Article de méthode

Caractérisation de la sécrétion de vésicules extracellulaires dérivées des adipocytes à l’aide d’un modèle murin rapporteur CD63-GFP in vivo et in vitro

DOI :

10.3791/69670

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5 décembre 2025

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1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole utilise une lignée de souris rapporteure CD63-GFP spécifique aux adipocytes pour visualiser et quantifier la sécrétion de vésicules extracellulaires (EV) dérivées des adipocytes et démontrer leur captation par les cellules progénitrices, révélant une voie paracrine au sein du tissu adipeux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les adipocytes sont de plus en plus reconnus comme des cellules endocriniennes actives qui sécrètent des quantités importantes de VE enrichis en protéines, lipides et acides nucléiques. Cependant, les mécanismes régissant la sécrétion des VE et la dynamique de leur libération dans différents contextes biologiques ne sont pas entièrement compris. Pour combler cette lacune, nous avons généré une nouvelle gamme de souris rapporteur CD63-GFP spécifique aux adipocytes, dans laquelle l’expression du CD63 marqué GFP est pilotée par le promoteur d’adiponectine, permettant un marquage sélectif et un suivi des AdEV in vivo. En utilisant ce modèle de reporter, nous avons examiné la sécrétion des VAD et leur livraison aux CPA au sein des tissus adipeux. L’imagerie confocale et la cytométrie en flux ont révélé que les VA sont activement absorbées par les CPA, mettant en lumière un mécanisme de communication paracrine auparavant sous-estimé dans le microenvironnement adipeux.

Pour compléter les études in vivo , un système in vitro a été mis en place, permettant la surveillance directe de la sécrétion de VE à partir des adipocytes différenciés. Les APC ont été isolés à partir de tissus adipos blancs sous-cutanés des souris rapporteures et induits à se différencier en adipocytes matures. Dans ces cellules, les signaux CD63-GFP ont été observés comme des points discrets et se sont enrichis à la membrane plasmique lorsque la sécrétion de EV a été inhibée, ce qui correspond à une accumulation de vésicules lors d’une libération bloquée. Dans des conditions normales de croissance, les EV sécrétés dans le milieu de culture étaient concentrés puis purifiés par chromatographie d’exclusion de taille, permettant des analyses fonctionnelles et biochimiques en aval.

Cette plateforme peut être appliquée aux APC dérivés d’autres dépôts adipos, tels que les tissus adipeux blancs et bruns épididymes, ou en les différenciant en adipocytes spécifiques à chaque dépôt, permettant ainsi des comparaisons de la sécrétion de VE entre différents types d’adipocytes.

Ensemble, ces approches introduisent un outil génétique robuste et un système complémentaire in vitro pour disséquer la dynamique de la sécrétion et du ciblage de l’AdEV. Ces avancées éclairent la communication cellulaire intra-adipreuse et posent les bases de la compréhension de l’influence métabolique plus large des VA dans la santé et la maladie.

Introduction

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Le tissu adipeux est de plus en plus reconnu comme un organe endocrinien dynamique ayant des rôles clés dans l’homéostasie énergétique de tout lecorps 1,2,3,4,5. Au-delà de sa fonction classique de dépôt de stockage lipidique, les adipocytes régulent la sensibilité systémique à l’insuline, et les perturbations de la masse adipeuse — qu’elles soient en excès ou en carence — sont liées à la résistance à l’insuline et aux maladiesmétaboliques 6,7,8,9. Un mécanisme proposé pour contribuer à cette capacité régulatrice est la communication intercellulaire via des facteurs sécrétés. Bien que les adipocytes soient bien établies comme signaux endocriniens clés du tissu adipeux 10,11,12,13,14,15,16,17,18, les adipocytes libèrent également un nombre important de vésicules extracellulaires (EV), des particules membranaires contenant des lipides, des protéines, des acides nucléiques et des métabolites. On ne sait toujours pas si les VE sécrétés par les adipocytes (AdEV) contiennent également des glycanes, comme d’autres types de VE,1920, 21, 22, 23, 24. Il a été prouvé que les adipocytes sont une source majeure de VE, car environ 80 % des microARN exosomaux circulants proviennent d’adipocytes dans des modèles murins, comme démontré chez des souris knockout spécifiques aux adipocytes sous conditionsde base 25. Les rôles des VDA dans le métabolisme, l’inflammation, la sensibilité à l’insuline et l’adipogenèse ont été rapportés, mais restent incomplètement compris 26,27,28,29. D’autres fonctions potentielles, notamment dans la médiation de la diaphonie avec d’autres types cellulaires et organes, restent largement inconnues. L’abondance26 des VE suggère qu’ils pourraient jouer un rôle important dans la signalisation locale et systémique, mais la signification biologique et les mécanismes d’action des VE restent largement inexplorés. Cette lacune de connaissances met en lumière la nécessité de méthodes robustes et spécialisées pour étudier la sécrétion et le fonctionnement des ADEV.

