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Article de recherche

Le granule de Ganzhirong inhibe la gluconéogenèse hépatique via l’axe SIRT3-MPC1-PC/PDH dans le diabète de type 2

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DOI :

10.3791/69500

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12 décembre 2025

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude a examiné si le granule de Ganzhirong améliore l’hyperglycémie dans le diabète de type 2 en inhibant la gluconéogenèse hépatique via l’axe SIRT3-MPC1-PC/PDH.

Résumé

Le diabète sucré de type 2 (DT2DM) est un trouble métabolique global caractérisé par une résistance hépatique à l’insuline et une gluconéogenèse excessive. Le granule de Ganzhirong (GZRG), une formule de médecine traditionnelle chinoise, a montré un potentiel pour gérer le DT2, mais ses mécanismes sous-jacents, notamment concernant la gluconéogenèse hépatique, restent incertains. Cette étude a examiné si le GZRG améliore l’hyperglycémie en modulant la voie de signalisation médiée par SIRT3. Les effets antidiabétiques du GZRG ont été évalués chez des souris T2DM induites par un régime riche en graisses (HFD) et des cellules HepG2 résistantes à l’insuline induites par les acides gras libres (FFA). Les paramètres métaboliques, la tolérance au glucose et au pyruvate, la sensibilité à l’insuline et les profils lipidiques ont été évalués. Les mécanismes moléculaires ont été explorés par la surexpression et la réduction de SIRT3, en examinant l’expression de protéines clés (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 et G6Pase) dans la voie gluconéogénique. Le traitement par GZRG a significativement atténué l’hyperglycémie, augmenté la sensibilité à l’insuline et amélioré le métabolisme lipidique chez les souris DT2DM et les cellules HepG2 résistantes à l’insuline (IR). Elle atténuait la stéatose hépatique et supprimeait la gluconéogenèse. Sur le plan mécanique, GZRG a réduit l’expression de SIRT3, ce qui a conduit à des réductions concomitantes des niveaux de MPC1 et de PC ainsi qu’à une augmentation de PDH-E2. Ce changement d’expression protéique a détourné le métabolisme du pyruvate loin de la gluconéogenèse. La surexpression de SIRT3 a inversé les effets suppressifs du GZRG sur la gluconéogenèse, tandis que le knockdown de SIRT3 a synergisé avec le GZRG. GZRG soulage la DT2DM en inhibant la gluconéogenèse hépatique via l’axe SIRT3-MPC1-PC/PDH. Ces découvertes éclairent un mécanisme moléculaire nouveau du GZRG et mettent en lumière SIRT3 comme cible thérapeutique potentielle pour la gestion du DT2.

Introduction

Le diabète sucré de type 2 (DT2) est devenu l’un des troubles métaboliques chroniques les plus répandus et débilitants au monde, posant un fardeau important pour la santé publique et l’économie 1,2. Caractérisée par une résistance à l’insuline (RI) et un dysfonctionnement progressif des cellules β pancréatiques, la DT2DM est principalement causée par une altération de l’homéostasie du glucoseet des lipides 3,4. Parmi les multiples organes impliqués dans la régulation du glucose, le foie joue un rôle central en contrôlant la production endogène de glucose via la glycogénolyse et lagluconéogenèse 5. Une gluconéogenèse hépatique excessive est un facteur majeur de l’hyperglycémie à jeun, une caractéristique de la physiopathologie de type 2DM, et constitue une cible thérapeutique cruciale pour rétablir l’équilibreglycémique 6.

Les agents hypoglycémiques actuels — y compris lametformine 7, les thiazolidinediones8, les agonistes du récepteur GLP-19 et les inhibiteurs SGLT210 — obtiennent un contrôle glycémique par des mécanismes distincts, mais leur utilisation à long terme est souvent limitée par des effets indésirables, une efficacité déclinante ou une intolérance au traitement. Par conséquent, l’intérêt pour des approches thérapeutiques complémentaires ou alternatives capables de cibler de manière sûre et efficace de multiples voies métaboliques. La médecine traditionnelle chinoise (MTC), caractérisée par ses propriétés pharmacologiques multi-composantes et multi-cibles, offre des perspectives prometteuses pour la gestion des maladies métaboliques complexes telles que leDT2DM 11,12,13,14,15. Plusieurs formulations classiques de la MTC ont été rapportées pour améliorer la résistance à l’insuline, améliorer le métabolisme lipidique et supprimer la gluconéogenèse hépatique grâce à des mécanismes régulateursintégrés 16,17.

