide de scalpels stériles, le cartilage a été coupé en fragments de ~1 mm³ sur une plaque de verre glacée et transféré dans un tube à centrifuger de 50 mL contenant 10 mL de trypsine-EDTA à 0,25 %. Le tube a été incubé dans un bain-marie à 37 °C à 80 tr/min pendant 30 min et inversé doucement toutes les 5 minutes pour faciliter la digestion. Le surnageant a été aspiré et la pastille de tissu a été lavée une fois avec du PBS et centrifugée à 200 × g pendant 5 min. La pastille a ensuite été remise en suspension dans 10 mL de collagénase de type II à 0,02 % et digérée à 37 °C pendant 4 h en agitant la machine. La suspension a été pipetée de haut en bas toutes les 30 minutes pour favoriser la dissociation, passée dans une crépine de 70 μm et centrifugée à nouveau à 200 × g pendant 5 min. La pastille résultante a été remise en suspension dans du DMEM enrichi de 10 % de FBS, de 100 U/mL de pénicilline et de 100 μg/mL de streptomycine, puis ensemencée dans des flacons T25. Les cellules ont été incubées à 37 °C avec 5 % de CO2, le milieu a été remplacé tous les 2-3 jours et les cellules des passages 1-2 ont été utilisées pour les expériences. Les groupes expérimentaux comprenaient le contrôle normal, le modèle à blanc, le HSYA (100 μmol/L), l’inhibiteur de HIF-1α YC-1 (10 μmol/L), la rapamycine (10 nmol/L), le HSYA + YC-1 et le HSYA + rapamycine.
3. HIF-lα médié par siRNA, knockdown BNIP3
Les chondrocytes primaires ont été ensemencés dans des plaques à 6 puits à 2-5 × 10à 5 cellules par puits et cultivés à 37 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 30 à 50 %. Pour chaque puits, 5 μL de siRNA de 20 μM ont été dilués dans 250 μL d’Opti-MEM, et 5 μL de réactif de transfection à base de lipides ont été dilués séparément dans 250 μL d’Opti-MEM. Les deux solutions ont été délicatement mélangées et incubées à température ambiante pendant 15 à 20 minutes pour former des complexes. Le milieu de culture a été remplacé par 1,5 mL de DMEM frais avec 10 % de FBS, et le complexe siRNA-lipide (500 μL) a été ajouté goutte à goutte le long de la paroi du puits en tourbillonnant doucement. Les cellules ont été incubées pendant 6 h, le milieu a été remplacé par un milieu complet et la culture a été poursuivie pendant 48 à 72 h. L’efficacité de l’inactivation a été vérifiée par qRT-PCR et Western blot avant d’autres traitements.
4. L’ELISA
Des surnageants de culture cellulaire ont été recueillis, centrifugés à 200 × g pendant 5 minutes et dilués 1:2 dans un tampon de dosage si nécessaire. Des kits ELISA pour l’IL-1β, le TNF-α et l’IL-6 ont été utilisés conformément au protocole du fabricant. Les étalons, les blancs et les échantillons ont été analysés en trois exemplaires. Après la réaction du substrat, l’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques dans les 15 minutes.
5. Dosage MTT
Les chondrocytes ont été ensemencés dans des plaques de 96 puits à 5 000 cellules/puits dans 100 μL de milieu complet et incubés pendant 0 h, 24 h, 48 h ou 72 h. À chaque point temporel, 20 μL de solution de MTT (5 mg/mL dans du PBS) ont été ajoutés directement dans chaque puits, et les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 30 minutes jusqu’à ce que des cristaux de formazan violets deviennent visibles au fond des puits. Le surnageant a été aspiré avec précaution sans perturber les cristaux, 150 μL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été placées sur un agitateur à 100 tr/min pendant 10 minutes pour dissoudre complètement les cristaux. L’absorbance a été mesurée à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Le temps d’incubation court a été choisi pour éviter la saturation du signal dans les cellules hautement métaboliquement actives.
6. Cytométrie en flux
Les cellules ont été récoltées par trypsinisation, centrifugées à 200 × g pendant 5 minutes et lavées deux fois avec du PBS froid. Ils ont été remis en suspension dans 500 μL de tampon de liaison à ~1 × 106 cellules/mL, et 5 μL d’Annexine V-FITC et 5 μL de PI ont été ajoutés. Après un mélange doux, les cellules ont été incubées pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux, avec au moins 10 000 événements collectés par échantillon (excitation 488 nm, émission FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Les cellules apoptotiques ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel standard.