Pour combler cet écart, nous avons généré des souris CD63-GFP spécifiques aux adipocytes (AdipCD63-GFP) en croisant des souris Adiponectin-Cre avec des souris Stopfl/fl/CD63-GFP (souche # :036865, JAX). Les portéesStop fl/fl/CD63-GFP, qui n’exprimaient pas CD63-GFP en l’absence de Cre, ont été utilisées comme témoins. La souche rapporteure CD63-GFP a été utilisée avec succès pour tracer in vivo des EV spécifiques à un type cellulaire, y compris les EV dérivés de l’endothéliumet des neurones 30,31. Puisque l’adiponectine est exprimée uniquement dans les adipocytes matures et non dans les cellules progénitrices des adipocytes (APCs)32,33, et que CD63 est un marqueur des EVs34, les EVs GFP+ détectés dans la circulation et les tissus peuvent être spécifiquement identifiés comme des ADEV. Ainsi, dans cette étude, les VE GFP+ détectés dans les APC sont interprétés comme des VE absorbés par ces cellules progénitrices. Ce système de rapporteur permet une surveillance directe de la libération de vésicules et des interactions potentielles cibles in vivo et in vitro, permettant l’étude des ADEV dans d’autres types cellulaires de tissu adipeux. Il est important de noter que les VE sont particulièrement riches en lipides comparés aux EV d’autres types cellulaires, ce qui les rend plus flottants, fragiles et difficiles à récupérer avec les méthodes traditionnelles d’ultracentrifugation 35,36,37. Des forces centrifuges élevées peuvent endommager ces vésicules ou entraîner une perte et contamination significatives d’échantillons, compliquant l’analyse en aval. Pour surmonter ces limitations, nous avons optimisé un flux de travail combinant plusieurs étapes de centrifugation à basse vitesse avec la chromatographie par exclusion de la taille, ce qui minimise les contraintes de cisaillement, préserve l’intégrité des vésicules et améliore la pureté et le rendement, permettant une quantification précise et des études fonctionnelles. Ensemble, le système CD63-GFP et ce pipeline d’isolation optimisé offrent une approche accessible et reproductible pour étudier la sécrétion et la fonction des AdEV dans la diaphonie du tissu adipeux et la régulation métabolique systémique.

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Protocole

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Conformément aux directives de soins et d’utilisation des animaux du Albert Einstein College of Medicine, les souris mâles ont été hébergées en groupe à 22 °C avec une humidité relative de 30 à 70 % sur un cycle de 12 heures de lumière et d’obscurité de 12 heures, ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, et ont été maintenues sur un fond C57BL/6J.

