Research Article
Ce protocole établit un pipeline multi-omiques intégré (transcriptome et protéome) combiné à un dépistage pharmacologique en réseau pour identifier les moteurs moléculaires et les cibles thérapeutiques du dysfonctionnement endothélial dans les complications diabétiques.
Le dysfonctionnement endothélial est un facteur clé de la maladie rénale diabétique (DKD), mais ses mécanismes moléculaires systémiques restent incomplètement décodés. Nous avons émis l’hypothèse que l’analyse multi-omique intégrée pourrait cartographier les lésions endothéliales induites par l’hyperglycémie et identifier des traitements réutilisables. Un pipeline computationnel réutilisable a été appliqué pour intégrer des profils transcriptomiques/sécrétomes provenant des cellules endothéliales hyperglycémiques et des reins diabétiques. Cela a permis d’identifier 534 gènes/protéines couramment surélevés. L’enrichissement fonctionnel a révélé l’activation du remodelage extracellulaire de la matrice, de la communication intercellulaire et des voies d’inflammation. La validation inter-bases de données a affiné 278 médiateurs à haute confiance, et l’analyse du réseau d’interactions protéine-protéine a identifié dix gènes hub. En utilisant la pharmacologie de réseau, nous avons examiné une bibliothèque de médicaments approuvés, identifiant plusieurs composés candidats (par exemple, brucéantine, idélalisib) susceptibles de cibler ce réseau. De plus, la régulation des facteurs de transcription et des simulations exemplaires d’amarrage moléculaire (par exemple, idélalisib avec CTCF/BRD4) ont fourni des hypothèses mécanistes pour validation expérimentale. En conclusion, cette étude établit un cadre multi-omique réutilisable qui délimite les mécanismes pathogènes endothéliaux chez DKD et propose des candidats médicaments réutilisés, offrant une approche stratégique pour la découverte mécanistique et thérapeutique.
Le diabète, en tant que défi sanitaire mondial, a touché 529 millions de personnes dans le monde en 2021, avec des projections indiquant qu’il touchera 1,31 milliard de personnes d’ici 2050. Au-delà du contrôle glycémique, les complications à long terme sont la principale source de morbidité, de mortalité et de réduction de la qualité de vie. Cela inclut des complications microvasculaires (par exemple, la maladie rénale diabétique (DKD), la rétinopathie, la neuropathie) et les complications macrovasculaires (par exemple, l’athérosclérose accélérée). De manière critique, la DK touche 30 % à 40 % des patients diabétiques, représentant la principale cause de la maladie rénale terminale (ESRD) dans lemonde 2. Le fardeau profond de ces complications souligne un besoin urgent non comblé de nouvelles thérapies ciblant leurs mécanismes sous-jacents.
Les cellules endothéliales (CE), formant la muqueuse interne de tous les vaisseaux sanguins, sont des gardiens essentiels de la santé vasculaire. Le dysfonctionnement endothélial induit par l’hyperglycémie agit comme un facteur central de la vasculopathie diabétique et des lésionsorganiques 3,4. Des niveaux élevés de glucose déclenchent une cascade de réponses inadaptatives au sein des CE, incluant une biodisponibilité déséquilibrée de l’oxyde nitrique (NO), une sécrétion accrue de l’endothéline-1 (ET-1), une expression surélevée des molécules d’adhésion (par exemple, VCAM-1, ICAM-1), un stress oxydatif accru par une génération excessive d’espèces réactives d’oxygène (ROS) (par exemple, via les oxydases NADPH), et une inflammation persistante de faible grade 3,4. Collectivement, ces altérations entraînent une vasodilatation altérée, une perméabilité vasculaire accrue, l’adhésion et l’infiltration des leucocytes, des états pro-thrombotiques et, en fin de compte, un remodelagevasculaire 5. Dans la microvascularisation rénale, les lésions endothéliales glomérulaires perturbent la barrière de filtration, favorisent l’albuminurie et contribuent directement à l’accumulation de la matrice extracellulaire (MCE), à la glomérulosclérose et à la fibrosetubulointerstitielle 5,6. L’activation ultérieure des cellules rénales résidentes, associée à l’afflux de cellules inflammatoires, crée un cercle vicieux amplifiant la lésionrénale 5,7. De manière cruciale, les études cliniques démontrent que les marqueurs de dysfonctionnement endothélial systémique sont fortement corrélés avec l’apparition et la progression de l’albuminurie et la diminution du taux de filtration glomérulaire (TFG) chezles patients diabétiques 6,7,8, soulignant ainsi sa pertinence directe pour les issues de maladies humaines. Malgré son importance reconnue, une compréhension globale au niveau systémique de la reprogrammation transcriptionnelle et sécrétoire précise induite par l’hyperglycémie chronique dans les EC — en particulier les altérations entraînant le remodelage de la MEC, clé de la fibrose rénale — reste incomplètement caractérisée, limitant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques mécanistes pour la DKD et d’autres complications vasculairesdiabétiques 7,8.
