Préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hPTM2)

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour automatiser l’analyse post-traductionnelle des modifications des histones unicellulaires en utilisant une stratégie d’affichage isotopique à deux plexes et la digestion ArgC. Ce flux de travail permet un profilage quantitatif, reproductible et à haute sensibilité de l’hétérogénéité de la chromatine et des réponses épigénétiques à la résolution unicellulaire.

Abstract

Les modifications post-traductionnelles des histones (hPTM) sont des régulateurs centraux de l’organisation de la chromatine et de l’expression génique. Leur dysrégulation est impliquée dans le développement, le cancer et le vieillissement. Bien que la spectrométrie de masse soit la méthode de choix pour étudier les hPTM, la plupart des protocoles sont conçus pour des échantillons en vrac et ne peuvent pas résoudre la variabilité d’une cellule à l’autre. L’extension de l’analyse PTM des histones au niveau de cellule unique est donc essentielle mais techniquement difficile, car les histones sont faibles, riches en lysine et fortement modifiées.

Ici, nous décrivons un flux de travail automatisé de protéomique unicellulaire pour l’analyse PTM des histones utilisant la manipulation de nano liquides. Le système permet un traitement à l’échelle nanolitre de cellules individuelles avec une manipulation minimale et une grande reproductibilité. Le flux de travail inclut la digestion avec ArgC Ultra protéase, qui cliquette les résidus d’arginine et évite la nécessité d’étapes de dérivation, bloqueurs de lysine, généralement requises en protéomique des histones. Pour permettre une comparaison quantitative entre les conditions, nous appliquons une stratégie de marquage à deux plexes avec l’anhydride propionique et son analogue déutériné, l’anhydride propionique-d10. Cette combinaison de préparation automatisée de l’échantillon, de multiplexage isotopique et de digestion ArgC Ultra aboutit à un protocole rationalisé et sensible pour l’analyse PTM d’histones unicellulaire.

La méthode permet d’étudier l’hétérogénéité de la chromatine et les effets des perturbations épigénétiques à résolution unicellulaire. Pour démontrer ce flux de travail, nous avons généré des sphéroïdes à partir de cellules carcinomes hépatocellulaires HepG2/C3A et les avons traités avec du butyrate de sodium, un inhibiteur des histones déacétylase qui induit l’hyperacétylation.

Introduction

Les histones sont les composants protéiques des nucléosomes, les unités répétitives de la chromatine. Leurs queues N-terminales sont riches en résidus de lysine et d’arginine et sont fortement régulées par des modifications post-traductionnelles (PTM), telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications influencent l’accessibilité de l’ADN et contrôlent ainsi les processus tels que la transcription, la réplication et la réparation. Les schémas altérés de PTM des histones sont fortement associés à des états pathologiques, allant du cancer à la neurodégénérescence et au^{vieillissement 1,2}. Pour cette raison, l’analyse des PTM des histones a suscité un grand intérêt dans la recherche en épigénétique et protéomique. La spectrométrie de masse (EM) fournit une analyse spécifique au site et quantitative des modifications des histones, mais les histones présentent des défis analytiques uniques. Leur composition en acides aminés, leurs multiples sites de modification et leurs schémas combinatoires complexes les rendent plus difficiles à analyser que les protéines typiques. Les protocoles établis reposent sur la dérivatisation chimique pour bloquer les résidus de lysine avant la digestion, améliorant ainsi la récupération des peptides et les performances^{chromatographiques 3}. Bien qu’efficaces dans les analyses en masse, ces protocoles de dérivatisation en plusieurs étapes peuvent introduire des pertes problématiques pour les entrées à cellule unique. L’analyse unicellulaire devient de plus en plus importante car les systèmes biologiques sont intrinsèquement hétérogènes. Les histones en vrac analysent les signaux moyens de nombreuses cellules et ne parviennent donc pas à capturer cette variabilité. Les sous-populations cellulaires peuvent différer dans leurs états de chromatine, et ces différences peuvent stimuler le développement, la reprogrammation cellulaire ou les réponses aux médicaments ^4,5.

