Article de méthode

Améliorer les écrans CRISPR-Cas9 dans les cellules CAR T : une méthode affinée pour la préparation des bibliothèques

DOI :

10.3791/69721

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2 janvier 2026

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1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 pour les cellules CAR T primaires. En réduisant la transmission d’ADNgDNA par la digestion enzymatique et le pulldown des cassettes d’ARNsg, cette approche minimise les artefacts PCR, assurant une détection précise des sgRNA et une identification robuste des cibles géniques fonctionnelles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les thérapies par récepteur antigénique chimérique (CAR) par lymphocytes T ont démontré une efficacité remarquable dans plusieurs cancers hématologiques, mais leur succès n’a pas été entièrement reproduit dans les tumeurs solides. De plus, même dans les cancers hématologiques, la rechute après une perfusion de cellules CAR T continue de compromettre les résultats à long terme. Ces défis soulignent la nécessité urgente de développer des stratégies qui améliorent l’efficacité, la persistance des cellules CAR T, ainsi que la surmontation de la résistance médiée par les tumeurs et les micro-environnements. Les plateformes de dépistage à répétitions palindromiques courtes régulièrement interespacées (CRISPR) et Cas9 (CRISPR) offrent une approche puissante pour identifier systématiquement les gènes régulant la fonction des cellules CAR T. En reliant les perturbations génétiques aux résultats phénotypiques, ces tests permettent de découvrir des voies contrôlant l’activation, la prolifération, la formation de la mémoire et la cytotoxicité. Les flux de travail standards impliquent la transduction d’un nombre important de cellules avec une seule bibliothèque d’ARN-guide (sgRNA), l’édition médiée par Cas9, la sélection des cellules éditées, et l’amplification par PCR de cassettes sgRNA à partir de l’ADN génomique (gDNA) avant le séquençage. Cependant, l’amplification par PCR utilisant de grandes quantités d’ADNg pose des défis importants et échoue souvent à amplifier et récupérer sélectivement les sgARN. Ici, nous décrivons un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 knockout, que nous avons testé sur les cellules CAR T humaines primaires. La méthode ici intègre une étape intermédiaire lors de la préparation de la bibliothèque d’ARNsg, qui réduit le transfert d’ADNg par la digestion enzymatique et la sélective extraction de la cassette sgARN, augmentant ainsi l’efficacité de la première amplification PCR. Cette modification nous a permis de récupérer des informations sur les sgRNA à travers nos écrans de cellules CAR T, qui étaient restés insaisissables lors de nos précédentes tentatives utilisant les protocoles traditionnels d’amplification PCR en 1 et 2 étapes. En conclusion, ce flux de travail optimisé facilite la préparation de la bibliothèque de dépistage CRISPR dans des échantillons difficiles et permet d’identifier les principaux déterminants génétiques susceptibles d’être ciblés pour améliorer l’efficacité thérapeutique.

Introduction

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L’immunothérapie a révolutionné le traitement du cancer, offrant de nouvelles stratégies pour maîtriser et moduler le système immunitaire. Parmi celles-ci, la thérapie par les cellules T au récepteur chimérique de l’antigène (CAR) s’est imposée comme l’une des approches les plus transformatrices. Cette thérapie consiste en l’ingénierie génétique des lymphocytes T d’un patient ex vivo avec un récepteur synthétique conçu pour reconnaître un antigène tumoral spécifique, augmentant ainsi l’activitéantitumorale 1. Les cellules CAR T ont montré un succès remarquable dans les cancers hématologiques, avec des résultats allant de rémissions de courte durée à une survie prolongée sans maladie avec une toxicité minimale chez les patients recevant des thérapies CD19 ou ciblant leBCMA 2. À ce jour, la FDA a approuvé sept produits à cellules CAR T pour les cancershématologiques 3. Malgré ces avancées, des limites importantes subsistent. Les défis découlent du produit CAR T lui-même, souvent influencés par le processus de fabrication ou la condition physique des lymphocytes T du patient, qui peuvent être altérés par la progression de la maladie, les thérapies antérieures ou l’âge. Les mécanismes de résistance intrinsèques à la tumeur, tels que la régulation à la baisse des antigènes, peuvent également compromettre l’efficacité4. De plus, le microenvironnement tumoral immunosuppresseur constitue une barrière supplémentaire qui limite sévèrement la persistance et la fonction des cellules CAR T, en particulier chez les patients atteints de tumeursolide 5. Par conséquent, il est urgent d’améliorer à la fois l’efficacité initiale et à long terme des thérapies à cellules CAR T.