La complexité moléculaire profonde sous-jacente au dysfonctionnement endothélial du diabète représente un défi de taille pour les approches thérapeutiques traditionnelles à cible unique. C’est là que la biologie computationnelle et la bioinformatique émergent comme des outils indispensables, permettant l’intégration et l’exploration de divers ensembles de données omiques à haute dimension afin de prioriser les pôles causaux au sein des réseaux pathologiques et d’identifier des stratégies thérapeutiquesmulti-ciblages 9. De manière critique, les approches conventionnelles monomodales (par exemple, transcriptome/protéome uniquement ou dépistage pharmacologique) manquent souvent l’interaction critique entre les couches moléculaires (par exemple, expression génique, dynamique des protéines, réponse médicamenteuse), ne capturant pas les facteurs synergiques ou les effets hors cible10,11. Le pipeline multi-omique intégré surmonte ces limites en profilant simultanément les données transcriptomiques, sécrétomiques et pharmacologiques au sein d’un même système, offrant ainsi une vision globale du mécanisme de la maladie. La pharmacologie en réseau, les algorithmes de prédiction ligand/cible et le dockage moléculaire in silico permettent l’exploration systématique de bibliothèques de médicaments approuvées, accélérant le repositionnement ou la découverte de composés capables de contrer des signatures complexes de maladies3. Ce changement de paradigme est particulièrement prometteur pour identifier des thérapies ciblant la dysrégulation endothéliale et ses conséquences microvasculaires dévastatrices, telles que la DKD, offrant un potentiel d’efficacité accrue et de profils d’effets secondaires réduits. L’intégration d’analyses transcriptomiques/sécrétomiques de cellules endothéliales exposées à l’hyperglycémie a permis d’identifier 534 molécules couramment augmentées. L’enrichissement fonctionnel impliquait le remodelage extracellulaire de la matrice, le stress oxydatif et l’inflammation dans la pathogenèse précoce de la DKD. L’analyse inter-bases de données a priorisé 278 cibles à haute confiance, affinées via des réseaux PPI de gènes hub. Le dépistage pharmacologique en réseau des médicaments approuvés a prédit 85 composés candidats (dont brefeldin-A, bruceantine, paracétamol et idelalisib) ciblant ces centres. La prédiction des facteurs de transcription in silico et le docking ont exploré les mécanismes. Ce travail délimite les moteurs endothéliaux de la DKD, établit un pipeline de découverte computationnelle et fournit des candidats thérapeutiques à valider. En fin de compte, ce pipeline devrait promouvoir des programmes de découverte thérapeutique pour les complications diabétiques.
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Les expériences animales ont été menées avec l’approbation du Comité de recherche et d’éthique sur les animaux de l’Institut de recherche médicale de Yiling du Hebei (numéro d’approbation : N2024082). Consultez le tableau des matériaux pour les matériaux expérimentaux et les instruments utilisés dans cette étude. Le personnel doit porter strictement un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lors de la manipulation de réactifs dangereux tels que le TRIzol (irritant cutané/oculaire, contenant du phénol) et les inhibiteurs de protéases (sensibilisateurs potentiels respiratoires/cutanés). Séparer les déchets biologiques/liquides dans des sacs autoclavables, ainsi que les déchets chimiques dangereux dans des contenants désignés pour l’élimination institutionnelle des dangers. Décontaminez les consommables avant leur élimination.
