Article de recherche

L’ARN non codant long IRAIN entraîne la reprogrammation immunométabolique dans le gliome via l’axe IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

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DOI :

10.3791/69711

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12 décembre 2025

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1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Grâce à l’apprentissage automatique intégré à travers plusieurs cohortes, nous avons construit une signature pronostique IMRG robuste pour le gliome. L’IRAIN est fortement régulé à la baisse, inversement lié au grade et à la survie, et supprime la signalisation IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, limitant la prolifération, la migration et l’angiogenèse. Les résultats désignent l’IRAIN et les IMRG comme biomarqueurs et cibles thérapeutiques.

Résumé

Le gliome est une malignité agressive avec des options thérapeutiques limitées et un pronostic faible. Sa progression est étroitement liée à la reprogrammation métabolique et à l’évasion immunitaire, soulignant la nécessité d’identifier les régulateurs moléculaires qui intègrent ces processus. Ici, nous avons établi une signature pronostique robuste du gène immunométabolique (IMRG) et élucidé le rôle de l’ARN non codant long IRAIN dans la régulation de l’immunométabolisme du gliome via l’axe IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Les données transcriptomiques et cliniques des cohortes TCGA, CGGA (693/325) et GEO (GSE43378) ont été analysées. L’expression différentielle et l’analyse pondérée des réseaux de co-expression génique (β = 8) ont permis une topologie sans échelle, et un cadre de validation croisée leave-one-out combinant dix algorithmes d’apprentissage automatique a produit 101 modèles pronostiques. La signature IMRG optimale de 17 gènes a été validée sur toutes les cohortes et a prédit indépendamment la survie globale. Les tests fonctionnels ont démontré que la surexpression de l’IRAIN inhibait l’IGF1R, supprimait la phosphorylation de JAK2/STAT3 et régulait à la baisse BIRC5, favorisant ainsi l’apoptose et réduisant l’angiogenèse. Une faible expression d’IRAIN corrélée aux Tregs immunosuppresseurs et aux macrophages M2 ainsi qu’à des scores élevés de microenvironnement tumoral, suggérant un phénotype immuno-évasif. Ces résultats établissent IRAIN comme un régulateur clé de la reprogrammation immunométabolique du gliome et valident la signature IMRG comme un outil pronostique fiable, mettant en avant la voie IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 comme un pont mécaniste reliant la régulation immunitaire et métabolique dans le gliome et offrant des cibles potentielles pour la thérapie de précision.

Introduction

Le gliome représente la malignité primaire la plus courante du système nerveux central et reste l’un des cancers humains les plus mortels malgré les progrès en neurochirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. Les gliomes de haut grade, en particulier le glioblastome multiforme (GBM), se caractérisent par une prolifération rapide, une infiltration diffuse et une récidiveinévitable 1,2. Récemment, une gamme d’approches thérapeutiques efficaces a vu le jour, telles que les interventions chirurgicales, l’immunothérapie et lachimiothérapie 3. La survie médiane reste d’environ 14 à 18 mois, même avec une thérapie maximale, ce qui souligne la nécessité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de biomarqueurspronostiques 4.

L’interaction entre le microenvironnement tumoral (TME) et les cellules cancéreuses est essentiellement à l’origine de la croissance agressive et de l’hétérogénéité moléculaire des gliomes. De nombreux constituants immunitaires, notamment la microglie, les cellules précurseurs neuronales, les cellules vasculaires et les cellules immunitaires adaptatives, sont étroitement impliqués dans la formation duTME 5,6,7. Ces dernières années ont vu des avancées remarquables en immunothérapie, inaugurant une ère de transformation en oncologie. Néanmoins, le blocage des points de contrôle immunitaires (ICB) et d’autres approches immunothérapeutiques n’ont montré que des succès limités dans legliome 8. L’échec de l’immunothérapie dans ce contexte découle de plusieurs caractéristiques intrinsèques du microenvironnement du gliome : une faible charge mutationnelle tumorale, une hétérogénéité intratumorale prononcée, une faible perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, une régulation à la baisse des principales molécules du complexe histocompatibilité et une infiltration clairsemée des lymphocytesT 9,10,11,12.