L’avènement de l’édition génique CRISPR-Cas9 a fourni des outils puissants pour disséquer la fonction génique grâce à des approches de dépistage à grande échelle. Dans ces tests, les cellules sont transduites avec une bibliothèque d’ARN à guide unique (ARNsg), généralement délivrée par des vecteurs lentiviraux, assurant un ARNsg par cellule et une intégration génomique stable. Après l’édition et la sélection des cellules transduites médiées par Cas9, l’ADN génomique (gDNA) est extrait, et les cassettes d’ARNsgs sont amplifiées par PCR pour la préparation de la bibliothèque. Le séquençage à haut débit permet alors de quantifier les distributions des sgRNA à travers différents phénotypes, identifiant ainsi des gènes qui régulent positivement ou négativement le processus de l’étude6.

Le dépistage CRISPR a été largement appliqué pour explorer la biologie des cellules T et, plus récemment, pour améliorer la performance des cellules CAR T. Les criblages génomes ont identifié des régulateurs des processus fondamentaux des lymphocytes T, notamment l’activation, la prolifération et la différenciation. Par exemple, FAM49B a été identifié comme régulateur de la signalisation du récepteur des lymphocytesT 7, tandis que SOCS1, TCEB2, RASA2 et CBLB se sont révélés essentiels à la prolifération après la stimulation8. Au-delà de ces voies principales, le dépistage CRISPR a également permis d’élucider les gènes impliqués dans la mémoire et l’épuisement des lymphocytes T. Des études in vivo ont identifié Fli1 comme un candidat pour améliorer les réponses effecteurs sans perturber la mémoire ou les précurseursd’épuisement 9, et le remodeleur de chromatine Arid1a comme régulateur dont la perte réduit l’épuisement des lymphocytesT 10. Les régulateurs de la différenciation de type T helper 2 (Th2) ont également été caractérisés par cette approche11. En utilisant une bibliothèque de sgRNA personnalisée ciblant 25 kinases, p38 a montré qu’elle favorisait l’expansion, la formation de la mémoire et la protection contre le stress oxydatif etgénomique 12. De même, le knockout par REGNASE-1 dans les lymphocytes T CD8+ a conféré un phénotype effecteur à longue durée de vie qui a amélioré le contrôle tumoral dans les modèles13 de mélanome et leucémie. Des criblages génomiques supplémentaires ont identifié Dhx37 comme régulateur de l’activation des lymphocytes T etde la cytotoxicité 14, tandis que LTBR et d’autres gènes ont été validés comme des améliorateurs de la fonction des cellules T dans les cellules CAR T et γδT 15. Plus récemment, le dépistage CRISPR a été appliqué directement dans les cellules CAR T, révélant de nouvelles cibles telles que PRODH2, une enzyme impliquée dans le métabolisme de la proline qui augmente l’activité antitumoraleCAR T 16, ainsi que TLE4 et IKZF2, dont l’inactivation a amélioré l’efficacité de CAR T dans les modèles deglioblastome 17.

Une étape cruciale des écrans CRISPR est précisément l’amplification sélective des cassettes sgRNA à partir de quantités extrêmement importantes de gDNA, un défi difficile à contourner compte tenu du grand nombre de cellules utilisées dans les criblages CRISPR. L’amplification par PCR à partir de quantités aussi importantes de transfert d’ADN pose plusieurs défis techniques, notamment le surpeuplement moléculaire qui limite la diffusion physique des molécules d’ADN et de polymérase, la liaison non spécifique et transitoire des amorces et de la polymérase au fond de l’ADN, l’amplification hors cible entraînant un épuisement des amorces, ou la séquestration de Mg2+ par la colonne vertébrale de phosphate d’ADN, parmi d’autresdéfis 18, 19, 20, 21. Ces résultats entraînent souvent une défaillance de la PCR et/ou un biais. Pour atténuer ces problèmes, différentes stratégies ont été proposées, notamment la séparation de l’amplification de sgRNA de l’ajout d’adaptateurs en deux étapesPCR 22, l’utilisation d’un enrichissement cible avec des oligos biotinylés et la capture magnétiquepar billes 23,24, ou la conception de plasmides avec des sites de restriction flanquant la cassette sgRNA pour l’enrichissementde fragments 25.