Modélisation des souris de la néphropathie diabétique
Les souris mâles db/db et db/m (12 semaines) ont été maintenus sous des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF) à 22 ± 2 °C et 56 % ± 5 % d’humidité, avec des cycles clair/obscur de 12 heures et un accès à la nourriture et à l’eau à volonté de sang. Après une période d’acclimatation d’une semaine, les souris se sont vu attribuer aléatoirement des identifiants numériques et être attribuées à des groupes expérimentaux. Les souris db/db ont été nourries avec un régime riche en protéines pendant 6 semaines pour établir la DKD. La modélisation réussie a été confirmée par un rapport albumine/créatinine urinaire (UACR) significativement élevé par rapport aux témoins db/m, l’UACR >30 mg/g servant de biomarqueur fonctionnel principal pour laDKD 12 précoce.
Modélisation des cellules endothéliales à haute glycémie
Les cellules endothéliales glomérulaires rénales humaines (HRGEC) ont été préparées dans des conditions standardisées. Les HRGEC ont été cultivés dans un milieu soit normal de glucose (NG, 5,5 mM) soit élevé en glucose (HG, 30 mM de D-glucose) et maintenus dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules ont été soit exposées sans interruption à la HG, soit cultivées en conditions témoins pendant 24 heures avant les analyses en aval. Le contrôle osmotique (HM, contenant 5,5 mM de D-glucose avec 24,5 mM mannitol) doit être inclus. Toutes les conditions doivent répondre à des critères stricts d’aptitude cellulaire : la viabilité est restée à ≥85 %, les niveaux d’apoptose sont restés inférieurs à 15 %, les augmentations ROS de l’HG par rapport à la HM n’ont pas dépassé 20 %, et la libération de LDH est restée inférieure à 10 %, validant ainsi l’intégrité cellulaire avant les analyses en aval.
Collection de médias conditionnés
Des milieux conditionnés (MC) ont été collectés à l’aide d’un protocole standardisé pour l’analyse dusécrétome 13 avec modifications. Après 24 heures de stimulation à un taux élevé de glucose (30 mM de D-glucose), de glucose normal (5,5 mM de D-glucose) ou de contrôle osmotique (5,5 mM de D-glucose + 24,5 mM de mannitol), les HRGEC ont été lavés avec du sérum stérile tamponné au phosphate (PBS) pour éliminer les protéines sériques résiduelles. Les cellules ont été reconstituées avec un milieu endothélial basal sans sérum, sans phénol, rouge, et incubées pendant 12 heures à 37 °C avec 5 % de CO₂ afin d’accumuler les facteurs sécrétés.
Le CM était récolté à l’aide de tubes de centrifugation pré-refroidis. Séquentiellement, le traitement des échantillons s’est fait comme décrit ci-dessous.
Clarification principale : La CM a été transférée dans des tubes coniques sans RNase/DNase et centrifugée à 3 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Les débris granulés ont été jetés.
Inhibition de la protéase : Dans les 2 minutes suivant la clarification primaire, un cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA a été ajouté à une concentration finale 1x (1:50) contenant 1x inhibiteurs de phosphatase.
Concentration : Le surnageant a été immédiatement chargé dans des filtres centrifuges PBS pré-rincés (MWCO de 3 kDa) et centrifugé à 4 000 x g pendant 90 minutes à 4 °C pour atteindre une concentration de 10 fois supérieure.
Précision secondaire : Le concentré a été transféré dans des tubes microcentrifuges pré-refroidis et centrifugé à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Le surnageant a été collecté, évitant les granulats granulés.
Stockage : Des aliquotes de 50 μL ont été fabriquées dans des cryovials stériles à faible liaison aux protéines. Les fioles ont été congelées instantanément dans de l’azote liquide dans les 30 minutes suivant la fin de la récolte. Les flacons étaient stockés à -80 °C (sans cycles de congélation-dégel).
Les lots de CM ont subi un test d’endotoxine (<0,25 EU/mL). Le protocole d’incubation sans sérum n’a montré aucune induction de stress (validé par les immunoblots HSP70/CHOP). Le rendement de la protéine CM est normalisé en nombre de cellules/ADN viable lors de la récolte. Rigueur de traitement maintenue : technique stérile sur tout le terrain ; ≤fenêtre de 30 minutes de la récolte au congélation ; Équilibre de température du rotor confirmé.