De plus en plus de preuves suggèrent que le microenvironnement tumoral (EMT), qui présente un dysfonctionnement métabolique, est caractérisé par des conditions acides, une privation de nutriments et l’accumulation de métabolites qui suppriment les réponses immunitaires. Cette affection entraîne ensuite un dysfonctionnement des cellules immunitaires qui infiltrent les tumeurs et diminue l’efficacité del’immunothérapie 13. Simultanément, les cellules immunitaires au sein du TME subissent des changements métaboliques dépendants du contexte qui dictent leur différenciation et leurs fonctions effectrices. Par exemple, les lymphocytes T activés dépendent de la glycolyse pour une prolifération rapide, tandis que les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et les macrophages associés aux tumeurs (TAM), en particulier le sous-type M2, dépendent de la phosphorylation oxydative et du métabolisme des acides gras pour maintenir leur activitéimmunosuppressive 14,15.

Ainsi, l’intégration des signatures immunitaires et métaboliques offre un cadre rationnel pour mieux classifier les gliomes et prédire le pronostic du patient. Les ARN longs non codants (ARNnc) sont récemment apparus comme des régulateurs polyvalents de l’architecture de la chromatine, de la transcription génique et de la modification post-transcriptionnelle. Plusieurs ARNnc ont été impliqués dans la pathogenèse du gliome, influençant la prolifération, l’invasion et la modulationimmunitaire 16. Parmi eux, le transcript antisens imprimé IRAIN (ARN non codant protéique imprimé IGF1R) a attiré l’attention pour son rôle dans la régulation du gène du récepteur du facteur de croissance similaire à l’insuline 1 (IGF1R) via les interactions de la chromatine cis-agissante, qui s’est avéré être sous-régulé et diminuer le contrôle de la compétition cis, notamment dans les cellules cancéreuses telles que le cancer du sein et les lignées cellulaires leucémiques, Cancer du larynge et leucémie myéloïde aiguë, qui conduit directement à une régulation à la hausse del’IGF1R 17,18,19. Parce que la signalisation IGF1R active les voies JAK-STAT et PI3K-AKT en aval — toutes deux centrales pour la croissance tumorale et la régulationimmunitaire 20,21 — les altérations de l’expression de l’IRAIN peuvent affecter de manière critique l’immunométabolisme tumoral. Cependant, le rôle de l’IRAIN dans le gliome et son impact potentiel sur le paysage immunométabolique n’ont pas encore été élucidés. Combler cette lacune de connaissances pourrait fournir un aperçu mécaniste de la manière dont les ARN non codants coordonnent l’adaptation métabolique et l’évasion immunitaire dans le gliome.

Dans cette étude, nous avons combiné des données transcriptomiques multi-cohortes avec une validation expérimentale afin d’explorer la régulation immunométabolique du gliome. En utilisant des cadres intégrés d’apprentissage automatique à travers les cohortes TCGA, CGGA (693/325) et GEO (GSE43378), nous avons identifié une signature pronostique robuste de 17 gènes immunométaboliques liés (IMRG) capable de stratifier la survie des patients à travers les ensembles de données. Nous nous sommes ensuite concentrés sur IRAIN comme régulateur potentiel en amont de ce réseau, compte tenu de son interaction prévue avec l’axe de signalisation IGF1R-JAK-STAT. Les tests fonctionnels ont révélé que la surexpression de l’IRAIN supprime la prolifération du gliome et l’angiogenèse en inhibant l’expression d’IGF1R et la phosphorylation en aval de STAT3, ce qui réduit l’expression de la protéine anti-apoptotique BIRC5 (également appelée Survivin). Pris ensemble, ces résultats soutiennent un modèle fonctionnel dans lequel IRAIN fonctionne comme un pont mécaniste reliant la régulation immunitaire et la reprogrammation métabolique dans le gliome. Nous émettons l’hypothèse qu’une expression dérégulée de l’IRAIN favorise la progression tumorale en perturbant cet équilibre, favorisant ainsi un microenvironnement immunosuppresseur et conférant une résistance à la thérapie.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des tissus humains respectaient les directives institutionnelles et la Déclaration d’Helsinki, et ont été approuvées par le Conseil d’Éthique Institutionnelle de l’Université Médicale du Fujian (Approbation n° 2021KYB089). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant le prélèvement des tissus.