1. Détection in vivo des AdEV sécrétés par captation par les APC

  1. Préparation des tampons
    1. Tampon de digestion : Préparez le DMEM tamponné par HEPES en ajoutant 0,5 mL de 1 M HEPES et 0,5 g d’albumine sérique bovine pauvre en acides gras (BSA) à 50 mL de DMEM. Mélangez jusqu’à ce que ce soit dissous.
    2. Tampon de lavage : Préparez le PBS avec 2,5 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) et 4 % de sérum bovin fœtal (FBS).
    3. Préparez une réserve de Liberase et de DNase à 5 mg/mL et à 5 KU/mL. Conserver à -20 °C. Dégel immédiatement avant utilisation.
  2. Collecte et digestion du tissu adipeux inguinal
    REMARQUE : Les souris témoins AdipCD63-GFP et CD63-GFP âgées de quatre mois ont été euthanasiées par inhalation de dioxyde de carbone.
    1. Exciser les tissus adipos à l’aide de la technique stérile et placer 1 g de tissu dans 0,5 mL de tampon digestif, puis hacher finement les tissus à l’aide de ciseaux stériles en morceaux d’une taille ne dépassant pas 1 mm.
    2. Suspendez le tissu haché dans 10 mL de tampon digéré contenant 0,5 mg/mL de libérase et 50 U/mL de DNase 1.
    3. Incubez à 37 °C sur un vibrateur orbital (100 tr/min) pendant 30 à 60 minutes. Mélangez doucement le tissu en inversant le tube plusieurs fois pendant l’incubation. Lorsque la solution apparaît trouble et qu’aucun fragment de tissu visible ne subsiste, la digestion est considérée comme terminée.
  3. Isolement des APC
    1. Diluez la suspension avec deux volumes de tampon de digestion et inversez doucement le tube 3 à 4 fois.
    2. Passer à travers un filtre stérile de 100 μm pour éliminer tout tissu non digéré.
    3. Centrifugez le filtrat à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    4. Écartez la partie adipocytaire surnageante et identifiez la pellete comme fraction vasculaire stromale (SVF).
    5. Préparez un tampon de lyse frais à 1× globules rouges (RBC) avec de l’eau stérile. Lyser les globules rouges dans la SVF en les incubant sur la glace pendant 5 minutes, à l’abri de la lumière.
    6. Ajoutez deux volumes de tampon de lavage, puis filtrez à la centrifugeuse à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    7. Suivez le protocole kit d’isolement des progéniteurs du tissu adipeux (souris), resuspendez la SVF dans 80 μL tampon (PBS, pH 7,2, 0,5 % de BSA, 2 mM EDTA) par gramme de tissu.
    8. Ajoutez 20 μL de cocktail de déplétion des progéniteurs non adipocytaires par gramme de tissu.
    9. Mélangez et faites couver pendant 15 minutes à 2-8 °C dans le noir.
    10. Faites passer l’échantillon dans la colonne LS et collectez le flux traversant.
    11. Centrifugez le flux (négatif pour CD31, CD45, Ter119) à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour obtenir les APC pour l’étude.
  4. Détection des VAD sécrétés par captation de CPA par microscopie confocale
    1. Semez 250 μL de CPA isolées (1 × 104 cellules/mL) provenant de souris AdipCD63-GFP ou CD63-GFP sur des lames à 8 puits recouvertes de collagène et permettent aux cellules de s’attacher pendant environ 6 heures.
    2. Fixez les cellules avec du paraformoldéhyde à 4 % pendant 10 minutes pour préserver les structures cellulaires et EV pour l’imagerie.
      REMARQUE : Dans ces tests, les signaux GFP marquent les AdEV, et leur détection dans les APC par microscopie confocale indique la capture des AdEV par ces cellules progénitrices.
    3. Lavez les lames trois fois avec du PBS, montez avec un milieu antidéfade, et capturez les signaux GFP à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif d’immersion à l’huile de 63×. Acquérir des images sous forme de piles série z avec une taille de pas de 0,5 μm, en utilisant un laser de 488 nm pour l’excitation GFP et la détection d’émission à 500-550 nm.
  5. Détection des VA sécrétés via l’absorption des APC par cytométrie en flux
    1. Comptez les APC et diluez le colorant de viabilité (par exemple, Zombie) à 1:1000 dans un PBS 1X. Suspendre les cellules à 1 × 106 par 100 μL. Incuber pendant 20 minutes sur la glace, protégé de la lumière.
    2. Laver les cellules une fois avec un tampon de lavage. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    3. Suspendre les cellules dans un tampon de coloration brillante à 1 × 106 cellules par 100 μL.
    4. Bloquez la liaison non spécifique avec le réactif bloqueur des récepteurs Fc (par exemple, anti-CD16/CD32) à 1:100 sur glace pendant 10 minutes.
    5. Pré-spin l’anticorps Sca-1 à 6 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Ensuite, ajoutez 1 μL d’anticorps Sca-1 au tube APC et faites couver pendant 20 minutes sur de la glace, en gardant le tube couvert de papier aluminium.
    6. Lavez deux fois avec 1 mL de tampon de lavage, centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
    7. Suspendre les cellules dans un tampon de lavage autour de 1 × 106 cellules par 500 μL pour le tri par cytométrie en flux. Acquérir des données pour les cellules Sca1+ et GFP+ sur un cytomètre à flux spectral équipé d’un laser violet 405 nm (filtre 450/50 nm pour Pacific Blue) et d’un laser bleu 488 nm (filtre 530/30 nm pour GFP). Analysez les échantillons à l’aide du logiciel en cours d’exécution de l’instrument, avec des cellules Sca1+ verrouillées, et le sous-ensemble GFP+ de cette population analysé, comme montré à la Figure 2.