Essai CCK-8 de cellules tubulaires rénales traitées par un milieu conditionné
Pour évaluer l’impact fonctionnel du sécrétome endothélial sur la viabilité des cellules tubulaires rénales, un test CCK-8 a été réalisé sur la lignée cellulaire tubulaire proximale proximale HK-2 humaine traitée avec la MC dérivée des cellules endothéliales glomérulaires rénales humaines (HRGEC), conformément aux protocoles établis. Les cellules HK-2 ont été cultivées dans un milieu DMEM complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Pour le test, les cellules ont été ensemencées en plaques de 96 puits à une densité de 5 x 10³ cellules par puits. La famine sérique des cellules a été réalisée pendant 12 heures dans un milieu contenant 0,5 % de FBS immédiatement avant le traitement de la muc cervicale.
La MC a été appliquée avec une masse protéique totale normalisée égale. Les aliquotes de CM congelées ont été décongelées à 37 °C dans un bain sec (<5 min) et clarifiées par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Les cellules HK-2 (100 μL/puits) ont été traitées avec HG-CM, NG-CM ou HM-CM, normalisées à une teneur en protéines/ADN correspondante. Un total de 3 réplications biologiques par condition (avec 3 réplications techniques chacune) ont été préparées. Les échantillons ont été incubés à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide du kit de comptage cellulaire-8. Pour ce faire, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 1 à 4 heures à 37 °C. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La viabilité était calculée comme suit :
Viabilité ( %) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100
Détection du stress oxydatif
Les niveaux de malondiadéhyde cellulaire (MDA) ont été quantifiés, l’un des principaux produits finaux de la peroxydation lipidique membranaire, via le test TBA. Les lysats cellulaires (1 x 107 cellules) ont été clarifiés par centrifugation à 10 000 x g pendant 15 minutes, puis 0,02 mL de surnageant a été aliquoté dans des tubes d’échantillonnage avec 0,02 mL de standards MDA. À l’aliquote, 0,02 mL de clarifiant et 0,6 mL de réactif acide ont été ajoutés. Les échantillons/étalons ont été traités avec 0,2 mL de l’agent chromogénique (tubes témoins : 0,2 mL d’acide acétique à 50 % a été ajouté). Après scellement, mélange et incubation à 100 °C pendant 40 minutes, les échantillons ont été refroidis puis centrifugés à 9569 x g pendant 10 minutes. Le surnageant a été transféré sur des microplaques à 250 μL pour une mesure OD₅₃₂.
Profilage transcriptomique
L’ARN total a été isolé à l’aide d’un réactif TRIzol selon le protocole du fabricant. La quantité et la pureté de l’ARN ont été évaluées respectivement à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un analyseur de fragments. Seuls des échantillons d’ARN de haute qualité ont été utilisés avec un numéro d’intégrité ARN (RIN) > 7,0 pour la construction de la bibliothèque de séquençage.
L’ARNm polyadénylé (poly(A)+) a été enrichi par deux cycles de sélection magnétique oligo(dT) basée sur des billes magnétiques. L’ARNm purifié a été fragmenté en 200 à 300 nucléotides à l’aide d’un kit de fragmentation à base de magnésium à 94 °C pendant 5 à 7 minutes. La synthèse de l’ADNc de première brin a été réalisée avec transcriptase inverse, suivie d’une synthèse d’ADNc de second brin utilisant la polymérase d’ADN I et RNase H d’E. coli en présence de dUTP (pour permettre la spécificité du brin). Les étapes suivantes comprenaient la réparation des extrémités, le détachage en A, la ligation de l’adaptateur et la sélection de la taille à l’aide de billes magnétiques. Avant l’amplification par PCR, le second brin incorporé par dUTP était digéré avec l’enzyme UDG.
Une bibliothèque spécifique à chaque brin a été construite avec une taille moyenne d’insert de 400 ± 50 bp en utilisant la PCR dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 98 °C pendant 1 minute ; 14 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 10 s, recuit à 60 °C pendant 30 s, et extension à 72 °C pendant 30 s ; et une extension finale à 72 °C pendant 5 minutes. Le séquençage par extrémités en paire à 150 pb a été réalisé sur une plateforme Illumina, avec une profondeur de séquençage de ≥40 millions de lectures par échantillon (Q30 > 85 %).