Ici, nous présentons une méthode automatisée de préparation d’échantillons pour l’analyse multiplexée de l’histone unicellulaire PTM (sc-hPTM2). Cette méthode repose sur le système CellenONE, qui permet une distribution précise de cellules individuelles et de réactifs à l’échelle nanolitre de manière automatisée. Cette méthode est une variante de la méthode de préparation d’échantillons nano protéomique (nPOP), qui a d’abord introduit l’utilisation de la préparation des gouttelettes sur une lame^{en verre 6}. La plateforme nPOP dispose d’une protéomique automatisée avancée à cellules uniques, mais son protocole standard de digestion tryptique est sous-optimal pour les histones en raison de leur forte teneur en lysine et de leur densité de modification importante. Ici, nous avons adapté le système CellenONE pour incorporer la dérivatisation des histones de référence avec l’anhydride propionique et introduit un marquage isotopique, permettant une quantification précise et complète des modifications post-traductionnelles des histones à la résolution d’une seule cellule. Plus précisément, nous simplifions le protocole en utilisant ArgC Ultra protéase pour la digestion des protéines. Contrairement à la trypsina, l’ArgC ne se fende qu’aux résidus d’arginine et ne nécessite pas de blocage de la lysine. Cela élimine le besoin d’une stratégie de dérivatisation en deux étapes, simplifiant ainsi le protocole. De plus, la méthode intègre un schéma de marquage isotopique à deux plexes utilisant l’anhydride propionique et l’anhydride propionique-d10, permettant d’analyser simultanément 2 cellules ^7,3. Après digestion et marquage, des échantillons unicellulaires sont récupérés et analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS)/MS à l’aide d’acquisition indépendante des données (DIA). À notre égard, cette méthode a démontré une augmentation à la fois de la sensibilité et de la reproductibilité pour la quantification des PTM des histones, par rapport à la version précédente^{de cette méthode 8}.

Pour démontrer la méthode, nous avons profilé la dynamique PTM des histones unicellulaires dans des sphéroïdes dérivés des cellules hépatocellulaires du carcinome HepG2/C3A. Nous avons traité ces sphéroïdes avec du butyrate de sodium, un inhibiteur bien caractérisé de la déacétylase des histones qui augmente l’acétylation des histones et sert de référence pour sonder la régulation^{de la chromatine 9,10}. En comparant les sphéroïdes témoins et traités au butyrate de sodium à résolution unicellulaire, nous démontrons une preuve de principe de résultats représentatifs, soulignant le potentiel d’applications plus larges en biologie de la chromatine et en épigénétique du cancer. Notamment, pour le protocole, nous faisons référence à une publication antérieure décrivant la croissance et le traitement des sphéroïdes^{3D 10}, l’acquisition de peptides d’histones en spectrométrie^{de masse 11}, et l’analyse de données utilisant le logiciel^{EpiProfile 12}.

Protocol

1. Tampons et réactifs

1. Milieux de croissance cellulaires pour les cellules HepG2/C3A : Préparez le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de glucose) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), des acides aminés non essentiels (1 % v/v), de la L-glutamine (1 % v/v) et de la pénicilline/streptomycine (0,5 % v/v). Le milieu de croissance est stocké à 4 °C.
2. Mélange maître : préparer ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) 0,03 %, Dithiothréitol (DTT) 10 mM dans de l’eau de qualité LC-MS.
3. Solution d’HA : Préparez de l’hydroxylamine à 1 % (v/v) dans de l’eau de qualité LC-MS.
4. Solution de lavage : Préparez 10 mL d’un mélange 50:50 d’acétonitrile/eau contenant 0,1 % (p/w) d’acide formique (tous de qualité LC-MS).
5. Phase mobile A (AMP) - acide formique à 0,1 % : Ajoutez 1 mL d’acide formique concentré à 999 mL d’eau de qualité HPLC et mélangez bien.
6. Phase B mobile (MPB) - 80 % d’acétonitrile de qualité HPLC + 0,1 % d’acide formique : Ajoutez 800 mL d’acétonitrile de qualité HPLC à 199 mL d’eau de qualité HPLC. Ensuite, ajoutez 1 mL d’acide formique concentré à cette solution et mélangez.