Le granule de ganzhirong (GZRG) est une formule standardisée de MTC avec un historique d’utilisation clinique dans la gestion des troubles métaboliques. GZRG est une formulation à base de plantes composée de huit plantes médicinales. Sur la base de nos recherches phytochimiques et pharmacologiques précédentes, une gamme de composés bioactifs a été identifiée dans le GZRG, incluant mais sans s’y limiter : l’acide salvianolique B, le D-stachyose, les proanthocyanidines, l’acide oxalique violet, l’acide salvianolique A, l’acide salvianolique C, le glucoside de calycosine 7, la 3′-méthoxypuerarine, la 3′-hydroxy-puerarine, l’apigénine-7-o-bêta-d-pyrano, l’émodine-8-O-β-glucose, le chrysophanol-1-O-glucoside, le chrysophanol-8-O-glucoside, la puerarine, l’acide rosmarinique, la cryptotanshinone, la catéchine, Ft-nyflavine, Calycosine, Rhein, Guanosine, acide oléique, émotoine d’aloès, Formononétine, acide palmitique, chrysophanon, D-tryptophane, Danshensu, acide férulique, Mannitol, acide gaulois et L-phénylalanine. Un avantage fondamental de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans la gestion du diabète de type 2 réside dans ses actions synergiques multi-composantes et multi-cibles. Les dizaines de constituants actifs contenus dans le GZRG sont susceptibles d’interagir avec de multiples processus biologiques — tels que les voies de signalisation de l’insuline, le métabolisme du glycogène et les réponses inflammatoires — produisant ainsi un effet de réseau intégré qui ne peut être correctement reproduit par aucun composépurifié 18. Des recherches antérieures ont démontré que le GZRG exerce des effets bénéfiques sur le métabolisme du glucose et des lipides dans les modèlesdiabétiques 19 ; cependant, les mécanismes moléculaires précis sous-jacents à ces effets restent flous. En particulier, l’exercice d’actions antidiabétiques du GZRG en modulant la signalisation gluconéogène hépatique n’a pas encore été élucidée.

La sirtuine 3 (SIRT3), une déacétylase mitochondriale dépendante de la NAD⁺, est un régulateur clé de l’homéostasie énergétiquecellulaire 20. En déacétylant et activant des enzymes métaboliques clés, SIRT3 influence la phosphorylation oxydative mitochondriale, l’oxydation des acides gras et lagluconéogenèse 21. Une expression aberrante de SIRT3 a été impliquée dans la pathogenèse de la résistance à l’insuline, du foie gras et duDT2DM 22,23. Les preuves indiquent que la surexpression hépatique de SIRT3 augmente le flux gluconéogène en modulant des enzymes telles que le porteur mitochondrial pyruvate 1 (MPC1)24, le pyruvate carboxylase (PC)25, le pyruvate déshydrogénase (PDH)26, la phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1)27 et la glucose-6-phosphatase (G6Pase)28. Ainsi, le contrôle médié par SIRT3 du métabolisme du pyruvate représente un lien critique reliant la fonction mitochondriale et la production de glucose hépatique, faisant de SIRT3 une cible attrayante pour une intervention thérapeutique dans le DT2DM.