Dans cette étude, nous présentons un protocole optimisé de dépistage CRISPR-Cas9 pour les cellules CAR T humaines primaires. La bibliothèque CRISPR utilisée est Brunello Kinome 1, une bibliothèque qui contient 3052 ARNgRNA uniques de 20nt de long ciblant 763 gènes kinases humains (4 ARNs par cible). Les lymphocytes T ont été isolés par sélection magnétique positive CD4+ et CD8+ à partir de la fraction enrichie en cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant de donneurs sains. Lors de l’activation avec l’anti-CD3 et l’anti-CD28, les lymphocytes T ont été infectés avec la bibliothèque de dépistage CRISPR, puis transduits avec le lentivirus CAR. Les cellules ont été dilatées, puis nucléofectées pour introduire la protéine Cas9. Les cellules contenant CRISPR ont été sélectionnées avec de la puromycine, et les cellules T CAR-positives ont été triées. Après extraction, l’ADN génomique a été digéré avec des enzymes de restriction (RE), et les fragments contenant l’ARNsg ont été aspirés par capture de sonde biotine et de streptavidine. Ensuite, les sgRNA ont été amplifiés et indexés sélectivement via deux PCR consécutives, et les bibliothèques résultantes ont été séquencées. En intégrant une étape intermédiaire pour réduire la transmission d’ADNg, nous avons pu récupérer et amplifier sélectivement notre ARNsg d’intérêt, ce qui nous permet d’étudier le rôle des kinases dans les cellules CAR T.

Protocole

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Ce protocole a été appliqué conformément aux directives de l’Université de Navarre. Tous les sujets ont donné un consentement éclairé écrit. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement et activation des cellules T

  1. Isolation PBMC
    1. Prélever des échantillons de sang auprès de donneurs sur des tubes d’acide éthylénédiaminétraacétique (EDTA), transférer les échantillons dans des tubes coniques de 50 mL, et diluer le sang avec PBS (dilution 1:1).
    2. Ajoutez 15 mL de milieu à gradient de densité au fond d’un tube conique de 50 mL (densité pour les PBMC : 1,07). Ensuite, ajoutez soigneusement 25 mL de sang dilué sur la couche moyenne à gradient de densité (vitesse la plus lente du contrôleur de pipette). Centrifugeuse pendant 30 minutes à 800 × g sans frein.
    3. Collectez l’anneau/couche des PBMC avec une pipette Pasteur dans un tube conique de 50 mL et ajoutez le PBS à un volume total de 50 mL pour le lavage. Centrifugez à 650 × g pendant 8 minutes. Jetez le surnageant.
      REMARQUE : Vérifiez la turbidité du surnageant pour être sûr qu’il n’y a pas de cellules à cet endroit. En cas de doute, divisez la suspension en deux fois le nombre initial de tubes coniques de 50 mL, ajoutez du PBS jusqu’à 50 mL, puis centrifugez à nouveau.
    4. Resuspendez 50 mL de PBS. Comptez avec de l’acridine orange-propidium iodure (AOPI) dans un compteur cellulaire. Centrifugeuse à 650 × g pendant 8 minutes.
  2. Sélection magnétique CD4 et CD8
    1. Préparez le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5 % et filtrez à 0,2 μm.
    2. Resuspendez les PBMC dans 80 μL de tampon FACS stérile par 10 × 106 cellules et ajoutez 10 μL de microbilles CD4 et 10 μL de microperles CD8 par 10 ×10 6 cellules. Incubez 20 minutes à 4 °C.
    3. Ajoutez 10 mL de tampon FACS et centrifugez pendant 8 minutes à 650 × g. Abandonnez complètement le surnageant.
    4. Resuspendez dans 500 μL par 1 ×10 8 cellules de tampon FACS dans un tube conique de 15 mL.
      REMARQUE : Une série peut accueillir 200 x 106 cellules.
    5. Utilisez le programme Possel pour l’isolation des AutoMacs (trieur de cellules magnétiques à grande vitesse).
    6. Ajoutez jusqu’à 10 mL de PBS, comptez avec de l’AOPI dans un compteur à cellules fluorescentes, et centrifugez à 650 × g pendant 8 minutes.
    7. Resuspendre les cellules 1 x 106/mL dans un milieu de croissance des lymphocytes T contenant 3 % de sérum humain (HS), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S), 625 UI/mL d’interleukine-7, 85 UI/mL d’IL-15. Ajoutez 10 μL de réactif de stimulation des lymphocytes T par 1 mL et mélangez bien. Placez 2 mL par puits dans une plaque à 24 puits (p24w) et incubez pendant 24 heures à 37 °C.