7. Transfert Western
Les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS froid et lysées dans un tampon RIPA de 200 μL contenant des inhibiteurs de protéase sur de la glace pendant 30 min. Les cellules ont été grattées à l’aide d’un grattoir en plastique, pipetées de haut en bas pour réduire la viscosité et centrifugées à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Des surnageants ont été prélevés et les concentrations de protéines ont été mesurées à l’aide du dosage de l’ACB. Des quantités égales de protéines (30 μg) ont été mélangées avec un tampon de charge de 5×, chauffées à 95 °C pendant 5 minutes et séparées sur des gels SDS-PAGE de 10 % à 12 %. L’électrophorèse a été exécutée à 80 V pour l’empilement et à 120 V pour la séparation, et les protéines ont été transférées sur des membranes PVDF à 300 mA pendant 90 min. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 h à température ambiante et incubées pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires (1:1 000). Après trois lavages avec du TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (1:5 000) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées avec un substrat ECL et imagées à l’aide d’un système de détection par chimiluminescence avec une exposition de 30 à 120 s. Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide d’ImageJ, et GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge.
8. Coloration à la monodansylcadavérine (MDC)
Une solution de travail de MDC de 50 μM a été préparée à partir de la solution mère immédiatement avant utilisation. Les cellules ont été fixées avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min à température ambiante, lavées deux fois avec du PBS et incubées avec une solution de travail de 500 μL de MDC pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité. Après deux lavages au PBS, les lamelles ont été montées avec un milieu de montage anti-décoloration et observées au microscope à fluorescence (excitation 355 nm, émission 512 nm).
9. Microscope électronique à transmission (MET)
Les cellules ont été récoltées et granulées par centrifugation à 200 × g pendant 5 min, puis fixées dans du glutaraldéhyde à 2 % à 4 °C pendant la nuit. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune et post-fixés dans du tétroxyde d’osmium à 1 % pendant 1 h à 4 °C dans une hotte. La déshydratation a été effectuée à l’aide d’une série graduée d’acétone de 30 %, 50 %, 70 %, 90 % et 100 % pendant 10 minutes chacune. Les échantillons ont été infiltrés avec de la résine acétone/époxy 1:1 pendant 1 h, puis avec de la résine pure pendant la nuit. L’enrobage a été réalisé dans de la résine fraîche et polymérisé à 60 °C pendant 48 h. Des sections ultraminces de 50 à 70 nm ont été découpées à l’aide d’un ultramicrotome, montées sur des grilles de cuivre de 200 mailles, colorées avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 30 minutes puis du citrate de plomb pendant 15 minutes, lavées à l’eau distillée, séchées à l’air libre et examinées au microscope électronique à transmission à 80 kV. Par mesure de sécurité, le glutaraldéhyde et le tétroxyde d’osmium sont toxiques et volatils et ne doivent être manipulés que dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection. Les déchets doivent être éliminés dans des contenants dangereux désignés conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement.
10. Analyse statistique
Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. La signification statistique a été évaluée à l’aide d±'une ANOVA à un facteur suivie d’un test post-hoc de la DNS, le P < 0,05 étant considéré comme significatif.
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Effet de HSYA sur l’expression des cytokines pro-inflammatoires des chondrocytes (IL-1β, TNF-α, IL-6)
Par rapport au groupe témoin normal, tous les autres groupes présentaient des taux significativement élevés de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α et IL-6) (P < 0,05, tableau 1, figure 1A-G). Le traitement par HSYA, inhibiteur de HIF-1α, inducteur d’autophagie, inhibiteur de HSYA + HIF-1α ou HSYA + inducteur d’a...
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L’arthrose, une maladie chronique très répandue, altère considérablement la qualité de vie des patients. Parmi les différents sous-types d’arthrose, la KOA est la plus courante, contribuant à la charge mondiale de morbidité. Malgré sa forte incidence, l’étiologie précise et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents de la KOA restent insaisissables. L’interaction complexe entre les processus mécaniques et biochimiques au sein du cartilage articulaire, en particulier la régulation de...