Compte tenu des effets métaboliques établis des constituants bioactifs dans le GZRG, ainsi que du rôle central de SIRT3 dans l’homéostasie du glucose hépatique, il a été émis l’hypothèse que le GZRG améliore l’hyperglycémie dans le DT2DM grâce à la modulation de la voie gluconéogène médiée par SIRT3. Pour évaluer cette hypothèse, les effets du GZRG sur le métabolisme du glucose et des lipides ont été évalués chez des souris T2DM induites par un régime riche en graisses (HFD) et chez les cellules HepG2 résistantes à l’insuline induites par les acides gras libres (FFA). Des recherches supplémentaires ont examiné l’implication de l’axe de signalisation SIRT3-MPC1-PC/PDH dans la médiation de l’effet suppressif du GZRG sur la gluconéogenèse hépatique. Cette étude vise à élucider les mécanismes moléculaires sous-tendant les bénéfices métaboliques du GZRG et à fournir des preuves expérimentales soutenant son potentiel thérapeutique en tant que modulateur multi-cibles pour la prise en charge du DT2DM.

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Protocole

Le protocole d’étude animale a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation animale de l’Université de médecine chinoise de Changchun (approbation n° 2024396). Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux directives nationales et aux lois nationales pertinentes sur la protection des animaux.

Médicaments expérimentaux
Le GZRG (numéro de promotion 26210483) a été fourni par l’Hôpital affilié de l’Université de Médecine Chinoise de Changchun (Jilin, Chine). Les principaux constituants bioactifs et les paramètres de contrôle qualité du GZRG ont été caractérisés dans une étudeprécédente 18.

Réactifs et anticorps
Des kits de tests commerciaux ont été utilisés pour quantifier le glucose, le glycogène, les acides gras non éstérifiés (NEFA), les triglycérides (TG), le cholestérol total (TC), le cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) et les lipoprotéines de basse densité (LDL). Des kits d’immunoabsorption liés aux enzymes (ELISA) pour l’hémoglobine et l’insuline glycosylées ont également été obtenus commercialement. Des kits ELISA pour la pyruvate déshydrogénase (PDH) et la pyruvate carboxylase (PC) ont également été obtenus commercialement. Pour les travaux sur l’ARN et l’ADNc, le kit ARN Tissu/Cellule, le QPCR PreMix et le gDNA RT SuperMix ont été acquis commercialement. La transfection a été réalisée à l’aide d’un réactif de transfection. Anticorps primaires contre SIRT3 (RRID : AB_2837621), phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1 ; RRID : AB_2838732), PDH-E2, glucose-6-phosphatase (G6Pase ; RRID : AB_2845572), porteur mitochondrial de pyruvate 1 (MPC1 ; RRID : AB_2836209), PC (RRID : AB_2836732), et la glycaldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH ; RRID : AB_2833041) étaient achetées auprès d’un vendeur commercial.

Souris et traitements
Les souris mâles C57BL/6J (5-6 semaines) ont été prélevés auprès de Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. et maintenus dans des conditions standard (22 ± 2 °C, 50 %-60 % d’humidité, 12 heures de cycle clair/obscurité) avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Après une période d’acclimatation d’une semaine, six souris ont été désignées au hasard comme groupe témoin (Con) et nourries avec un régime alimentaire standard pour la nourriture. Les souris restantes ont reçu un régime riche en graisses (HH) pendant 12 semaines pour induire l’obésité et la résistance à l’insuline.

À la 13e semaine, les souris présentant un taux de glucose sanguin à jeun (FBG) ≥ 11,1 mmol/L ont été classées comme modèles réussis du diabète de type 2 (DT2DM). Ces souris diabétiques ont été réparties aléatoirement en cinq groupes expérimentaux (n = 6 par groupe) : le groupe modèle HFD, le GZRG à faible dose (L-GZRG, 3,2 g/kg/j), le GZRG à dose moyenne (M-GZRG, 6,4 g/kg/j), le GZRG à haute dose (H-GZRG, 12,8 g/kg/j) et la metformine (Met, 0,2 g/kg/j). Le GZRG et le Met ont été administrés quotidiennement par gavage oral pendant 8 semaines. Les groupes modèles Con et HFD ont reçu des volumes équivalents d’eau distillée. À l’issue de la période de traitement, des échantillons de sang et de tissu hépatic ont été prélevés sur toutes les souris pour une analyse ultérieure.