2. Production de cellules CAR T et dépistage CRISPR

  1. Spinfection de la bibliothèque et transduction CAR
    1. Ajoutez la quantité correspondante de bibliothèque CRISPR de lentivirus (par exemple, bibliothèque Brunello Kinome 1). Voir le tableau supplémentaire 1), déterminé dans un test de titration, et 8 μg/mL polybrene.
    2. Spinfectez par centrifugation à 700 x g pendant 1 h 30 min à 32 °C.
    3. Remplacer le milieu par un milieu de croissance des lymphocytes T frais contenant 3 % d’HS, 1 % de P/S, 625 UI/mL d’IL-7, 85 UI/mL d’IL-15 (cellule finale = 106 cellules/mL).
    4. Après 6 heures, ajoutez la quantité correspondante de vecteur lentiviral CAR à une multiplicité d’infections (MOI) de 3 et incubez pendant 4 jours.
  2. Électroporation Cas 9
    1. Collectez les cellules CAR T, lavez-les une fois avec du PBS, et comptez les cellules avec AOPI dans un compteur de cellules fluorescentes.
    2. Préparez du Cas9 de 4 μM dans un tampon d’électroporation.
    3. Resuspendre les cellules CAR T à 50 μL par 5 × 106 cellules. Mélangez et ajoutez soigneusement 50 μL de suspension à cellules dans chaque puits d’une bande de cuvette multipuits sans former de bulles. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette, enlevez toute bulle possible et faites passer la pointe le long des bords du puits.
      REMARQUE : Si un puits dans une cuvette reste sans échantillon, ajoutez le même volume de tampon d’électroporation. C’est une étape critique : si la machine détecte une bulle ou une différence de volume, elle affichera une erreur.
    4. Utilisez le programme EXPAND T CELL 3 to nucleofect CAR T cells.
    5. Laissez les cellules dans les cuvettes dans un incubateur à 37 °C pendant 40 minutes.
    6. Resuspendez les cellules nucléofectées dans un milieu de croissance des lymphocytes T contenant 3 % d’HS, 1 % de P/S, 625 UI/mL d’IL-7, 85 UI/mL d’IL-15 (cellule finale = 106 cellules/mL) et incubez à 37 °C pendant 3 jours.
  3. Sélection de puromycine
    1. Comptez avec l’AOPI dans un compteur de cellules fluorescentes.
    2. Ajustez à 1 x 106 cellules/mL avec un milieu de croissance des lymphocytes T contenant IL7 et IL15.
    3. Ajoutez de la puromycine (2,5 μg/mL) au substrat.
    4. Comptez les cellules tous les 2 jours pendant 6 jours et ajustez à 1 x 10cellules de 6 mL avec un milieu de croissance cellulaire contenant 3 % d’HS, 1 % de P/S, 625 UI/mL d’IL-7, 85 UI/mL d’IL-15 et 2,5 μg/mL de puromycine.
    5. Vérifiez le pourcentage de voiture.
  4. Triez les populations de cellules CAR T et stockez des échantillons (granulés à cellules sèches) à -80 °C.

3. Isolement de l’ADNg

REMARQUE : Évitez toute perte cellulaire ou d’ADNg tout au long du processus, car cela pourrait compromettre la représentativité des sgRNA. Visez une couverture d’ARNsg d’au moins 500x.

  1. Extraire l’ADNg à partir d’échantillons à l’aide du kit d’extraction d’ADN cellulaire et tissulaire. Éluez deux fois pour maximiser la récupération d’ADNg.
    REMARQUE : N’utilisez pas plus de 4 x 106 cellules/colonne afin de récupérer plus efficacement l’ADNG.
  2. Mesurez la concentration d’ADNg avec le kit de quantification dsDNA.
    REMARQUE : Si la concentration est trop faible pour les étapes suivantes du protocole, utilisez un réactif de nettoyage à base de billes d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) pour concentrer l’ADN.