2. Préparation des sphéroïdes

1. Pour la préparation des sphéroïdes, voir Stransky S et ^al.11.
2. Cultivez des cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2/C3A dans un bioréacteur tridimensionnel (3D) rotatif pendant 5 à 7 jours afin de favoriser une formation uniforme des sphéroïdes jusqu’à atteindre un diamètre de ~400-600 μm. Utilisez du DMEM complété avec 10 % de FBS, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % de L-glutamine et 0,5 % de pénicilline/streptomycine. Maintenir les sphéroïdes à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’au traitement.
   REMARQUE : La figure 1A représente l’équipement utilisé pour préparer les sphéroïdes dans l’article de référence.

3. Culture cellulaire et traitement

1. Mettez ~10 sphéroïdes dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant 2 mL de milieu de croissance.
2. Incubez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
3. Traiter les sphéroïdes pendant 24 heures avec 5 mM de butyrate de sodium ou ajouter le même volume d’eau pour le contrôle (Figure 1B).

4. Isolement de cellules et préparation à la suspension à cellule unique

1. Après 24 heures de traitement, incubez les cellules avec 1 mL de trypLE à 37 °C pendant 3 à 5 minutes.
2. Faites doucement une pipette de haut en bas jusqu’à ce que le sphéroïde se brise et que des cellules uniques soient obtenues.
3. Collectez les cellules dans un tube de 15 mL et lavez-les en diluant jusqu’à 10 mL avec un PBS 1x bien froid, centrifugez à 500 g pendant 5 minutes à 4 °C, puis aspirez le surnageant.
4. Resuspendez les cellules dans 1 mL de PBS 1x glacé et ajoutez la coloration verte Sytox avec une concentration finale de 1 μM.
5. Incubez la cellule avec du Sytox Green pendant 20 minutes sur la glace dans un environnement sombre.
6. Lavez la cellule avec 10 mL de 1x PBS bien froid, centrifugez à 500 g pendant 5 minutes à 4 °C, puis aspirez le surnageant.
7. Résuspendez les cellules dans 1 mL de PBS 1x glacé et ajoutez du paraformoldéhyde (PFA) avec une concentration finale de 0,5 %.
8. Incubez la cellule avec du PFA pendant 15 minutes sur de la glace.
   REMARQUE : Bien que Sytox Green ne soit généralement pas compatible avec la fixation due à la perméabilisation membranaire, pour les cellules testées, la proportion de cellules Sytox Green reste la même jusqu’à 8 heures après fixation, sans signe de fuite de protéines histones.
9. Lavez la cellule avec 10 mL de 1x PBS bien froid, centrifugez à 500 g pendant 5 minutes à 4 °C, puis aspirez le surnageant.
10. Reconstituer les cellules à une concentration finale de 200 à 500 cellules/μL.
    REMARQUE : Pour les petites cellules qui ne tendent pas à se déposer, une concentration de 500 cellules/μL est recommandée, tandis que pour les grandes cellules qui ont tendance à se déposer, une concentration de 200 cellules/μL est recommandée. Si la suspension de la cellule est sujette à l’agrégation, passez-la dans une tamis de 40 μm avant l’aspiration pour éviter l’obstruction de la buse. Si des cellules supérieures à 40 μm sont d’intérêt et probablement présentes dans un échantillon, un tamis de 70 μm peut être utilisé pour retirer de très gros agrégats.
11. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument pour tri.

5. Connexion logicielle et initialisation système

1. Activez le système cellenONE (Figure 2A), démarrez l’ordinateur de contrôle, lancez le logiciel et ouvrez l’espace de travail utilisateur v2.0-nPOP2 ; tous les fichiers de champs requis et les modèles d’exécution pour nPOP y sont préchargés.
2. Assurez-vous que le refroidisseur de l’instrument est allumé, puis réglez la valeur du point de rosée en fonction de la température interne actuellement indiquée par l’instrument.
3. Amorçez le système avec des buses de distribution PDC-70, revêtement de type 2 (Figure 2B) installées aux emplacements 1 et 3, en suivant les instructions à l’écran.
4. Réglez la largeur d’impulsion et la tension de transmission de chaque buse aux valeurs spécifiées sur l’emballage du fabricant.
   REMARQUE : L’utilisation de deux buses séparées préserve la consistance de la distribution : l’une délivre la suspension de la cellule, l’autre les réactifs, de sorte que tout débris adhérant à une buse ne compromettra pas les gouttes suivantes. L’utilisation des deux buses lors de la dernière étape de collecte accélère également la récupération de l’échantillon.
   1. (ÉTAPE CRITIQUE) Pour une efficacité maximale de captation, le décalage z entre les deux buses devrait différer de <50 μm. Déterminez cela en définissant la position de contact optimale pour chaque buse et en comparant les lectures de hauteur Z dans l’onglet Configuration de la buse.
5. Remplissez le réservoir de l’humidificateur avec de l’eau désionisée jusqu’à la ligne de remplissage indiquée.