Test de tolérance au glucose intrapéritonéale (IPGTT), test de tolérance au pyruvate (PTT) et test de tolérance à l’insuline (ITT)
Des tests de tolérance métabolique ont été réalisés entre 6 et 8 semaines après le début des traitements médicamenteux. Pour l’IPGTT et le PTT, les souris ont été à jeûne toute la nuit (environ 16 heures). Pour l’ITT, une période de jeûne plus courte de 4 heures a été mise en place. Après le jeûne, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de glucose (2 g/kg pour la TPI), de pyruvate de sodium (2 g/kg pour la TPT) ou d’insuline humaine ordinaire (1 U/kg pour la TCI). Les taux de glucose sanguin ont été mesurés à partir d’échantillons de sang de la veine caudale à 0 min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min après l’injection à l’aide d’un glucomètre calibré.

Analyse biochimique et tests d’activité enzymatique
Les niveaux de glucose sanguin à jeun (FBG), d’hémoglobine A1c (HbA1c) et d’insuline (INS) ont été déterminés à l’aide de kits de test commerciaux selon les instructions du fabricant. L’évaluation du modèle homéostatique de la résistance à l’insuline (HOMA-IR) a été calculée à l’aide de la formule suivante :

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

Les niveaux circulants de NEFA, TG, TC, LDL-C, HDL-C, ainsi que les activités enzymatiques de la PDH et de la PC dans les tissus hépatiques ont été quantifiés à l’aide des kits commerciaux respectifs.

Analyse histopathologique des tissus hépatiques
Les tissus hépatiques frais ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 heures, suivis d’un traitement standard pour l’incorporation de la paraffine. Des coupes (5 μm d’épaisseur) ont été coupées et colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour une évaluation morphologique générale. Pour la visualisation des lipides, certains échantillons de foie ont été intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OCT), congelés brusquement, cryosectionnés et colorés avec de l’huile rouge O.

Culture cellulaire et traitement
La lignée cellulaire d’hépatomes humains HepG2 a été obtenue dans la collection de culture type de l’Académie chinoise des sciences (Chine). Les cellules ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM) complété avec 25 mM de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cultures ont été maintenues à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % deCO2.

Pour établir un modèle in vitro de résistance à l’insuline (RI), des cellules à 70 % de confluence à 80 % ont été traitées pendant 24 heures avec un mélange d’acides gras libres (FFA) comprenant acide oléique et acide palmitique à un ratio molaire de 2:1, basé sur une méthode précédemment rapportée avec des modificationsmineures 29. Après l’induction par FFA, le milieu de culture a été remplacé par un MEM frais contenant le même mélange FFA ainsi que diverses concentrations de GZRG pour une incubation supplémentaire de 24 heures.

Essai de viabilité cellulaire (CCK-8)
Les cellules HepG2 en phase de croissance logarithmique ont été récoltées et semées en plaques de 96 puits à une densité de 1 x 104 cellules par puits. Les puits périphériques ont été remplis avec 100 μL de solution stérile tamponnée phosphate (PBS) pour minimiser l’évaporation. Après une incubation nocturne pour assurer l’adhésion, les cellules ont été traitées selon le plan expérimental. Après le traitement, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées pendant 2 heures à 37 °C. L’absorbance à 450 nm était mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire était calculée comme suit :

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100 %

où As est l’absorption de l’échantillon, Ac est l’absorption du témoin (cellules non traitées), et Ab est l’absorption du vide (puits sans cellules).