Analyse de l’expression et de la survie génique
Les données de séquençage de l’ARN et les informations cliniques correspondantes ont été obtenues à partir de plusieurs bases de données publiques. 1) Cohorte TCGA : Les données RNA-seq (FPKM) pour 175 échantillons de glioblastome multiforme (GBM) et 534 de gliome de bas grade (LGG) ont été téléchargées depuis The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/) ; 2) Contrôles normaux : Les profils d’expression de 211 tissus cérébraux normaux et 662 tissus gliomes ont été téléchargés depuis la base de données UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/) ; 3) Validation externe : Les données des cohortes CGGA693 et CGGA325 ont été obtenues à partir de l’Atlas du génome du gliome chinois (http://www.cgga.org.cn) ; 4) Jeu de données GEO : Le jeu de données GSE43378, contenant les données d’expression et cliniques de 50 échantillons de gliome, a été téléchargé depuis le Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Toutes les données brutes de comptage ont été converties en transcriptions par million (TPM) et transformées enlogarithèmes 2. Pour les ensembles de données déjà normalisés, des matrices d’expression ont été examinées afin d’assurer des distributions comparables. Les gènes présentant des valeurs de TPM < 1 sur plus de 80 % des échantillons ont été exclus. Les informations cliniques manquantes (âge, statut IDH, codélétion 1p/19q, méthylation MGMT) ont été supprimées à l’aide d’un filtrage complet-case. Les effets de lot entre ensembles de données ont été ajustés à l’aide de l’algorithme ComBat implémenté dans le paquet R sva. Les valeurs d’expression ont été standardisées par transformation z-score au sein de chaque ensemble de données. Les analyses de survie ont été réalisées à l’aide des packages R survival et survminer. Les patients ont été dichotomisés en groupes à haute et basse expression selon le niveau médian d’expression d’IRAIN. Des courbes de survie de Kaplan-Meier ont été générées, et la signification statistique a été évaluée par le test log-rank. Les rapports de risques (HR) et les intervalles de confiance (IC) à 95 % ont été estimés à l’aide de modèles de régression des alancs proportionnels de Cox.

Définition des ensembles de gènes immunitaires et métaboliques
Les gènes liés au système immunitaire (IRG, n = 2 483) ont été obtenus à partir de la base de données ImmPort (https://www.immport.org/shared/), et les gènes liés au métabolisme (MRG, n = 948) ont été obtenus à partir de la Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). L’ensemble combiné de ces gènes a été défini comme étant des gènes liés à l’immunométabolisme (IMRG). Ces listes de gènes servaient de référence pour les analyses ultérieures d’expression différentielle et de réseau.

Expression différentielle et analyse des réseaux de co-expression génique pondérée
Des gènes différenciellement exprimés (DEG) entre le cerveau normal et les tissus gliomes ont été identifiés à l’aide du limma du paquet R. Les données d’expression ont été adaptées à un modèle linéaire suivi d’une modération bayesique empirique. Gènes avec |log₂ changement de replie| > 1,5 et le taux de fausses découvertes (FDR) < 0,05 étaient considérés comme exprimés de manière significativement différentielle. L’analyse pondérée du réseau de co-expression génique (WGCNA) a été réalisée à l’aide du package R WGCNA. Les échantillons aberrants ont été exclus par regroupement hiérarchique. La puissance de seuil souple a été réglée à β = 8 pour obtenir un indice d’ajustement topologique sans échelle (R2 ≥ 0,85) tout en maintenant une connectivité moyenne adéquate. Des matrices de chevauchement topologique (TOM) ont été construites, et les gènes ont été regroupés en modules d’une taille minimale de 50 à l’aide de l’algorithme de coupe dynamique en arbre. Les eigengènes du module étaient corrélés aux traits cliniques, et le module le plus fortement associé au gliome (Pearson r > 0,7, P < 1×10-10) a été sélectionné pour l’identification du gène central.