6. Configuration pré-exécution sur le manutention de liquide

1. Sélectionnez la quantité de lames en verre (Figure 2C) à préparer. Ce choix définit directement le nombre total de cellules prévues à analyser.
2. Pour un schéma de multiplexage à 2 plexes (Figure 3A), chargez une seule diapositive avec 320 cellules.

7. Distribution d’un « fossé » de diméthylsulfoxyde (DMSO) autour des bords de la glissière

REMARQUE : La figure 3B représente les étapes de préparation des échantillons dans le cellenONE à partir du fossé de DMSO. Pour prévenir l’évaporation des gouttelettes supplémentaire, le DMSO est distribué le long des bords des lames.

1. Dans l’onglet Main, sélectionnez la course vers 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Allez dans l’onglet Configuration de la cible , chargez le fichier DMSO_Moat.fld depuis le dossier de schéma approprié, et réglez le nombre de champs sur Y, correspondant au nombre de diapositives prévues à traiter.
3. Ajoutez 150 μL de DMSO de qualité LC-MS dans un nouveau tube PCR et placez-le en position 2 de la station CellenWASH, avec le bouchon du tube orienté vers la porte de l’instrument.
4. Ouvre l’onglet Exécuter et clique sur Démarrer Exécuter. Le système aspirera 10 μL de DMSO et fera une pause pour une confirmation utilisateur de la stabilité des gouttelettes. Tirez trois gouttelettes de test autodrop (Figure 4A) ; si les trois sont parfaitement formés, cliquez sur Continuer Exécuter.
5. Après la distribution, les buses se rincent automatiquement et l’instrument capture des images sur toutes les lames pour le contrôle qualité. Examinez les images pour vérifier une gouttelette DMSO uniforme sur chaque diapositive et pour vérifier la présence de gouttelettes manquantes ou hors cible (Figure 4B).

8. Dispensation DMSO

1. Dans l’onglet Main, sélectionnez la course vers 1_Dispense_DMSO.
2. Ouvrez l’onglet Configuration de la cible , importez le fichier de champs DMSO.fld (Figure 4C) depuis le répertoire de schéma approprié, et réglez Nombre de champs à Y, correspondant au nombre de diapositives que vous souhaitez traiter.
3. Ajoutez 150 μL de DMSO de qualité LC-MS dans un nouveau tube PCR et placez-le en position 2 de la station CellenWASH, avec le bouchon du tube orienté vers la porte de l’instrument.
4. Ouvre l’onglet Exécuter et clique sur Démarrer Exécuter. Le système aspirera 10 μL de DMSO et fera une pause pour une confirmation utilisateur de la stabilité des gouttelettes. Tirez trois gouttelettes de test autodrop ; si les trois sont parfaitement formés, cliquez sur Continuer Exécuter.
5. À la fin de la distribution, le logiciel rince automatiquement les buses et capture des images sur chaque diapositive pour assurer la qualité. Examinez les images pour vérifier une gouttelette DMSO uniforme sur chaque diapositive et pour vérifier s’il manque ou s’il y a des gouttelettes hors cible.