Transfection plasmidique dans les cellules HepG2
Le plasmide de surexpression de SIRT3 (OV-SIRT3) et trois petits plasmides d’ARN interférents ciblant SIRT3 distincts (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), ainsi qu’un siRNA témoin négatif (si-NC), ont été construits par un fournisseur. Les transfections ont été réalisées à l’aide d’un réactif lorsque les cellules atteignaient une confluence de 50 % à 60 %. Le complexe de transfection a été préparé dans des conditions stériles comme suit : la solution A a été générée en diluant 1 μg d’ADN plasmidique dans 250 μL de milieu sérique réduit avec un mélange doux. La solution B a été préparée en diluant 2 à 3 μL de réactif de transfection dans 250 μL de milieu sérique réduit, suivie d’une incubation à température ambiante pendant 5 minutes sans vortex. Les deux solutions ont été combinées, mélangées délicatement par pipetage, puis incubées à température ambiante pendant 30 minutes pour former des complexes ADN-lipides. Pour la transfection, 1 h avant la procédure, le milieu de culture cellulaire a été aspiré, les cellules lavées avec PBS, et 1 mL de milieu sérique réduit (sans sérum et sans antibiotiques) a été ajouté. Ensuite, 500 μL du complexe de transfection ont été ajoutés goutte à goutte à chaque puits, et la plaque de culture a été doucement tourbillonnée pour assurer l’homogénéité. Les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 4 à 6 heures, après quoi le milieu a été remplacé par un milieu complet afin de réduire la cytotoxicité. Par la suite, les cellules ont été cultivées pendant 24 à 48 heures supplémentaires avant une analyse plus approfondie. L’efficacité de la transfection a été évaluée par PCR quantitative (qPCR). L’ARN total a été extrait, rétrotranscrit en ADNc, puis amplifié à l’aide d’amorces spécifiques à SIRT3 avec 18S rRNA comme contrôle interne. Les niveaux d’expression relatifs ont été déterminés via la méthode ΔΔCt, et le construct siRNA le plus efficace a été sélectionné pour les expériences ultérieures sur la base de ces résultats.

Coloration en rouge huile O pour l’accumulation intracellulaire de lipides
Les cellules HepG2 en phase de croissance logarithmique ont été ensemées dans des plaques à 24 puits à une densité de 2 x 105 cellules par puits et induites avec un milieu à haute teneur en lipides contenant 250 μM d’acide oléique et 250 μM d’acide palmitique pendant 48 h afin d’établir le modèle d’accumulation lipidique. Après les traitements, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du formaldéhyde à 10 % pendant 10 minutes à température ambiante. Après un rinçage à l’eau distillée et une brève immersion dans 60 % d’isopropanol, les cellules ont été colorées avec une solution de travail d’huile Red O fraîchement préparée (obtenue en mélangeant les composants A1 et A2 dans un ratio 3:2) pendant 10 à 15 minutes. L’excès de colorant était éliminé par lavage à 60 % d’isopropanol, suivi d’eau distillée. Les noyaux ont été contre-colorés avec l’hématoxyline de Mayer (1,0 g/L) pendant 1 à 2 minutes. Après un lavage final, les cellules ont été montées avec de la gélatine de glycérol, et des images ont été capturées au microscope optique à un gros 200x pour une évaluation qualitative des gouttelettes lipidiques.

Induction de la résistance à l’insuline et quantification du glucose dans les cellules HepG2
Les cellules HepG2 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits à une densité de semis de 2 x 105 cellules par puits afin d’établir un modèle in vitro de résistance à l’insuline. Après 24 heures de traitement, le surnageant de culture a été prélevé pour une analyse approfondie. Pour la mesure intracellulaire du glucose, les suspensions cellulaires ont été centrifugées à 1000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant était jeté, et la pellete cellulaire était lavée une ou deux fois avec un tampon isotonique, suivie d’une centrifugation dans les mêmes conditions. Le pellet a ensuite été homogénéisé dans 0,2 à 0,3 mL de milieu d’homogénéisation et soumis à une perturbation ultrasonique dans un bain d’eau glacée à l’aide d’une sonde de 300 W, avec des impulsions de 3 à 5 s suivies d’intervalles de 30 s, répétées 3 à 5 fois. L’homogénate obtenu a été analysé directement sans centrifugation supplémentaire. Les niveaux de glucose dans le surnageant de culture et dans l’homogénate cellulaire ont été mesurés à l’aide d’un kit standardisé de test de glucose selon les instructions du fabricant afin d’assurer une évaluation précise et reproductible des réponses métaboliques.