Analyse bioinformatique des données transcriptomiques
Le contrôle qualité des lectures brutes a été effectué avec FastQC (v0.11.8), et l’alignement au génome de référence GRCh38.p13 avec HISAT2 (v2.2.1) a été effectué. La quantification des transcripts et l’assemblage par échantillon ont été réalisés en utilisant StringTie (v2.1.6) avec les paramètres par défaut. Tous les transcriptomes assemblés ont été fusionnés à partir d’échantillons individuels pour reconstruire un transcriptome complet à l’aide du logiciel gffcompare (v0.12.6 ; gffcompare est un outil autonome, non intégré à StringTie, et sa version est corrigée pour la version stable commune). L’analyse différentielle de l’expression a été réalisée avec DESeq2 (v1.38.3) en utilisant des seuils de |log2 fold change (FC)| > 1 et taux de fausses divulgations (FDR) < 0,05. Les effets batch ont été corrigés via le package variancePartition.
Analyse protéomique du sécrétome
La CM a été prélevée à partir de HRGEC cultivés sous des conditions de contrôle NG, HG ou HM en utilisant une méthode13 précédemment décrite avec des modifications pour l’analyse du sécrétome. Les cellules ont été lavées avec PBS après stimulation et incubées dans un milieu sans sérum pendant 12 heures. Le CM a été prélevé et centrifugé à 3 000 x g pendant 10 minutes (4 °C).
Des quantités égales de peptides provenant de chaque échantillon ont été mélangées puis diluées avec le solvant A (5 % ACN, pH 9,8) et injectées dans la colonne. Le fractionnement du mélange peptidique a été réalisé à l’aide d’une colonne 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 sur le système binaire de séparation rapide. L’élution en gradient a été réalisée à un débit de 0,3 mL/min : 5 % à 21 % de solvant B (97 % ACN, pH 9,8) en 38 minutes, 21,5 % à 40 % de solvant B en 20 minutes, 40 % à 90 % de solvant B en 2 minutes, 90 % de solvant B pendant 3 minutes, et 5 % de solvant B équilibré pendant 10 minutes. Les pics d’élution ont été surveillés à 214 nm, et des fractions ont été collectées chaque minute. Les fractions étaient combinées selon les chromatogrammes des pics d’élution. Un total de 10 fractions ont été collectées, puis lyophilisées.
Les phases mobiles A (100 % eau, 0,1 % acide formique) et B (80 % acétonitrle) ont été préparées, et les échantillons de peptides séchés ont été reconstitués avec 0,1 % d’acide formique et centrifugés à 20 000 x g pendant 10 minutes. La séparation a été réalisée à l’aide d’un système de phase liquide UHPLC. Les échantillons ont été injectés sur une colonne HPLC ES906 (150 mm) avec un gradient de 8 minutes à 2,5 μL/min, et séparés avec le gradient effectif suivant : 0-4 minutes, phase B mobile à 4 % augmentant linéairement jusqu’à 25 % ; 4-6,9 min, phase B mobile passant linéairement de 25 % à 35 % ; 6,9-7,3 min, phase B mobile passant linéairement de 35 % à 99 % ; 7,3-8,0 min, phase mobile B maintenue à 99 %. Les peptides séparés en phase liquide ont été transférés à un spectromètre de masse pour l’acquisition du mode DIA. Les paramètres principaux étaient définis comme suit : énergie de collision normalisée 25 %, état de charge par défaut 2, résolution 240 000, balayage tous les 0,6 s, plage de balayage 380-980 m/z, spectrométrie de masse AGC 500 %. Les balayages ioniques par fragmentation étaient enregistrés avec un temps de balayage maximal de 3 ms et utilisaient 300 fenêtres de balayage 2-T, allant de 380 à 980 m/z.