9. Distribution cellulaire

1. Dans l’onglet Main, sélectionnez la course vers 2_Dispense_Cells.
2. Dans l’onglet Configuration de la cible , ouvrez le sous-dossier Fichiers de champs des cellules du répertoire du schéma de multiplexage choisi.
3. Comme l’expérience implique deux conditions, choisissez le fichier de champ correspondant à l’échantillon qui va trier — soit CellType_A.fld, soit CellType_B.fld.
4. Après le chargement du fichier, réglez Nombre de champs à Y, pour qu’il soit égal au nombre total de diapositives pour cette exécution.
5. Dégazez la suspension de la cellule de l’étape 4.11 avec une pompe à vide pendant 10 minutes sur la glace.
6. Transférez 150 μL de la suspension à cellules préparées dans un CellenVIAL propre, puis placez le flacon dans la fente 1 du carrousel CellenWASH avec son capuchon pointé vers la porte de l’instrument.
7. Allez dans l’onglet Installation de la buse > Faire la tâche et exécutez Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 pour aspirer l’échantillon du flacon.
8. En restant dans l’onglet Installation de la buse , lancez le visualiseur de distribution de cellules (Figure 5A) et exécutez la routine de cartographie pour définir la zone d’éjection et les objets de porte en fonction de la taille et de l’allongement. Les paramètres d’isolation d’une seule cellule illustrés à la Figure 5A correspondent exactement aux réglages utilisés pour la distribution des cellules HepG2/C3A dissociées des sphéroïdes.
9. Ensuite, activez le mode fluorescent en sélectionnant T > F. Réglez le mode de sélection sur négatif. Augmenter la plage de paramètres d’isolation pour la taille et l’intensité du minimum au maximum afin de garantir qu’aucune cellule morte n’est isolée.
10. Vérifiez avec les paramètres de mappage, ouvrez l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécution, puis suivez les instructions du logiciel. Lorsque la distribution se termine, l’instrument rince automatiquement les buses et capture des images des lames pour examiner le placement et l’uniformité des gouttelettes.
    REMARQUE : Lors du tri des cellules, des images sont prises de chaque cellule individuelle isolée pendant l’exécution (Figure 5B).
11. Après la fin du tri des cellules, fermez la fenêtre de distribution.
12. Gardez toute suspension restante de cellules sur la glace jusqu’à la fin de la section 9 ; Le surplus peut être utilisé ultérieurement pour des échantillons en vrac, la construction empirique de bibliothèques ou des études de validation supplémentaires.

10. Distribution de mélange master de digestion

1. Dans l’onglet principal , sélectionnez la course vers 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Ouvrez l’onglet Configuration cible , chargez Digest.fld depuis le dossier de multiplexage approprié, et réglez le nombre de champs à Y pour qu’il soit égal au nombre de diapositives de cette exécution.
3. Préparez un mélange maître de digestion frais et dégazez la solution avec une pompe à vide pendant 10 minutes sur glace (mélange maître : ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03 %, DTT 10 mM dans de l’eau de qualité LC-MS).
4. Pipette 20 μL du master mix dans une plaque à 384 puits et placez la plaque à l’intérieur du système X1.
5. Dans l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécution et suivez les instructions. Après que le système ait aspiré le réactif, confirmez la stabilité des gouttelettes lorsque vous le demandez.
6. Lorsque la distribution est terminée, l’instrument rince automatiquement les buses et photographie chaque lame ; Examinez les images pour vérifier que chaque gouttelette a reçu le mélange digestif de manière uniforme.
7. Incubez les lames toute la nuit pour la digestion, en maintenant les réglages d’humidité et de point de rosée spécifiés. Chaque gouttelette contient ~13,5 nL de mélange digestif. Effectuer la digestion pendant la nuit à ~75 % d’humidité relative, avec un point de rosée maintenu 1-2 °C en dessous de la température de la chambre pour éviter l’évaporation des gouttelettes.

11. Incubation pendant la nuit

1. Dans l’onglet principal , choisissez la course à 4_Incubation_16h.
2. Passez à l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécuter.
   REMARQUE : Les instruments prendront des photos des lames toutes les 30 minutes pour surveiller l’état des gouttelettes. Si elles sèchent ou gonflent pendant l’incubation, ajustez le réglage du point de rosée si nécessaire.
3. Lorsque l’incubation est terminée, un message apparaît indiquant que l’incubation est terminée.
   REMARQUE : Des digestions rapides (≤4 h) peuvent être réalisables avec des conditions plus élevées entre l’enzyme et le substrat ; Cela n’a pas été évalué ici, donc la condition validée reste 16 heures.

12. Évaporation

REMARQUE : Avant de passer à l’étape de l’étiquetage, il est recommandé de vérifier l’état des gouttelettes afin de s’assurer qu’elles ne sont pas trop gonflées par l’eau, car l’eau pourrait nuire à l’efficacité de l’étiquetage. À cette fin, la phase d’évaporation est recommandée.