Mesure de la teneur en triglycérides cellulaires
Les cellules HepG2 ont été collectées par centrifugation à 1000 x g pendant 10 minutes, puis le surnageant a été jeté. La pellete cellulaire a été lavée 1 ou 2 fois avec un tampon phosphate isotonique (0,1 M, pH 7,0-7,4), suivie d’une centrifugation dans les mêmes conditions. Après le retrait du surnageant, la pellete a été remise en suspension et homogénéisée avec 0,2 à 0,3 mL d’éthanol absolu. L’homogénéate a été soumise à une perturbation ultrasonique sur la glace (300 W, 3 à 5 s par rafale, intervalles de 30 s, répété 3 à 5 fois). L’homogénéat obtenu a été utilisé directement pour une analyse ultérieure sans centrifugation supplémentaire. Une plaque à 96 puits était installée avec des puits blancs, standards et d’échantillons. Après un mélange approfondi, la plaque était incubée à 37 °C pendant 10 minutes, et l’absorbance mesurée à 500 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La teneur en triglycérides dans les échantillons cellulaires a été calculée sur la base d’une courbe standard dérivée des dilutions sérieuses des standards de glycérol.

Mesure de la teneur en cholestérol total
Les cellules HepG2 (5 x 106) ont été lysées dans 1 mL de tampon d’extraction par perturbation ultrasonique sur la glace. L’homogénéat a été centrifugé à 10 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant a été collecté pour une analyse immédiate. Une solution standard de stock de cholestérol (50 μmol/mL) a été préparée et diluée en série pour générer une courbe standard (0,3125 à 10 μmol/mL). Une solution chromogénique fonctionnelle a été préparée en mélangeant les réactifs un, deux et trois fournis dans la trousse de test de cholestérol, puis préchauffée à 37 °C. Des échantillons ou étalons étaient mélangés à la solution de travail, incubés à 37 °C pendant 30 minutes, et l’absorbance mesurée à 500 nm. La teneur en cholestérol a été calculée selon la courbe standard.

Coloration par immunofluorescence
Les cellules cultivées sur des manteaux de couverture ont été rincées avec du PBS glacé et fixées avec du paraformoldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Après les lavages PBS, les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 minutes et bloquées avec 5 % de BSA à 4 °C pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été incubées avec un anticorps anti-SIRT3 primaire (dilution 1:500) à 4 °C pendant la nuit. Après les lavages de PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence (dilution 1:2000) pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (0,5 μg/mL) pendant 10 minutes. Les gaines de couverture étaient montées sur des lames en verre à l’aide d’un support anti-décoloration et visualisées au microscope à fluorescence.

Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
L’ARN total a été extrait des cellules à l’aide du kit tissuaire/cellulaire ARN. L’ADN génomique a été retiré, et l’ADNc a été synthétisé à l’aide du kit RT gDNA. La PCR quantitative a été réalisée à l’aide du kit qPCR sur un système de détection PCR en temps réel. Les séquences d’amorce spécifiques au gène sont fournies dans le Tableau 1.

Analyse du western blot
Pour l’extraction des protéines des tissus hépatiques, environ 50 à 200 mg de tissu étaient pesés, hachés dans une boîte de Petri, puis transférés dans un homogénéisateur. Un tampon de lyse prérefroidi (tampon RIPA) complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase a été ajouté pour prévenir la dégradation des protéines. L’homogénéisation a été réalisée minutieusement sur glace pour assurer une perturbation complète des tissus, et l’homogénéate a été transféré dans un tube centrifugeuse et incubé sur glace pendant 30 minutes pour faciliter la solubilisation des protéines. Par la suite, l’homogénéat a été centrifugé à 4 °C à 12 000 x g pendant 10 à 30 minutes, et le surnageant a été soigneusement collecté comme extrait protéique total, évitant ainsi la contamination par la pellete. Pour l’extraction des protéines cellulaires, un tampon de lyse pré-refroidi (tampon RIPA contenant 1 % de Triton X-100 et des inhibiteurs de protéases) a été ajouté aux cellules, suivi d’une incubation sur glace pendant 15 à 30 minutes pour obtenir une lyse complète. La perturbation des cellules était assurée par des grattages répétés avec un grattoir à cellules ou un pipetage vigoureux. Le lysat a été transféré dans un tube centrifugeuse et centrifugé à 4 °C à 14 000 x g pendant 30 minutes, et le surnageant a été collecté comme extrait protéique total. La concentration en protéines a été quantifiée à l’aide d’un kit de test protéique BCA, et les aliquotes ont été stockées à -80 °C pour une future analyse du Western blot ou utilisées directement pour la préparation de l’échantillon. Les échantillons de protéines ont été dénaturés dans le tampon de Laemmli à 100 °C pendant 10 minutes, séparés par SDS-PAGE, puis transférés sur les membranes PVDF. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 2 heures à température ambiante, puis incubées avec des anticorps primaires spécifiques pendant la nuit à 4 °C. Après le lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 1 heure à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat à chimiluminescence améliorée (LC). Les signaux chimiluminescents ont été capturés, et les intensités de bande quantifiées par analyse densitométrique à l’aide du logiciel ImageJ. Les taches occidentales brutes sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.