Le DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, version 1.9.1) a été utilisé pour analyser les données DIA avec une méthode sans bibliothèque. Les données de la SEP/SEP ont été consultées par rapport à des séquences protéiques, qui ont été téléchargées depuis la base de données Uniprot avec les paramètres suivants : enzyme : Trypsine/P ; Maximum de décolletés manqués : 2 ; modification fixe : carbamidométhyl (C) ; modifications variables : oxydation (M) et acétyle (protéine N-terme) ; Tolérance de masse précurseur : 20 ppm ; tolérance à la masse des fragments : 0,05Da. Les résultats ont été filtrés par 1 % de FDR, et seuls les groupes protéiques ayant satisfait ce critère de filtrage ont été utilisés lors de l’analyse en aval.
Analyse d’enrichissement fonctionnel des omiques (GO, KEGG et GSEA)
Des analyses d’enrichissement fonctionnel ont été réalisées sur des ensembles filtrés de gènes différenciellement exprimés (transcriptomique) et de protéines (protéomique du sécrétome), suivant des pipelines bioinformatiques établis. Les identifiants étaient cartographiés à l’aide de Org.Hs.eg.db. L’enrichissement GO (processus biologiques, fonctions moléculaires, composants cellulaires) était réalisé via clusterProfiler. Benjamini-Hochberg a ajusté la valeur p < 0,05, et une réduction de similarité sémantique (seuil = 0,7) a été appliquée pour condenser les termes. L’analyse des voies KEGG a été réalisée à l’aide de l’API REST de KEGG (HAS, version 2023). Des tests hypergéométriques ont été utilisés avec la correction de Yekutieli FDR. La visualisation de la topologie des voies a été réalisée avec Pathview. GSEA a été appliqué selon une approche basée sur le rang avec le classement du gène signal/bruit. Un enrichissement testé sur des collections de MSigDB (HALLMARK, C2, C5 ; v2023.2) et des signatures endothéliales diabétiques sélectionnées a été réalisé. La signification a été évaluée après 1000 permutations de phénotype (FDR < 25 %).
Analyse du réseau d’interactions protéine-protéine
Pour identifier les régulateurs moléculaires principaux au sein du pool de candidats pathogènes, la construction de réseaux PPI et une analyse topologique ont été réalisées à l’aide d’un flux de travail computationnel intégré. Les 278 gènes candidats ont été soumis à la base de données STRING (v12.0 ; Homo sapiens ; Les sources de preuves comprenaient des bases de données expérimentales, de co-expressions et de soliste ; un seuil de confiance en interaction (score combiné) >0,7 pour les avantages à haute confiance ; et pas d’inflation interactrice supplémentaire. Les résultats ont été importés dans Cytoscape (v3.9.1), et l’analyse topologique réseau a été réalisée à l’aide des plugins MCODE (v1.5.2) et CytoHubba (v0.4.1). Par la suite, le réseau a été optimisé visuellement en fonction du degré de connexion des nœuds, de sorte que les nœuds à forte connectivité soient plus foncés, plus grands en taille et plus visibles dans leur étiquette.
Développement d’un ensemble de gènes cibles pour la maladie rénale diabétique
Les critères pour les ARNm/protéines co-régulés ont été définis comme suit : transcriptome (FDR < 0,05 et |log2FC| > 1) et sécrétome (FDR < 0,01 et |log2FC| > 1,5). Les noms de protéines et de gènes ont été normalisés à l’aide de UniProt et convertis en un format unifié (Symbole génétique). Un ensemble de gènes cibles a été construit pour la maladie rénale diabétique en intégrant des gènes associés à la maladie provenant de plusieurs bases de données publiques, notamment GeneCards (Version 5.25, terme de requête : Diabetic Nephropathies, date consultée juillet 2025), la Comparative Toxicogenomics Database (CTD ; https://ctdbase.org/, terme de requête : Diabetic Nephropathies, date consultée juillet 2025), et Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, version 0.13.8, terme de requête : Diabetic Nephropathies, date consultée juillet 2025)13, 14, 15. Ce jeu a été désigné comme l’ensemble complet de référence pour la maladie rénale diabétique. L’intersection entre les ARNm/protéines co-régulées à l’augmentation et cet ensemble de gènes a été identifiée pour des analyses en aval.