Construction de modèles pronostiques basés sur l’apprentissage automatique
Un cadre complet de validation croisée leave-one-out (LOOCV) intégrant dix algorithmes d’apprentissage automatique a été appliqué pour construire et évaluer des modèles pronostiques. Au total, 101 flux de travail combinatoires ont été mis en œuvre en utilisant la cohorte TCGA comme jeu de données d’entraînement. Les gènes immunométaboliques associés au pronostic (IMRG) ont d’abord été identifiés par régression de Cox univariée (P < 0,05). Le modèle optimal a été déterminé en maximisant l’indice de concordance de Harrell moyen (C-index) à travers trois ensembles de données de validation (CGGA693, CGGA325 et GSE43378). Le modèle RSF-Enet résultant (α = 0,3) a démontré la performance prédictive la plus élevée et a maintenu une généralisabilité robuste à travers les cohortesindépendantes 22.

TME et infiltration immunitaire
Pour caractériser de manière exhaustive le paysage immunogénomique, nous avons utilisé une approche analytique à plusieurs niveaux. Premièrement, les niveaux d’infiltration immunitaire et stromique ont été quantifiés à l’aide de l’algorithmeESTIMATE 23. L’expression différentielle des principales molécules de points de contrôle immunitaires, dont PDCD1, CTLA4 et LAG3, a ensuite été évaluée par analyse basée sur des limmes, et les corrélations entre les gènes de points de contrôle ont été visualisées à l’aide de matrices de corrélation. Des profils de mutations somatiques provenant de 903 échantillons de gliome dans la cohorte TCGA ont été utilisés pour calculer les scores de charge mutationnelle tumorale (TMB), d’instabilité des microsatellites (MSI) et de dysfonction et d’exclusion immunitaire tumorale (TIDE) afin de prédire les réponses potentielles à l’immunothérapie. Les patients ont ensuite été stratifiés en quatre groupes pronostiques selon le stade combiné de la TMB (élevé/faible) et les scores de risque (élevé/bas), et les résultats de survie ont été comparés à l’aide de l’analyse de Kaplan-Meier.

Analyse de l’enrichissement fonctionnel
Des analyses d’enrichissement des voies de l’Ontologie Génique (GO) et de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées à l’aide du package clusterProfiler R. Les résultats d’enrichissement avec des valeurs de P ajustées < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs. Les processus biologiques surreprésentés, les composants cellulaires et les fonctions moléculaires ont été visualisés à l’aide de diagrammes de points et de diagrammes en barres. Les réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP) ont été construits à l’aide de la base de données STRING (≥ 0,4) et visualisés dans Cytoscape. Les modules fonctionnels au sein du réseau PPI ont été identifiés à l’aide de l’algorithme MCODE. Les interactions gène-gène et les réseaux de co-expression ont été approfondiment analysés à l’aide de GeneMANIA (score de confiance https://string-db.org ≥ 0,4) et visualisés dans Cytoscape. Les modules fonctionnels au sein du réseau PPI ont été identifiés à l’aide de l’algorithme MCODE. Les interactions gène et les réseaux de co-expression ont été approfondiment analysés à l’aide de GeneMANIA (https://genemania.org), qui intègre des informations sur les interactions physiques et génétiques, les voies partagées et les schémas de co-expression afin d’inférer des associations fonctionnelles potentielles.

Échantillons cliniques
Des tissus gliomes frais (n = 6) et des tissus cérébraux non tumoraux adjacents (n = 6 ; situés à au moins 3 cm du bord tumoral et histologiquement confirmés comme exempts de tumeur) ont été prélevés chez des patients subissant une résection de gliome primaire à l’Hôpital affilié de Zhangzhou de l’Université médicale du Fujian. Aucun des patients n’avait reçu de chimiothérapie ou de radiothérapie avant l’opération. Tous les diagnostics pathologiques ont été vérifiés indépendamment par deux neuropathologistes selon la classification 2021 de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) des tumeurs du système nerveux central. Immédiatement après l’excision chirurgicale, les échantillons de tissu étaient rincés avec du sérum physiologique phosphaté (PBS) glacé pour éliminer le sang résiduel, congelés instantanément dans de l’azote liquide (-196 °C), puis conservés à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.