2. Détection et analyse des AdEV sécrétés in vitro

  1. Différenciation des APC en adipocytes matures
    REMARQUE : Toutes les cultures sont maintenues à 37 °C, 8 % deCO2 sauf indication contraire.
    1. Jour 0 : Enrober des plats de gélatine à 0,2 % pendant 30 minutes à température ambiante (RT), aspirer et semer des APC fraîchement isolés dans DMEM/F12 + 15 % FBS + 1 % Pénicilline/Streptomycine (P/S) + 0,1 % de Primocin pour atteindre 100 % de confluence avant la différenciation.
    2. Jours 1-8 : Remplacer par un milieu de différenciation adipogénique MesenCult (50 mL au total : 45 mL de base + 5 mL de complément + 0,5 mL de GlutaMAX + 50 μL de Primocine), puis passer à un nouveau milieu de différenciation au jour 4.
    3. Jour 9 : Laver les adipocytes deux fois avec du PBS, puis remplacer par un milieu de culture d’adipocytes matures (DMEM +1 % BSA + 0,2 % Primocine) et maintenir pendant 16 heures.
  2. Isolation et purification des AdEV
    1. Laissez passer une culture d’adipocytes de 15 mL générée ci-dessus, d’abord à travers un filtre de 40 μm puis un filtre de 30 μm.
    2. Centrifugez le filtrat à 500 × g pendant 5 minutes, puis 2 000 × g pendant 10 minutes pour éliminer les cellules résiduelles et les débris.
    3. Faites passer le filtrat à travers un filtre de 0,8 μm, puis concentrez le milieu de 15 mL à 0,5 mL à l’aide d’une unité d’ultrafiltration de 100 kDa (volume d’échantillon de 15 mL) en centrifugant à 4 000 × g pendant 15 minutes.
    4. Chargez l’échantillon sur les colonnes de chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec un collecteur automatique de fractions et collectez les fractions F1-8.
    5. Concentrez les fractions EV collectées à l’aide d’une unité d’ultrafiltration de coupure de 100 kDa (volume d’échantillon de 4 mL) et procédez à la vérification du contenu EV de chaque fraction par western blot, un instrument d’analyse de suivi de nanoparticules et une microscopie électronique de transmission (TEM).
  3. Validation, quantification et évaluation de la taille/morphologie des AdEV
    1. Analyse Western blot des marqueurs EV
      1. Concentrez chaque fraction de 400 μL à 25 μL, puis ajoutez 50 μL de tampon de test de radioimmunoprécipitation (RIPA) complétés avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Dénaturez les échantillons en ajoutant un tampon chargé de 2× de dodécyle sulfate de sodium (SDS) et en résolvant les protéines sur un gel trisglycine à 4-12 %.
    2. Analyse de la taille, de la concentration et de la qualité des EV à l’aide d’un instrument d’analyse de suivi de nanoparticules.
      1. Avant analyse, diluez les échantillons de VE avec un PBS stérile filtré à 0,1 μm à un rapport de 1:1000, afin de garantir que la concentration des particules reste dans la plage de détection optimale (environ 107-10 9 particules/mL). Mélangez délicatement les échantillons dilués pour éviter la formation de bulles.
      2. Chargez l’échantillon dans l’instrument équipé d’une caméra scientifique complémentaire à semi-conducteur métallique (sCMOS) à haute sensibilité, d’un module laser vert de 532 nm, et d’un seuil de détection de 10 nm (jusqu’à 1 000 nm) / 106 à 109 particules/mL.
      3. Effectuez l’imagerie et la quantification à l’aide de la suite logicielle NS Xplorer, qui applique un algorithme dynamique basé sur le volume d’observation basé sur la concentration.
    3. Examen de la morphologie des EV par microscopie électronique de transmission (TEM)
      1. Soumettre 50 μL de VE, prélevés avant concentration, à l’installation centrale pour la coloration négative des VE. Appliquez les VE sur des grilles en cuivre de 400 mailles uniquement en carbone, nettoyées au plasma avec un nettoyant plasma.
      2. Après une brève adsorption, rincez les grilles à l’eau distillée, colorez négativement avec de l’acétate d’uranyle à 1 % (p/v), puis retirez l’excès de tache avec du papier filtre avant de les sécher à l’air. Ensuite, imagez les grilles à l’aide d’un microscope électronique à transmission fonctionnant à 120 KV.

3. Informations sur la sécurité et les déchets

  1. Manipulez le paraformoldéhyde et l’acétate d’uranyle dans une hotte à fumée avec un équipement de protection individuelle (EPI), car les deux sont toxiques. Collectez les déchets d’acétate d’uranyle dans des contenants dangereux marqués.
  2. Traiter tous les échantillons biologiques comme potentiellement infectieux et éliminer les matériaux conformément aux politiques et protocoles de biosécurité institutionnels approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC).