4. Enrichissement de la cassette sgRNA (et élimination du transfert d’ADNg)

  1. Digestion par enzyme de restriction
    1. Digérer un maximum de 5 μg d’ADNg avec 20 U de l’enzyme/s (par exemple, pour lentiGuide-puro backbone pour la bibliothèque Brunello Kinome 1, utiliser la combinaison NdeI et PspXI) dans un volume total de 50 μL. Augmenter le nombre de réactions pour atteindre la représentativité souhaitée des sgRNA.
      REMARQUE : Sélectionnez les enzymes de restriction à couper dans les régions latérales de la cassette, mais gardez à l’esprit que certains sgRNA peuvent contenir un site de restriction. Ces sgRNA seront perdus à cette étape et ne seront pas visibles dans le séquençage. L’absence de ce guide sert de contrôle de la digestion. Le tableau supplémentaire 1 présente une liste des ARNsg du Kinome 1 clivés par PspXI et NdeI.
    2. Incubez toute la nuit à 37 °C dans un thermocycleur.
    3. Effectuez un nettoyage SPRI de 2 fois.
      1. Préparez 10 mL d’élution tampon (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) et 50 mL d’éthanol frais à 70 %.
      2. Manipulez les billes et ajoutez 100 μL au produit de la digestion.
      3. Mélangez soigneusement en pipettant et incubez pendant 5 minutes. Magnétisez encore 5 minutes.
      4. Pendant que vous êtes sur l’aimant, ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % sans déranger la boule. Attends 30 secondes, puis défausse le surnageant.
      5. Répétez l’étape 4.1.3.3 pour un total de 2 lavages. Laissez sécher les billes pendant 2 minutes.
      6. Retirez de l’aimant, ajoutez 40 μL de tampon d’élution, puis resuspendez les billes en pipotant. Incubez pendant 2 minutes.
      7. Magnétiser pendant 2 minutes puis transférer le surnageant dans un nouveau tube.
        REMARQUE : Lors de la mise en place de ce protocole pour la première fois, vérifiez la digestion par électrophorèse (capillaire). Assurez-vous qu’une bavure soit observée.
  2. Tirage vers le bas de la cassette sgRNA.
    1. Préparation des billes magnétiques de streptavidina.
      1. Tampon de lavage/liaison préparé 2x : 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Diluez la moitié du volume avecH 2Oà 1x.
      2. Faites passer les billes en vortex pendant 1 minute.
      3. Transférez le volume désiré de billes dans un tube (généralement 1 mg suffit), ajoutez un volume égal de tampon de lavage/liaison 1 fois, ou au moins 1 mL, puis resuspendez.
      4. Placez le tube sur un aimant pendant 1 minute et jetez le surnageant.
      5. Retirez le tube de l’aimant et resuspendez les billes lavées au même volume de 1x tampon de lavage/liaison que le volume initial de billes prélevées dans le flacon.
      6. Répétez pour un total de 3 lavages.
      7. Resuspendez les billes dans 2x tampon de lavage/fixation.
    2. Ajoutez 5 μL d’amorces à tirage de 10 μM listées dans le tableau 1 à la digestion purifiée de l’étape 4.1.3.6.
    3. Incubez dans un bain sec à 96 °C pendant 5 minutes, puis portez immédiatement à la glace pendant 5 minutes.
    4. Ajoutez 1 mg de billes magnétiques de streptavidine pré-lavées.
      REMARQUE : La liaison biotine-streptavidine fonctionne mieux à 1 M de NaCl. Assurez-vous de mélanger des volumes égaux de billes et d’ADN biotinylé.
    5. Incubez pendant 20 minutes tout en resuspendant le mélange toutes les 4 minutes.
    6. Magnétiser pendant 5 minutes.
    7. Lavez les billes 3 fois avec 1× tampon de lavage/reliaison.
    8. Resuspendez les billes à 50 μL d’EB 8,0.
      REMARQUE : Les cassettes d’ARNsg utilisées ici sont liées aux billes de streptavidine. Ne les jetez pas.

5. Préparation de la bibliothèque sgRNA

  1. PCR1
    1. Préparez un mélange PCR1 avec 20 μL de tampon Herculase 5x, 1 μL de dNTP (100 mM), 1 μL de polymérase ADN, 2,5 μL de 10 μM d’amorces PCR1 directes et inverses listées dans le tableau 1, et 23 μL d’eau de qualité PCR. Mélangez par pipette et ajoutez du mélange PCR1 aux billes de l’étape 4.2.8.
      REMARQUE : Le tableau 1 liste les amorces PCR1 conçues pour la bibliothèque Brunello Kinome 1.
    2. Placez les tubes dans un thermocycleur et exécutez le programme de PCR1 décrit dans le tableau 2.
      REMARQUE : Assurez-vous que le thermocycleur peut accueillir des réactions de 100 μL. Sinon, aliquote dans des réactions de 50 μL. Ajustez selon les besoins.
    3. Regroupez toutes les PCR1 des mêmes échantillons dans un seul tube.
    4. Nettoyage SPRI PCR1 en utilisant 150 μL (1,5x) de billes (suivez les étapes 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspendez chaque réaction PCR à 100 μL d’EB 8,0.
      REMARQUE : Si vous configurez ce protocole pour la première fois, vérifiez la taille et la qualité du produit PCR en faisant tourner 2 μL d’un produit PCR de 30 cycles dans un système d’électrophorèse capillaire (par exemple, les systèmes TapeStation d’Agilent).
  2. PCR2
    1. Préparez un mélange PCR2 avec 10 μL du produit de PCR1, 10 μL de tampon 5X, 0,5 μL de dNTP (100 mM), 1 μL d’ADN polymérase, 1,25 μL d’amorces PCR2 10 μM listées avant et arrière dans le Tableau 1 (utilisez une combinaison différente rP7-i7-BC et P5-i5-BC pour chaque échantillon), et 26 μL d’eau de qualité PCR pour un volume total de 50 μL.
      REMARQUE : Pour maintenir la représentation de la bibliothèque, effectuez une réaction PCR2 pour 10ou 4 constructions dans la bibliothèque.
    2. Placez les tubes dans un thermocycleur et exécutez le programme de PCR2 décrit dans le tableau 2.
    3. Nettoyage SPRI PCR2 en utilisant 75 μL (1,5x) de billes (suivez les étapes 4.1.3.3-4.1.3.7). Resuspendez chaque réaction PCR à 50 μL d’EB 8,0.
  3. Quantifiez la PCR2 ( c’est-à-dire la bibliothèque d’ARNsg) à l’aide du kit de quantification dsDNA et vérifiez la taille de l’amplicon par électrophorèse capillaire (par exemple, TapeStation Systems). Regroupez les échantillons.
  4. Séquence sur un instrument Illumina.
    REMARQUE : Pour la bibliothèque Brunello Kinome 1 à 3052 sgRNA ici, une profondeur de séquençage de 100 à 200 millions de lectures par échantillon est généralement suffisante.