Détection des protéines CCL2
Pour quantifier CCL2, une plaque de 96 puits a été recouverte d’un anticorps de capture (100 μL/puits) et incubée à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, la plaque a été lavée avec 2x avec un tampon et bloquée avec un diluant ELISA (200 μL/puits) pendant 1 heure à la réchauffe. Une courbe standard à 7 points a été préparée par dilutions sérielles 2 de la norme S1, puis les échantillons (100 μL/puits) ont été ajoutés et incubés pendant 2 heures à 400 tr/min. Après un lavage 5 fois, l’anticorps de détection (100 μL/puits) a été ajouté et incubé pendant 1 h à 400 tr/min, suivi d’une solution enzymatique (100 μL/puits) et d’une incubation pendant 30 minutes à 400 tr/min. Les échantillons ont été développés avec un substrat TMB (15-30 min, RT). La réaction s’arrêtait avec de l’acide (100 μL/puits), et l’absorption était mesurée à 450 nm (référence 620 nm optionnelle). Les étapes clés incluent un lavage rigoureux, des incubations chronométrées et des dilutions standardisées pour garantir la reproductibilité.
Repositionnement des médicaments
Les composés thérapeutiques ont été prédits à l’aide de la plateforme suivante : LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2 ; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Cette plateforme utilise la méthode MODZ et l’analyse directionnelle caractéristique pour identifier de petites molécules ou combinaisons de composés capables d’inverser ou d’imiter les signatures d’expression géniqued’entrée 16. Les médicaments candidats ont été identifiés comme ceux qui inversent la dysrégulation des gènes rénaux exprimés différemment grâce à cette plateforme. Les composés ont été classés en fonction de leurs scores de réversion dans les lignées cellulaires rénales par rein sélectionnés dans la colonne tissulaire, et les candidats les mieux classés ont été soumis à un accostage moléculaire pour évaluer leurs affinités de liaison aux principales cibles protéiques.
Criblage des facteurs de transcription co-régulateurs
La base de données hTFtarget a été interrogée pour la liaison des TF co-régulatrices à l’ensemble génétique. La base de données hTFtarget a été analysée pour identifier les relations géniques-cibles entre le facteur de transcription (TF) humain en analysant informatiquement des ensembles de données ChIP-Seq à grande échelle dans diverses cellules, tissus et conditions. Le pipeline intégratif combinait les signaux de pic ChIP-Seq avec un contexte épigénétique pour identifier la liaison TF dans les promoteurs/amplificateurs, en tenant explicitement compte de la dynamique régulatrice spatiotemporale. Comme l’ont montré Zhang et al., il a servi de plateforme multidimensionnelle permettant l’exploration de cibles TF ou de régulateurs génétiques, la visualisation des données ChIP-Seq, l’investigation de la coopérative TF et la prédiction des sitesde liaison 17.
Pipeline computationnel et analyse pour l’amarrage de petites molécules-protéines
AutoDock Vina 1.2.018 a été utilisé pour réaliser une analyse de docking moléculaire des interactions de liaison entre les principes actifs et les facteurs de transcription BRD4, CTCF, EP300 et SPI1. Les structures cristallines de BRD4 (ID PDB : 7REK), CTCF (ID PDB : 5K5I), EP300 (ID PDB : 5NU5) et SPI1 (ID PDB : 8E3K) ont été obtenues à partir de la Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Les structures de petites molécules au format SDF ont été téléchargées depuis la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21, converties au format MOL2 via Open Babel 2.4.1, et réduites en énergie avec PyRx 0.8. Le prétraitement des protéines a été réalisé en retirant des molécules d’eau, en ajoutant des atomes d’hydrogène, en calculant les charges de Gasteiger et en les convertissant au format PDBQT (requis pour AutoDock Vina). Une stratégie d’amarrage semi-flexible a été employée, définissant la position et les dimensions de la grille d’amarrage en fonction des sites de liaison des ligands co-cristallisés dans chaque protéine. MA9-086 sert de ligand de contrôle positif pour BRD4, et XDM-CBP pour EP300. Pour CTCF et SPI1 (sans ligands positifs connus), des poches de liaison potentielles ont été identifiées via une analyse structurale via la plateforme en ligne Proteins Plus (https://proteins.plus/). Les paramètres de la grille d’amarrage étaient définis comme suit (coordonnées et dimensions en Å le long des axes x, y et z) : BRD4 centré à (-11,907, -8,617, -3,973) avec une case de (18,387, 18,387, 18,387) ; Centre CTCF à (15,165, 4,854, 6,388) et la taille des loges (17,25, 20,25, 9,75) ; le centre EP300 à (39,781, 5,326, 9,998) et la taille de la boîte (16,516, 16,516, 16,516) ; SPI1 centre à (3,155, -3,853, 0,668) et taille de boîte (17,25, 25,5, 10,5). Lors de l’amarrage, la plage d’énergie était réglée à 3, le paramètre d’exhaustivité à 8, et l’espacement de la grille à 0,375 Å. La stabilité de la liaison a été évaluée à partir de l’énergie de liaison, où des valeurs plus basses indiquent des conformations plus stables et une probabilité d’interaction plus élevée, avec un seuil de <-5 kcal/mol défini comme une activité de liaisonforte 22,23. Enfin, les modes d’interaction entre composés et récepteurs ont été identifiés à l’aide de PyMOL.