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Résultats

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En utilisant ce protocole de détection des ADEV par captation des APC par microscopie confocale, nous avons isolé les APC des tissus adipos inguinaux de souris AdipCD63-GFP et Stopfl/fl/CD63-GFP, puis les avons colorés avec DAPI pour visualiser les noyaux. Lors de l’examen par microscopie confocale, les APC de souris Stopfl/fl/CD63-GFP n’ont montré aucun point de GFP détectable (Figure 1A). En revanche, les APC isolées sur des souris AdipCD63-GFP présentaient de nombreu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit comble une lacune méthodologique importante en fournissant un système robuste et reproductible pour isoler et caractériser les VA et leur adoption par les APC. Comparés aux VE d’autres sources, les ADEV sont plus riches en lipides et flottants, ce qui rend les techniques classiques d’isolation des VE basées sur l’ultracentrifugation moinsefficaces 35. Cependant, la plupart des protocoles publiés pour la purification des ADEV dépendent encore de...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Einstein Flow Cytometry Core pour FACS, ainsi que l’Analytical Imaging Facility pour toutes les analyses d’images. Ce travail a été en partie soutenu par des subventions des National Institutes of Health DK128839 et par des subventions de soutien au centre de cancérologie du NCI, P30CA013330.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260G500x dilution
10x PBSFisher Scientific70-013-032Dilution 1000x avec de l’eau
1 M HEPESGibco15630080Dilution 1000x
Kit d’isolement des progéniteurs du tissu adipeux, sourisMiltenyi biotec30-106-639Prêt à être utilisé
Filtre centrifuge Amicon Ultra, MWCO 100 kDaSigmaUFC9100Volume d’échantillon de 15 mL
Filtre centrifuge Amicon Ultra, MWCO 100 kDaSigmaUFC9100Volume d’échantillonnage de 4 mL
BSASigmaA6003Prêt à être utilisé
Anticorps contre la calnexineCalnexinab22595Dilution 1000x
Anticorps CD63Abcamab217345500x dilution
CD81Technologie de signalisation cellulaire10037s500x dilution
Corning  ; BioCoat  ; Diapositive de culture collagène ISigmaCLS354630Prêt à être utilisé
Corning  ; Filtre cellulaireSigmaCLS43175040 & mu ; m taille des pores
Corning  ; Filtre cellulaireSigmaCLS431752100 & mu ; m taille des pores
Anticorps COX IVTechnologie de signalisation cellulaire4844Dilution 1000x
DMEMGibco11965092Prêt à être utilisé
DMEM/F-12, complément GlutaMAXThermofisher10565018Prêt à être utilisé
Dnase 1SigmaD4513Stock 5 KU/mL à -20 ° ; C
Supplément GlutaMAXGibco35050061Dilution 100x
Halt & Trade ; Cocktail inhibiteur de protéase et phosphatase (100X)Thermofisher78444Prêt à être utilisé
Anticorps HSP70Abcamab181606Dilution 1000x
Tampon de lyse des globules rouges 10X Invitrogen eBioscience (Multi-espèces)Fisher Scientific50-112-9743Dilution 10x dans l’eau
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Prêt à être utilisé
Microscope confocal LEICA STELLARIS 8Leica MicroscopesN/A
Libérase TM Grade de rechercheSigmaLIBTM-ROMettez en stock 5 mg/mL à -20 & degrés ; C
Filtre à seringue Millex MCESigmaSLAA0250,8 & mu ; m taille des pores
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Mini gels protéinés Tris-Glycine Novex, 4&ndash ; 12%,ThermofisherXP04120BOXPrêt à être utilisé
Tampon d’échantillon SDS Tris-Glycine Novex (2x)ThermofisherLC2676Prêt à être utilisé
Anticorps anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) bleu du PacifiqueBioLegend108119Dilution 25x
Solution de paraformodéhyde (16 %)Fisher Scientific50-980-487diluer à 4 % avec PBS
pluriStrainer S / 30 & micro ; m (Filtre cellulaire)Fisher ScientificNC092245930 & mu ; m taille des pores
Solution de Ponceau SSigmaP7170-1LPrêt à être utilisé
PrimocinInvivogenNC9141851500x dilution
Réactif ProLong Gold Antifade avec DAPITechnologie de signalisation cellulaire8961SPrêt à être utilisé
Anticorps anti-souris purifié CD16/32BioLegend101301Dilution 100x
Tampon RIPA   ;Fisher ScientificPI89900Dilution 10x dans l’eau
Cytomètre à flux spectral (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Anticorps de syntaxine 4Systèmes synaptiques1100425000x dilution
Tecnai 20 (Microscope électronique à transmission)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Anticorps de vinculineAbcamab185085000x dilution

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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