Analyse statistique
Toutes les données sont exprimées sous forme de moyenne ± d’erreur standard de la moyenne (SEM). Des comparaisons statistiques entre deux groupes ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student non apparié. Pour les comparaisons entre trois groupes ou plus, une analyse unisentido de la variance (ANOVA) a été appliquée, suivie du test post hoc de Tukey pour les comparaisons multiples. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism (version 9.5.0). Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Le GZRG a amélioré la résistance à l’insuline et la gluconéogenèse chez les souris T2DM induites par la DCF
Le modèle murin du diabète sucré de type 2 (DT2) induit par la DCF, caractérisé par la résistance à l’insuline, l’hyperglycémie et la dyslipidémie, est largement utilisé pour étudier la pathogenèse de la maladie et évaluer les interventionsthérapeutiques 30. Dans la présente étude, un modèle de T2DM induit par le DAF a été établi chez des souris C57BL/6J afin d’évaluer l’...

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Discussion

La présente étude démontre que le GZRG exerce des effets antihyperglycémiques et sensibilisants à l’insuline significatifs dans les modèles in vivo et in vitro du DT2DM, principalement par la suppression de la gluconéogenèse hépatique via la modulation de l’axe SIRT3-MPC1-PC/PDH. Les données expérimentales indiquent que l’administration de GZRG a atténué l’hyperglycémie à jeun, amélioré la tolérance au glucose et à l’insuline, rétabli l’homéostasie lipidique et réduit l...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Plan de développement scientifique et technologique de la province du Jilin, Grant numéro 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FastKing gDNA dissipant RT SuperMix & nbsp ;   ;   ;Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chine).  ;KR118-02
Anticorps glucose-6-phosphatase (G6Pase)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-D-12610
Anticorps contre la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-T-0004
Kits ELISA sur hémoglobine glycosylée   ;   ;   ;Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Chine).MM-0159M2
GZRGHôpital affilié à l’Université de Médecine Chinoise de Changchun (Jilin, Chine)26210483
Kits de tests de cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL)Institut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)A112-1-1
Kits ELISA à insulineJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Chine).MM-0579M2
Lipofectamine2000  ;Invitrogen, États-Unis11668-019
Kits de tests de cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL)Institut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)A113-1-1
Mesurer les kits de test de glucoseInstitut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)F006-1-1
Anticorps porteur mitochondrial de pyruvate 1 (MPC1)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-D-3852
Kits de test des acides gras non estérifiés (NEFA)Institut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)A042-2-1
Anticorps PCWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-D-4364
Anticorps PDH-E2Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-D-14046
Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) AnticorpsWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-D-6770
kits ELISA (PC) de la carboxylase pyruvate & nbsp ;Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-160408H
Kits ELISA de pyruvate déshydrogénase (PDH) & nbsp ;   ;Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissul/Kit Cellulaire   ;   ;Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chine).  ;DP451
Anticorps SIRT3Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Chine)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix  ;Tiangen Biotech Co., Ltd. (Chine).  ;FP209-02
Kits de test du cholestérol total (TC)Institut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)A110-1-1
Kits de test sur les triglycérides (TG)Institut de bioingénierie Jiancheng de Nankin (Chine)A111-1-1

Références

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