Analyse statistique
Les données sont présentées en moyenne ± SEM. Les tests statistiques ont été sélectionnés en fonction de la normalité (Shapiro-Wilk) et de l’homogénéité de variance (test de Levene). Des tests t non appariés (deux groupes) ou des ANOVA unidirectionnelles avec des tests post hoc LSD (≥ groupes 3) ont été utilisés pour les comparaisons entre groupes. Un p < 0,05 a été défini comme un seuil de signification. Les graphiques étaient générés avec GraphPad Prism 9.0.
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Démonstration de l’impact pathogène du sécrétome endothélial hyperglycémique sur les tubules rénaux
Cette étude a débuté par la validation de l’effet pathogène du sécrétome endothélial hyperglycémique. Le milieu conditionné à partir de cellules endothéliales glomérulaires humaines hyperglycémiques (HG-CM) a significativement altéré la viabilité des cellules épithéliales tubulaires proximales humaines (HK-2) par ...
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Cette étude établit que le dysfonctionnement du sécrétome endothélial induit par l’hyperglycémie est un facteur critique de la lésion rénale diabétique grâce à des approches multi-omiques intégrées et computationnelles. Démonstration que la cytotoxicité médiée par sécrétome envers les tubules rénaux coïncide avec une dysrégulation systématique de 534 facteurs dérivés de l’endothélium convergeant vers le remodelage matriciel, le stress oxydatif et les voies du noyau inflammatoire dans la ...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32200644), le projet Science and Technology Program du Hebei (246W2501D, 252W7716D) et la Plateforme dorée de Yanzhao (A20240022).
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Kit CCL2 ELISA | Thermo Fisher Scientific | #88-7399-88 | |
| Inhibiteur de CCR2 | Merck Millipore | #227016 | |
| Kit de test de viabilité cellulaire | Sept Biotechnologies | CCK-8, SC119-01 | |
| Séquenceur ADN | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| Système de chromatographie liquide haute performance | Thermo Fisher Scientific | UltiMate 3000 Binaire RSLC | |
| Médium de culture HRGEC | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd. | 1001 | |
| Cellules endothéliales rénales glomérulaires humaines (HRGEC) | Shanghai Zhongqiao Xinzhou Biotechnologie | PRI-H-00038 | |
| Milieu complet des cellules épithéliales tubulaires rénales humaines ; | Procell | CM-H193 | |
| Cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (HK2) | Procell | CP-H193 | |
| Souris mâles db/db et db/m (4 semaines) | Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd. | SCXK 20190004 | |
| Spectromètre de masse | Thermo Fisher Scientific | Astral | |
| Lecteur d’absorption à microplaques | Dispositifs moléculaires | SpectraMax iD5 | |
| Cocktail inhibiteur de protéase (sans EDTA) | Roche | cOmplete, #5056489001 | |
| Réactif d’extraction d’ARN | Thermo Fisher Scientific | TRIzol, #15596026 | |
| Analyseur de qualité d’ARN | Agilent Technologies | Analyseur de fragments 5300, M5311AA | |
| Instrument de quantification de l’ARN | Thermo Fisher Scientific | Qubit 3.0, Q33216 | |
| Kit de détection ROS | Thermo Fisher Scientific | #EEA019 | |
| Dispositifs centrifuges d’ultrafiltration (MWCO 3 kDa) | Merck Millipore | Amicon Ultra-4 |
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