1. Dans l’onglet principal , choisissez la course à 5_Evaporation.
2. Allez dans Lime, Contrôle de l’unité de refroidissement, et sous Contrôle Point de Rosée, réglez la température de contrôle fixe à 23 °C.
3. Passez à l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécuter. Le séchage durera 5 minutes, et les instruments prendront automatiquement des photos des lames après le séchage.
4. Inspectez les photos ; Si les gouttelettes sont suffisamment sèches, arrêtez la fuite. Sinon, cliquez sur continuer et séchez encore 5 minutes (Figure 6A).
5. À la fin de la course, revenez à l’ancien contrôle de point de rosée.

13. Étiquettes dispensées

1. Dans l’onglet Main, choisissez la course à 6_Dispense_PA_Labels.
2. Allez dans l’onglet Configuration de la cible , chargez le fichier Labels.fld depuis le dossier de schéma approprié, et réglez le nombre de champs à Y, correspondant au nombre de diapositives prévues à traiter.
3. Aliquote 150 μL de DMSO de qualité LC-MS dans la fente 2 de la station CellenWASH.
4. Préparez une solution stock des deux stocks de marquage pour la dérivation multiplexée des histones : anhydride propionique 25 % (v/v) dans DMSO et 25 % (v/v) anhydride propionique d₁₀ en DMSO.
   REMARQUE : Dégazer les deux solutions avant de les transférer sur la plaque pour minimiser la formation de bulles.
5. Distribuez 20 μL de chaque réactif de marquage dans les puits désignés d’une plaque à 384 puits et placez la plaque à l’intérieur du système X1. Chaque gouttelette reçoit ~10 nL de réactif de marquage (25 % d’anhydride propionique ou 25 % d’anhydride propionique₁₀ en DMSO).
6. Passez à l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécution, et suivez les instructions.
7. Laissez les étiquettes réagir en coulissante pendant 1 heure.
8. Après la distribution, l’instrument rince automatiquement les buses et photographie chaque lames. Examinez les images pour confirmer une distribution uniforme et un placement correct des gouttelettes sur toutes les lames.

14. Distribution d’HA

1. Préparez la solution d’HA et dégazez-la avant utilisation.
2. Chargez la fiole. Pipettez 150 μL de la solution HA dans un tube PCR propre, positionnez-la dans la fente 2 de CellenWASH, et orientez le bouchon vers la porte de l’instrument.
3. Sélectionnez le profil de course. Dans l’onglet principal , choisissez 7_Dispense_Quench.
4. Configurez le fichier de champ. Ouvrez l’onglet Configuration de la cible , chargez HA.fld depuis le dossier correspondant du schéma multiplexé, et réglez Nombre de champs à Y pour qu’il soit égal au total des diapositives.
5. Commence la course. Naviguez jusqu’à Exécuter, cliquez sur Lancer Exécuter, et suivez les instructions à l’écran.
6. Incubez. Laissez le HA réagir sur les diapositives pendant 30 minutes.
7. Vérifiez la distribution. Après l’achèvement, le système rince les buses et capture des images de chaque diapositive — examine ces images afin de confirmer un placement et un volume uniformes des goutteles.

15. Micro d’échantillon

1. Préparez la solution de lavage dans le WashTray XL.
2. Prépare la plaque de collecte. Distribuez 2 μL de DDM à 0,01 % (p/w) dans de l’eau de qualité LC-MS dans chaque puits d’une plaque fraîche à 384 puits et placez la plaque à l’intérieur du manipulateur de liquides.
3. Choisissez la ligne de récupération. Dans l’onglet Main, sélectionnez le profil 8_Pickup_2plex.
4. Chargez le fichier de terrain. Ouvrez l’onglet Configuration de la cible , importez Pick-up.fld depuis le bon dossier du schéma multiplexé, et réglez Nombre de champs à Y pour qu’il corresponde au nombre de diapositives.
5. Exécutez la course. Passez à l’onglet Exécuter , cliquez sur Démarrer Exécution, et suivez les instructions. L’instrument collectera chaque gouttelette, rincera les buses et imagera les lames pour vérifier que chaque échantillon a été prélevé.

16. Traitement post-retrait

1. Scellez la plaque de 384 puits avec une feuille d’aluminium adhésif et centrifugez brièvement pour faire passer les gouttelettes au fond des puits.
2. Retirez le papier aluminium et séchez les échantillons à basse température dans un concentrateur sous vide.
3. Scellez la plaque avec du papier adhésif et conservez la plaque séchée à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’analyse LC-MS/MS.