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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Ce travail a été soutenu par le Bureau de médecine traditionnelle chinoise de la province du Guangdong
(Subvention n° 20221446).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 % de tétroxyde d’osmium | Sciences de la microscopie électronique | 19150 | Autres corrections et colorations pour l’analyse TEM |
| 2 % de glutaraldéhyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Fixe les cellules pour la préparation d’échantillons TEM |
| 4 % de paraformaldéhyde | Servicebio | G1101 | Corrige les cellules pour la coloration MDC et la préparation des échantillons TEM |
| AG1478 | Selleck Corporation | S1005 | Injection intraveineuse de 20 mg/kg, inhibiteur de la kinase récepteur ErbB dans le modèle de rat |
| Kit de détection d’apoptose Annexin V-FITC/PI | Biomarécage | BS3030 | Coloration des cellules apoptotiques pour la détection par cytométrie en flux |
| Inducteur d’autophagie (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Rapamycine, inducteur d’autophagie, utilisé à 10 nmol/L dans les expériences sur les chondrocytes |
| Anticorps de Beclin1 | Santa Cruz Biotechnologie | SC-48341 | Anticorps principal pour la détection par Western blot de la protéine liée à l’autophagie Beclin1 |
| Anticorps BNIP3 | Santa Cruz Biotechnologie | SC-517348 | Anticorps principal pour la détection du Western blot de BNIP3 |
| Incubateur à dioxyde de carbone | Yiheng | BPN-150CW | pour la culture cellulaire |
| Diméthyl Sulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Dissout les cristaux de formazan dans le dosage MTT |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Milieu de culture cellulaire, complété avec 10 % de FBS pour la culture des chondrocytes |
| Lecteur de microplaques ELISA | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | Mesure les valeurs OD dans les tests ELISA et MTT |
| Réactif à chimiluminescence améliorée (ECL) | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Visualise les bandes protéiques dans le Western blot |
| Résine époxy (EPON812) | Sciences de la microscopie électronique | 14120 | Échantillons d’intégration pour le coupement TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Sérum bovin fœtal, ajouté au DMEM pour la nutrition des chondrocytes |
| Cytomètre en flux | Beckman (mentionné pour apoptose) | CytoFLEX S | Détecte le taux d’apoptose des chondrocytes et les marqueurs cellulaires |
| Fluorescence Microscope | Olympe | IX73 | Observe des vésicules autophagiques colorées à MDC |
| Système d’imagerie sur gel | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Capture et quantifie les bandes protéiques issues du Western blot |
| HIF-1 & alpha ; Anticorps | Santa Cruz Biotechnologie | SC-13515 | Anticorps principal pour la détection par Western blot de HIF-1 et alpha ; |
| HIF-1 & alpha ; inhibiteur (YC-1) | Selleck Corporation | S1047 | HIF-1 & alpha ; inhibiteur de voies, utilisé à 10 et mu ; Mol/L dans les expériences cellulaires |
| Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse | Eppendorf | 5430R | Utilisé pour séparer les composants |
| Anticorps secondaire conjugué à HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Se lie aux anticorps primaires pour l’amplification du signal dans le Western blot |
| IL-1 & bêta ; ELISA Kit | Biologie du Shenggong | C5236 | Quantifie IL-1 et bêta ; niveaux chez les surnadants cellulaires via ELISA |
| IL-6 ELISA Kit | Biologie du Shenggong | C5237 | Quantifie les niveaux d’IL-6 chez les surnadants cellulaires via ELISA |
| Anticorps LC3 | Santa Cruz Biotechnologie | SC-398822 | Anticorps principal pour la détection par Western blot de la protéine LC3 liée à l’autophagie |
| Réactif lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | Réactif de transfection à base de lipides pour la tansfection |
| Monodansylcadavérine (MDC) | Sigma-Aldrich | D4008 | 0,05 mol/L, colorant les vésicules autophagiques pour la microscopie de fluorescence |
| Réactif MTT | Beyotime | C0009 | 0,5 mg/mL, utilisé dans le test MTT pour évaluer la prolifération des chondrocytes |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | déterminer la concentration d’ARN |
| NRG1 ELISA Kit | Abcam (Royaume-Uni) | ab213961 | Mesure la concentration de NRG1 dans les tissus cardiaques via ELISA |
| Anticorps P62 | Santa Cruz Biotechnologie | SC-28359 | Anticorps principal pour la détection par Western blot de la protéine liée à l’autophagie P62 |
| Anticorps phosphorylé ErbB4 (p-ErbB4) | Affinité | AF3445 | Anticorps principal pour la détection par Western blot de l’ErbB4 activé |
| Kit de réactifs PrimeScript RT | Takara | RR047A | Transcription inversée de l’ARN pour fournir des modèles pour l’expérience qPCR |
| Système de PCR quantitative en temps réel | Bio-Rad | CFX96 | pour la détection RT-PCR |
| NRG1 humain recombinant (rh-NRG1) | R& Systèmes D | 396-HB | Injection intraveineuse de 5 mg/kg pour activer la voie NRG1/ErbB4 dans le modèle rat |
| Tampon RIPA | Meilunbio | MA0151 | Tampon de lyse avec inhibiteurs de protéases/phosphatases pour l’extraction des protéines |
| Jaune de carthame A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Composant bioactif de Carthamus tinctorius L., utilisé à 100 & mu ; mol/L pour le traitement des chondrocytes |
| Équipement SDS-PAGE | Bio-Rad | Tétra mini-PROTEAN | Sépare les protéines par poids moléculaire dans Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | pour l’expérience qPCR |
| TNF-& alpha ; ELISA Kit | Biologie du Shenggong | C5238 | Quantifie TNF-& alpha ; niveaux chez les surnadants cellulaires via ELISA |
| Anticorps total ErbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Anticorps principal pour la détection par Western blot de l’ErbB4 total |
| Microscope électronique à transmission (TEM) | Hitachi (mentionné pour les vésicules autophagiques) | H-7650 | Observe les vésicules autophagiques dans les mitochondries au niveau ultrastructurel |
| Réactif Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | pour l’extraction d’ARN |
| Trypsine-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | Utilisé pour la digestion enzymatique du cartilage articulaire afin d’isoler les chondrocytes |
| Collagénase de type II (0,02 %) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Digère le tissu cartilagineux pour l’isolement des chondrocytes |
| Anticorps &bêta ;-caténine | Santa Cruz Biotechnologie | SC-7963 | Anticorps de référence interne pour la normalisation de Western blot |
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