6. Analyse

  1. Échantillons de démultiplexage en utilisant bcl2fastq.
  2. Vérifiez la qualité des fichiers fastq générés avec FastQC.
  3. Extraire la séquence du sgRNA en utilisant comme motif les séquences de cassette qui encadrent le sgRNA, ainsi que la longueur du guide (20 nt).
  4. Alignez la séquence extraite à la référence de la bibliothèque en utilisant Bowtie2 pour vérifier combien de guides hypothétiques sont des sgRNA authentiques provenant de la bibliothèque. Utilisez samtools pour convertir le fichier SAM contenant les informations sur l’alignement en format BAM et générer des fichiers résumés.
  5. Compter et normaliser le nombre de lectures pour chaque sgRNA dans les échantillons édités et témoins avec la fonction de comptage du logiciel MAGecK.
  6. Comparez les décomptes avec la fonction de test de MAGecK pour obtenir les scores RRA et la liste des gènes candidats.

Résultats

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Comme décrit dans la section protocole, les cellules T CAR ont été générées selon notreprotocole établi 26. Pour le dépistage CRISPR, nous avons adapté le flux de travail développé par Wang et al.17 (Figure 1A). En résumé, des lymphocytes T de deux donneurs indépendants ont été isolés et activés pendant 24 heures avant une transduction consécutive avec la bibliothèque d’ARNsgRNA CRISPR et le vecteur lentiviral CAR, atteignant 67 et 72 % de cellules CAR-positives au jour 5. Une fraction des cellules a été nucléofectée avec la protéine Cas9 pour induire des knockouts, tandis que les cellules restantes servaient de base pour la représentation de l’ARNsg. Les cellules transduites ont été sélectionnées avec des antibiotiques, et des populations distinctes ont ensuite été triées selon les phénotypes étudiés. La prolifération des cellules CAR T a été surveillée tout au long du criblage à l’aide de décomptes cellulaires basés sur l’AOPI, exprimée sous forme de changement de pli (Figure 1B). Après une supplémentation en puromycine aux jours 8, 10 et 12, nous avons confirmé un enrichissement réussi des cellules CAR T transduquées avec la bibliothèque CRISPR chez les deux donneurs, comme en témoignent la survie et la prolifération continues. Les lymphocytes T non transduits (UTD) et les cellules CAR T dépourvus de transduction par bibliothèque CRISPR ont été utilisés comme témoins de la sélection des antibiotiques.

Après l’extraction d’ADN génomique, des bibliothèques d’ARNsgs ont été préparées par amplification PCR. Pour surmonter les problèmes liés à un excès de transfert d’ADNg, nous avons mis en place un protocole incorporant la digestion des enzymes de restriction et la réduction de la biotine-streptavidine de la cassette d’ARNsg (Figure 2A,B). L’ADNg a été digéré avec les enzymes de restriction NdeI et PspXI ciblant les sites de ciblage flanquant la cassette d’ARNsg (Figure 2C). Des oligos biotinylés, conçus pour se lier en amont des sites de recuit d’amorces PCR1, ont été utilisés pour capturer des fragments de cassette d’ARNsg, puis tirés vers le bas avec des billes de streptavidine pour éliminer le transfert de gADN. Les fragments contenant sgRNA ont ensuite été amplifiés sélectivement (Figure 2D) et indexés lors de 2 PCR consécutifs.