Lignées cellulaires et culture cellulaire
Les lignées cellulaires humaines de glioblastome SHG44, U251, A172 et T98G, ainsi que des cellules gliales humaines normales (HEB), ont été prélevées à partir de dépôts authentifiés et confirmées exemptes de contamination par mycoplasmes avant utilisation. Les cellules ont été maintenues dans le milieu modifié Eagle’s Medium (DMEM, glucose élevé) de Dulbecco, complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1 % de pénicilline-streptomycine, à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. Les cellules étaient transmises tous les 4-5 jours après avoir atteint 80-90 % de confluence. Pour établir la surexpression de l’IRAIN-uri et contrôler les lignées cellulaires, les cellules ont été transduites avec des vecteurs lentiviraux portant le transcript IRAIN de pleine longueur ou un vecteur vide en témoin. Les clones stables ont été sélectionnés à l’aide de puromycine (2 μg/mL) pendant 14 jours. L’efficacité de la surexpression a été confirmée par la PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR) avant les tests en aval.

Essai de prolifération cellulaire du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT)
Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une densité de 1 × 104 cellules par puits dans 100 μL de milieu de culture complet. À 24, 48 et 72 h après le semis, 20 μL de solution MTT (5 mg/mL dans une solution saline tamponnée phosphate) ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 4 h à 37 °C. Le surnageant a ensuite été retiré, et 150 μL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) a été ajouté pour dissoudre les cristaux de formazan. La plaque a été légèrement agitée pendant 10 minutes pour assurer une solubilisation complète. L’absorbance a été mesurée à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Les relevés de fond des puits vierges ont été soustraits. La viabilité cellulaire a été calculée par rapport au groupe contrôle sur 24 heures (fixé à 1,0). Toutes les expériences ont été réalisées avec six réplications techniques et trois répliques biologiques indépendantes. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (DS), et la signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test t à deux côtés.

Cytométrie en flux pour l’apoptose (Annexin V - coloration FITC/PI)
Les cellules ont été ensemencées à 60-70 % de confluence et traitées pendant 24 heures dans les conditions indiquées. Des cellules flottantes et adhérentes ont été prélevées à l’aide de trypsine sans EDTA, combinées, puis lavées deux fois avec du PBS glacé. Les granulés cellulaires ont été resuspendus dans un tampon de liaison Annexin V (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mMCaCl 2) à 1 ×10 6 cellules/mL. Pour chaque échantillon, 100 μL de suspension ont été incubés avec 5 μL d’Annexin V-FITC et 5 μL d’iodure de propidium (PI ; 50 μg/mL) dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. Après l’ajout de 400 μL de tampon de liaison, les échantillons étaient maintenus sur glace et analysés en moins d’une heure sur un cytomètre de débit (excitation de 488 nm ; 530/30 nm pour le FITC et >585 nm pour le PI). Des témoins appropriés à coloration unique et fluorescence moins un ont été inclus pour compenser. Au moins 10 000 événements ont été enregistrés par échantillon. Les données ont été analysées par gating de quadrants : populations vivantes (Annexin V⁻/PI⁻), populations apoptotiques précoces (Annexin V⁺/PI⁻), apoptotiques tardives (Annexin V⁺/PI⁺) et nécrotiques (Annexin V⁻/PI⁺). Des pourcentages de cellules apoptotiques précoces + tardives ont été rapportés (moyenne ± de la DC, n = 3).

PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
L’ARN total a été isolé à l’aide d’un réactif acide phénol-guanidinium selon le protocole du fabricant. La pureté de l’ARN a été vérifiée par spectrophotométrie (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), et l’intégrité a été confirmée par électrophorèse en gel (nombre d’intégrité ARN ≥ 7). Un microgramme d’ARN total a été traité avec la DNase I et transcrit à l’envers lors d’une réaction de 20 μL à l’aide d’hexamères aléatoires et d’amorces oligo(dT). La réaction a été réalisée à 25 °C pendant 10 minutes, 50 °C pendant 30 minutes et 85 °C pendant 5 minutes. La PCR quantitative a été réalisée dans un système de 10 μL contenant 5 μL de 2 × SYBR Green Master Mix, 0,3 μM par amorce, et 1 μL d’ADN c (≈ équivalent d’ARN de 20 ng). Les conditions de cycle thermique étaient de 95 °C pendant 5 minutes, suivies de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 30 s, puis une analyse de la courbe de fusion de 65 °C à 95 °C par incréments de 0,3 °C. Toutes les réactions étaient effectuées en triple exemplaire, avec des contrôles sans gabarit et minus-RT. Les valeurs de Ct > 35 ou SD répliquées techniques > 0,5 ont été exclues. L’expression relative a été calculée en utilisant la méthode 2⁻ΔΔCt, avec GAPDH comme contrôle interne. Des valeurs moyennes ± de la DS provenant de trois réplications biologiques indépendantes ont été rapportées, et les différences de groupe ont été analysées à l’aide d’un test t à deux queues.

Analyse du western blot
Les cellules ont été lysées sur glace dans un tampon RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS) complétés avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Les lysats ont été incubés pendant 30 minutes sur glace avec vortex intermittent et dégagés par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Les concentrations de protéines ont été mesurées par test de BCA, ajustées à 1-2 μg/μL, et mélangées 1:3 avec un tampon de Laemmli à 4× (tampon final de 1× contenant 100 mM de DTT). Les échantillons ont été dénaturés à 95 °C pendant 5 minutes. Des quantités égales de protéines (50 μg) ont été éliminées par 12 % de SDS-PAGE à 100 V pendant 90 minutes et électrotransférées dans les membranes PVDF à 250 mA pendant 90 minutes. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé dans TBST (0,1 % Tween-20) pendant 1 h à température ambiante (ou 5 % de BSA pour les phosphoprotéines) et incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 et β-actine (dilution typique 1:1000, β-actine 1:5000). Après trois lavages de 10 minutes en TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à HRP (1:5000) pendant 1 h à température ambiante, lavées à nouveau, puis développées à l’aide d’un substrat chimiluminescent. Les intensités des bandes ont été quantifiées avec ImageJ, normalisées en β-actine ou protéine totale, et exprimées en moyenne ± SD à partir de trois expériences indépendantes.

Immunocytochimie
Les cellules cultivées sur des bâtons de verre stériles ont été rincées deux fois avec du PBS et fixées dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Après trois lavages de PBS, les cellules ont été perméabilisées avec 0,2 % de Triton X-100 pendant 10 minutes, bloquées avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % pendant 1 heure, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec l’anticorps anti-CD31 primaire (dilution 1:200 dans 1 % de BSA). Après trois lavages PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor (dilution 1:500) pendant 1 heure dans l’obscurité, contre-colorées avec du DAPI (1 μg/mL, 5 min), puis montées dans un milieu antifade. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence sous les mêmes réglages d’exposition et de gain. Le pourcentage de zone positive au CD31 a été quantifié dans cinq champs non superposés sélectionnés au hasard par échantillon à l’aide du logiciel ImageJ. Ce test a été réalisé sur des modèles cellulaires plutôt que sur des sections tissulaires.

Analyse statistique
Des analyses statistiques ont été réalisées en utilisant la version R 4.3.0 ainsi que ses packages associés. Pour comparer les variables catégorielles, le test du chi carré a été utilisé, tandis que les variables continues ont été évaluées soit par le test de Wilcoxon à la somme des rangs, soit par le test T. L’évaluation des variables continues a été réalisée grâce au coefficient de corrélation de Pearson. Les analyses de survie ont été réalisées à l’aide du package de survie, qui incluait la modélisation des aléas proportionnelles de Cox et la génération de courbes de Kaplan-Meier, avec des seuils de stratification optimaux établis par le package survminer et la formule Riskscore = Équation 1. Le package CompareC a été utilisé pour évaluer les indices C de diverses variables. La courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC), destinée à prédire les variables catégorielles binaires, a été générée à l’aide du package pROC. De plus, la zone dépendante du temps sous la courbe ROC (AUC) pour les métriques de survie a été analysée à l’aide du package timeROC. Tous les tests statistiques ont été réalisés selon une approche bilatérale. Un niveau de signification de P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