17. Préparation des échantillons en vrac

1. En utilisant la suspension restante de la section 9, faites tourner les cellules et resuspendez en 1x PBS pour obtenir une concentration de 2 000 cellules/μL. Cela doit être effectué après l’achèvement de l’article 10.
2. Lyse thermique : gelez brusquement la suspension restante à -80 °C pendant 10 minutes, puis un choc thermique à 90 °C pendant 10 minutes.
3. Laissez le tube refroidir à température ambiante.
4. Transférez 25 μL de lysat dans un tube PCR et ajoutez 5 μL du mélange digestif préalablement préparé.
5. Incubez toute la nuit (≈ 16 h) à 37 °C dans un thermocyclage.
6. Dérivation par marque lumineuse : ajouter 5 μL d’une nouvelle étiquette lumineuse à 25 % (v/v) dans l’acétonitrule et incuber pendant 1 heure.
7. Trempe par réaction : ajouter 5 μL de solution d’hydroxylamine (HA) à 1 % (p/w) et incuber pendant 30 minutes.
8. Séchez l’échantillon dans un concentrateur sous vide réglé à basse température, puis conservez à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour LC-MS/MS.

18. Installation LC/MS et acquisition de données

REMARQUE : Pour collecter les données de ce manuscrit, un système LC-MS\MS a été installé avec une colonne analytique d’optique ionique 75 μm diamètre diamétrique x 25 cm x 1,7 μm.

1. Préparez les phases mobiles à fonctionner sur le HPLC :
   Phase Mobile A (MPA) : acide formique à 0,1 % dans l’eau de qualité HPLC
   Phase B mobile (MPB) : acide formique à 0,1 % dans l’acétonitrile de qualité HPLC
2. Programmez la méthode HPLC pour un gradient actif de 30 minutes : 5-23 % MPB en 25,7 min, 23-35 % MPB en 2,6 min et 35-45 % MPB en 1,7 min, à un débit de 200 nL/min. Programmer l’autoéchantillonneur pour qu’il resuspende l’échantillon en 0,1 % FA + 0,01 % DDM pour une prise « sèche ».
3. Configurez la méthode d’acquisition MS pour réaliser une acquisition indépendante des données (DIA) :
   REMARQUE : Ces réglages sont spécifiques à un Thermo Exploris 480 équipé de FAIMS Pro Duo et peuvent varier selon votre instrument. Il est recommandé d’utiliser celles courantes pour la protéomique unicellulaire DIA avec des plages m/z similaires à celles décrites ci-dessous.
   1. Réglez le MS pour un balayage complet de 300 à 1100 m/z avec une résolution de 120 000, un objectif AGC de 300 %, un temps d’injection maximal de 246 ms, et un CV FAIMS de -50 V.
   2. Réglez le MS/MS sur un balayage DIA de 300 à 1100 m/z avec une résolution de 60 000, une fenêtre d’isolement de 50 m/z, une énergie de collision HCD de 27 %, une première masse de 120 m/z, une cible AGC de 1000 %, un temps d’injection maximal de 118 ms, et une CV FAIMS de -50 V.
4. Retirez le joint en feuille d’aluminium de la plaque à 384 puits contenant les cellules simples. Reconstituer l’échantillon en vrac à 100 cellules/μL en 0,1 % FA + 0,01 % DDM et transférer 10 μL dans un puits vide, tel que P24. Ensuite, scellez la plaque avec un tapis en caoutchouc perforable et chargez-la dans l’autosampler.
5. Exécutez les exécutions en file d’attente : exécutez d’abord les échantillons en bloc puis les ensembles de cellules uniques.