Les bibliothèques de chaque échantillon étaient séquencées à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS). Après démultiplexage, contrôle qualité et identification des sgRNA, les données ont été analysées avec le pipeline MAGeCK. Premièrement, la commande de comptage quantifiait et normalisait les décomptes de lectures d’ARNsg dans les échantillons témoins (basaux) et édités par Cas9 (Figure 3A,B). Les corrélations de Pearson et Spearman indiquent que la représentativité de l’ARNsgM a été maintenue pendant l’expérience (ADN du donneur) comparée à la bibliothèque plasmidique (Figure 3C). Ensuite, la commande de test a comparé les deux conditions, attribuant des scores robustes d’agrégation de rangs (RRA) à chaque gène (Figure 3D). Des gènes significativement enrichis ou appauvris ont été identifiés à l’aide de seuils de p < 0,05 et de logaritisme de variation du repliement (LFC) > 0,5 (Figure 3E). Enfin, une analyse d’enrichissement des voies des gènes candidats a été réalisée à l’aide de Metascape, révélant les principaux termes de l’ontologie génique associés aux régulateurs identifiés (Figure 3F).

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Figure 1 : Dépistage CRISPR dans les cellules CAR T. (A) Schéma du criblage CRISPR dans les cellules CAR T. (B) Sélection des cellules transduites contenant de la puromycine (P). Les bibliothèques plasmidiques incluent un gène de résistance à la puromycine pour la sélection positive. L’antibiotique a été ajouté au jour 8 dans le milieu dans des échantillons non transduits de cellules T non transduits (UTD) et CAR T transduits ainsi que des cellules CAR T transduites. Des échantillons sans puromycine ont été utilisés pour contrôler la prolifération. Les données de deux donateurs indépendants sont présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Préparation de la bibliothèque pour l’analyse d’enrichissement des sgRNA. (A) Schéma du protocole pour la préparation de la bibliothèque. (B) Schéma de la localisation relative des tailles de coupe de l’enzyme de restriction (ciseaux) et des régions de recuit des amorces PCR1 (flèche) et biotinylées (flèche avec point vert). (C) Électrophorèse de l’ADNg avant et après la digestion de l’ADN. (D) Enrichissement sélectif des cassettes d’ARNsg après PCR1. Les données de deux donneurs indépendants issus d’échantillons basaux et Cas9 des deux phénotypes sont présentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Guide l’analyse d’enrichissement avec MAGeCK. (A) Résumé de la sortie de la fonction de comptage MAGeCK. (B) Répartition des nombres de lectures. (C) Coefficients de Pearson et Spearman pour la corrélation entre l’ADN g des donneurs et le nombre de bibliothèques de plasmides. (D) Gènes potentiellement enrichis/appauvris classés par une agrégation robuste modifiée (score RRA). (E) Graphique volcanique montrant des gènes significatifs (valeur p < 0,05, LFC > 0,5) en rouge. (F) Termes de l’ontologie génique supérieure (GO) après l’analyse des voies Metascape des gènes significatifs enrichis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Séquence des amorces. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Conditions PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire 1 : Liste des sgRNA dans la bibliothèque Kinome 1 et des sgRNA perdus lors de la digestion avec NdeI et PspXI Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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Le dépistage CRISPR repose sur le principe de perturbation à guide unique, ce qui signifie qu’un seul ARNsg doit être intégré par cellule. Pour y parvenir, les sgRNA sont généralement délivrés via des vecteurs lentiviraux, et la multiplicité de l’infection (MOI) doit être soigneusement contrôlée. Un MOI de ca. 0,3 est généralement recommandé, ce qui entraîne la transduction de 25 % à 30 % des cellules avec une seule particulevirale 6. Une titration précise est donc essentielle pour déterminer le volume de particules virales requises. Une autre étape cruciale est la perte de la couverture des sgRNA pendant le protocole. La perte cellulaire lors de la prélèvement, les inefficacités lors de l’extraction de l’ADNg (notamment la surcharge de colonnes et l’élution incomplète de l’ADN), ou un gabarit excessif lors de l’amplification PCR peuvent tous contribuer à cette perte, faussant ainsi notre analyse de sgRNA. Concernant les oligos biotinylés, il est préférable qu’ils soient purifiés par HPLC afin d’éviter que la biotine libre utilisée dans la synthèse ne sature les billes de streptavidine. De plus, un amino-modificateur 3' est fortement suggéré pour empêcher l’amplification par les amorces biotinylées lors des PCR ultérieurs. De plus, lors de la conception de ces oligos, évitez tout chevauchement avec les amorces PCR1 afin d’éviter la concurrence lors de l’amplification. De plus, l’analyse bioinformatique nécessite une attention particulière : les schémas d’extraction des sgRNA dépendent de la colonne vertébrale plasmidique (par exemple, lentiGuide-puro ou lentiCRISPR v2), et la rigueur d’alignement peut aller de l’appariement exact à une certaine tolérance aux inadaptations. De plus, puisque ce protocole inclut une étape de digestion, certains sgRNA contenant des sites de restriction peuvent être perdus, nécessitant un ajustement de la bibliothèque de référence.