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Résultats

L’IRAIN est sous-régulé dans le gliome et associé à des caractéristiques clinicopathologiques défavorables
Le processus d’analyse est illustré à la Figure 1. L’expression de l’IRAIN a d’abord été évaluée par qRT-PCR dans les astrocytes primaires, les tissus gliomes et les lignées cellulaires de gliomes. Les niveaux d’IRAIN ont été nettement réduits dans les tissus gliomes de faible et haut grade ainsi que dans les quatre lignées cellulaires de gliomes (SHG44, A172, U251 e...

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Discussion

Le gliome reste l’une des malignités les plus mortelles du système nerveux central, caractérisée par une hétérogénéité intratumorale profonde et une résistance aux traitements conventionnels. Malgré la résection chirurgicale combinée à la chimioradiothérapie, la récidive et la mortalité restent élevées, et la survie médiane des patients, en particulier ceux atteints de glioblastome, a montré une amélioration limitée ces dernièresdécennies 4,24

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions tous les participants et chercheurs impliqués dans le projet Génotype-Expression Tissulaire (GTEx) ainsi que dans les bases de données TCGA, CGGA, pour le partage des données disponibles. Ce travail a été soutenu par le projet de technologie de santé provinciale du Fujian (2024GG01010154) et le projet de montée de postes de travail doctoraux de l’hôpital de Zhangzhou (PDA202306). Le financeur a financé nos recherches.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’apoptose Annexin V-PI  ; Southern Biotechnology, Birmingham, AL, États-UnisNAUtilisé pour évaluer l’apoptose
Kit d’apoptose AnnexinV-PIBiotechnologie du Sud10010-02Utilisé pour l’évaluation de l’apoptose par cytométrie en flux.
Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-&bêta-actineAbcamab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227Anticorps utilisés pour l’analyse Western Blot des voies de signalisation.
BiocManagerCRAN1.30.25Installer et gérer les packages Bioconductor en R & ge ; 3.6.
Système Bio-Rad CFX96Bioconducteur1.5.1Accès programmatique à la protéine STRING & ndash ; interactions avec les protéines.
CaretCRAN0.4ROC/AUC dépendant du temps pour les modèles de survie.
Atlas du génome du gliome chinois (CGGA)NACGGA693 et CGGA325  ;Utilisé pour la congestion et la validation du modèle
ClusterprofilerBioconducteur2.18.0Analyser les fichiers MAF ; calculer la charge mutationnelle tumorale (TMB) et le paysage mutationnel.
CorrplotCRAN3.5.0Tracé général (boxplots, diagrammes de violon, dispersion, lignes de tendance).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC pour la sélection progressive du modèle Cox.
Data.TableCRANreadr2.1.5Lecture rapide de fichiers délimités ; une maniabilité robuste de l’UTF-8.
DoseBioconducteur3.17.0Annotation génétique humaine (Entrez, Ensembl, mappages SYMBOL).
DynamictreecutCRAN1.73Analyse pondérée du réseau de co-expression génique ; pickSoftThreshold, TOM, détection de modules.
BordeurBioconducteur3.56.2Expression différentielle (voom/modèles linéaires) ; Wilcoxon/Bayes empirique ; Entrées volcaniques/cartes thermiques.
Enrichissement du complotBioconducteur3.26.2Enrichissement de l’ontologie des maladies et aides GSEA (utilisés avec clusterProfiler).
FlashclustCRAN1.63-1Découpe adaptative de branches pour la détection de modules WGCNA.
GBMCRAN1.12Composantes principales supervisées pour l’analyse de survie.
Omnibus sur l’expression génique (GEO)NAGSE43378Utilisé pour la congestion et la validation du modèle
GEOqueryBioconducteurNATéléchargez et analysez des ensembles de données GEO.
Ggplot2CRAN1.0.12Cartes thermiques prêtes à publier des signatures d’expression.