19. Analyse des données

1. Analysez les données brutes avec EpiProfile2.1 pour obtenir le résultat avec les abondances peptidoformes des cellules marquées par anhydride propionique.
   REMARQUE : Les échantillons doivent être acquis sur un instrument Thermo afin d’utiliser EpiProfile 2.1 pour le traitement des données. Ce logiciel extrait environ 250 peptidoformes avec sa version canonique, mais il est modifiable selon l’organisme, les modifications supplémentaires d’intérêt, les mutations, ^etc.12.
2. Faites passer les données brutes avec EpiProfile2.1_D5 pour obtenir le résultat avec les abondances peptidoformes des cellules marquées avec l’anhydride propionique-d10.
3. Effectuez la correspondance des métadonnées avec les sorties Epiprofile via le programme quantQC.
4. Filtrez les échantillons défaillants en les comparant avec les blancs.
5. Filtrez les peptidoformes qui ne sont pas présents dans au moins 50 % des échantillons.
6. Filtrez les peptidoformes dont le signal d’intensité de la cellule unique n’est pas supérieur au signal de 150 % dans les blancs.
7. Obtenez la table des résultats (Figure 7A) et traitez les données plus en détail selon les besoins.

Results

Pour démontrer l’application de notre flux de travail de protéomique d’histones unicellulaire utilisant notre système, nous avons analysé des sphéroïdes de cellules HepG2/C3A traitées avec 5 mM de butyrate de sodium pendant 24 heures. Après l’acquisition de LC-MS/MS, les données brutes ont été traitées avec EpiProfile pour un marquage léger (anhydride propionique) et lourd (anhydride propionique-d10), obtenant des données normalisées représentant les abondances des peptides et des marques d’histones. Le package QuantQC R...

Discussion

La capacité à mesurer les modifications post-traductionnelles des histones au niveau de la cellule unique représente une étape cruciale pour comprendre la véritable hétérogénéité de la régulation de la chromatine. Les méthodes traditionnelles en vrac ont fourni des informations précieuses sur la distribution moyenne des hPTM dans les tissus, mais elles masquent une variabilité cellulaire de plus en plus reconnue comme biologiquement^{significative 5}. Les approches p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 & micro ; Pointes de pipet à large calibre en L	Fisher Scientific	14222703
200 & micro ; Pointes de pipet à large calibre en L	Fisher Scientific	14222730
Plaque PCR à 384 puits Lo Bind  ;	Eppendorf	30129547
Collecteur à vide à 96 puits	Millipore	MAVM0960R
Acétonitre, grade Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Feuilles de plaque PCR adhésives	Thermo Fisher	AB0626
Acétonitrile anhydre	Fisher Scientific	AA42311AK	Solution de stock d’étiquettes pour le vrac.
Arg-C Ultra, Mass Sspect Grade	Promega	VA1831
Eau de qualité en culture cellulaire	Corning	25-055-CV
CellenVIALS	SCIENION	/	Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation
DMSO, anhydre	Thermo Fisher	D12345	Solution de stock pour les étiquettes
TDT	Sigma	D0632-5G
Eagle’s Medium modifié (DMEM) de Dulbecco	Fisher Scientific	MT17205CV
Sérum fœtal bovin	Fisher Scientific	MT35010CV
Acide formique	Thermo	28905
Acide formique 98 % et ndash ; 100 % pour LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
La solution salée équilibrée de Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher	11344041
Acétonitrile de qualité HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Eau de qualité HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Solution d’hydroxylamine 50  ;p/ % dans H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25015CI
Détergent n-Dodécyl-bêta-Maltoside (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Acides aminés non essentiels	Fisher Scientific	MT25025CI
Spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldéhyde 16 % de Solution aqueuse de qualité EM	Sciences de la microscopie électronique	15710-S
PDC-CM (revêtement de type 2)	SCIENION	/	Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation
Pénicilline-Streptomycine	Fisher Scientific	MT3002CI
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS), 10x, pH 7,4, sans RNase	Thermo Fisher	AM9625
Diméthylsulfoxyde de Pierce (DMSO), grade LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistolet à pipette	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Anhydride propionique &ge ; 99%	Sigma	240311-50G
Anhydride propionique-d10 & ge ; 98 atomes % D, &ge ; 99 % (CP)	Sigma	615692-1G
Centrifugeuse réfrigérée	Thermo	75-217-420
Lames en verre revêtu SciCHIP H1	SCIENION	/	Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation
Concentrateur à vide SpeedVac (plaques à 96 puits)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Cagoule stérile	Thermo	1375
Pipettes sérologiques stériles	Fisher Scientific	1367549
Coloration verte des cellules mortes SYTOX, pour la cytométrie en flux	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzyme (1X), sans phénol rouge	Thermo Fisher	12604013
Vortex	Sigma	Z258415
Bain marie	Fisher Scientific	FSGPD10