GlmnetCRAN3.3.1Forêt de survie aléatoire pour des résultats censurés et corrects.
Anticorps secondaires anti-lapin marqués à la peroxydase de raifortAbcamab6721Anticorps secondaires pour la détection dans Western Blot.
Lignées cellulaires de glioblastome humain (SHG44, U251, A172, T98G)Collection américaine de culture tissulaireNALignées cellulaires humaines de glioblastome pour la recherche sur le gliome. Les cellules ont été cultivées dans DMEM + 10 % FBS, 2 mM de L-glutamine.
IgraphCRAN10.0.1Accéder aux ensembles de gènes MSigDB (par exemple, MRG métaboliques) ; Des cadres pratiques et bien rangés.
Logiciel Image J  ; Media Cybernetics, États-Unis152Utilisation pour la visualisation
Vecteur lentiviral codant lncRNA-IRAINGeneChem, Shanghai, Chine & nbsp ;NAVecteurs lentiviraux utilisés pour la transfection de gliomes et de cellules HEB afin d’établir des clones stables.
LimmaBioconducteur3.48.0Correction de lots (ComBat) et analyse des variables de substitution.
MaftoolsBioconducteur1.52.0Harrell' s Indice de concordance (indice C) et utilitaires de comparaison de survie.
MesseCRAN4.1-8Modèles Cox pénalisés : Lasso, Ridge et Elastic Net.
MsigdbrCRAN0.0.5Soutenir les méthodes de machine à vecteurs pour les données de survie.
MTTSigma-AldrichM2128Utilisé pour les tests de prolifération cellulaire.
Cellules gliales normales (HEB)Collection américaine de culture tissulaireNALignée cellulaire gliale humaine normale pour des études comparatives. Cultivé en DMEM + 10 % de FBS.
Org.Hs.Eg.DbBioconducteur4.8.3enrichissement GO/KEGG et GSEA ; prend en charge plusieurs types d’ID.
PheatmapCRAN2.0.0Grammaire de la science des données ; Inclut DPLYR, Tidyr, Purrr, GGPLOT2 pour la gestion et le complot.
PlsrcoxCRAN1.5Augmentation basée sur la probabilité pour les modèles Cox.
PVDF MembranesMilliporeIPVH00010Membranes utilisées pour le transfert de protéines après SDS-PAGE.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Rééchantillonnage unifié (y compris LOOCV), grilles d’ajustement et pipelines de modèles.
ReadrCRANNARécupérer des matrices/phénotypes à partir de UCSC Xena (par exemple, les hubs TCGA/GTEx).
SDS-Page Gel (12 %)Bio-Rad185-5096Système utilisé pour la PCR quantitative.
StringdbBioconducteur1.20.3Visualisation des résultats d’enrichissement (dotplot, cnetplot, ridgeplot).
SuperpcCRAN1.7.7Régression partielle des moindres carrés adaptée aux modèles de Cox.
SurvcompBioconducteur3.42.4Compte la normalisation et l’estimation de dispersion lorsque nécessaire (optionnelle, complète limma voom).
SurvieCRAN1.01-2Regroupement hiérarchique rapide utilisé par la WGCNA (optionnel).
Survie svmCRAN2.2.2Modélisation généralisée de régression boostée (gradient boosting).
SurvminerCRAN3.8-3Modèles Cox des aléas proportionnels ; Kaplan & ndash ; Courbes Meier.
TCGAbiolinksBioconducteurT9039Accès programmatique aux données TCGA ; Téléchargez/préparez les données d’expression et cliniques.
Le Programme de l’Atlas du Génome du Cancer (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga ; 175 GBM et 534 LGGUtilisé pour la congestion et la validation du modèle
TidyverseCRAN1.17.6Manipulation de données haute performance pour de grandes matrices/tableaux.
TimerocCRAN0.5.0Visualisation KM et rendu de tables de risques.
TrizolInvitrogen15596026Réactif pour l’extraction d’ARN des cellules.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Utilisé pour la congestion et la validation du modèle
UcscxenatoolsBio-Rad4561044Utilisé pour la séparation des protéines dans l’analyse Western Blot.
WGCNACRAN0.95Des matrices de corrélation pour les gènes de points de contrôle et les relations de caractéristiques.

Références

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