Dans cette étude, nous proposons un protocole de préparation optimisé de la bibliothèque de dépistage CRISPR qui enrichit les fragments contenant des sgRNA par digestion et, plus important encore, par une étape de pulldown. La digestion par enzyme de restriction a déjà été suggérée comme stratégie pour réduire l’entrée d’ADN g et enrichir les cassettesd’ARNsg 27. De même, les sondes biotinylées ont été largement utilisées en biologie moléculaire pour capturer des acides nucléiques spécifiques ou des complexes protéine-acidenucléique 28,29,30,31.

Notre protocole s’appuie sur ces principes et les adapte au dépistage CRISPR dans les cellules CAR T primaires, bien que plusieurs limitations doivent être reconnues. Premièrement, les cellules CAR T primaires imposent des contraintes à l’échelle de l’écran, car leur capacité d’expansion est limitée. Pour maintenir une couverture adéquate et une représentation de l’ARNsg, un grand nombre de cellules de départ sont nécessaires. Lorsque cela n’est pas faisable, des bibliothèques personnalisées plus petites peuvent êtreutilisées 12, bien que cela réduise l’étendue de l’interrogatoire génétique. La variabilité biologique est un autre défi ; Des différences entre les donneurs sont attendues, et le chevauchement des résultats significatifs est souventmodeste de 17. Deuxièmement, la stratégie d’enrichissement repose sur la présence et la position des sites de coupe enzymatique de restriction. Dans de rares cas, ces sites peuvent apparaître dans des séquences d’ARNsg, ce qui pose plus de problèmes pour les petites bibliothèques avec une redondance limitée. Cependant, la plupart des bibliothèques, en particulier les conceptions génomiques, incluent plusieurs sgRNA par cible, minimisant ainsi l’impact global de la perte de guide. Enfin, des stratégies alternatives d’enrichissement basées sur la fragmentation, telles que la sonication couplée à la capturepar sonde 24, peuvent offrir une certaine flexibilité dans les cas où la digestion par enzyme de restriction n’est pas adaptée.

Dans l’ensemble, la cassette sgRNA représente une infime fraction de l’ADN génomique total dans les cellules éditées par CRISPR, rendant un enrichissement efficace essentiel pour une préparation réussie des bibliothèques. Comparé aux protocoles standards, notre flux de travail optimisé réduit le transfert d’ADNgDNA et favorise l’amplification PCR du sgRNA d’intérêt. Bien que la combinaison de fragmentation de l’ADN g et de tirage de la sonde biotinylée avec des billes de streptavidine ne soit pas conceptuellement nouvelle, son intégration au dépistage CRISPR évite les pièges courants de la PCR et augmente la reproductibilité des écrans CRISPR. De plus, l’intégration de métriques QC standardisées à chaque étape clé (telles que la pureté des cellules T post-tri, la proportion de cellules résistantes à la puromycine, l’intégrité de l’ADNg, et l’efficacité de la transduction CAR) renforcerait encore la robustesse et la reproductibilité du flux de travail. En conclusion, bien que développé dans le contexte des cellules CAR T primaires et avec seulement deux donneurs (ce qui peut représenter une limitation, bien que plusieurs échantillons de chaque donneur aient été utilisés), ce protocole optimisé pourrait être largement applicable à d’autres criblages CRISPR et workflows NGS avec de grands portyovers d’ADNg.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le projet PID2022-137914OB-I00 financé par MICIU/AEI /10.13039/501100011033 et par FEDER, UE. Cette étude a été soutenue par l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) via Red de Terapias, Avanzadas, TERAV et TERAV+ (RD21/0017/0009 et RD24/0014/0010) ainsi que par le Centro de Investigación Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489). Cette étude a été soutenue par le Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 et GN2024/04) et Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 et 0011-1411-2023-000074). La figure 1B et la figure 2A ont été créées avec BioRender.com

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4200 Tape StationAgilentG2991A
Acridine OrangeInvitrogenA1301
AMPure XP  ;Beckman CoulterA63881
Séparateur NEO autoMACSMiltenyi130-120-327Trieur à cellules magnétiques à grande vitesse
Oligos biotinylésIDT
BSASigmaA9647
Compteur de cellules fluorescentes K2 pour violoncelleRevvityCMT-K2-MX-150Compteur à cellules fluorescentes
Chambres de comptage CHT4RevvityCHT4-SD100-002
Nanobilles CD4 de CytoSinctGenScriptL00863-1
Nanobilles CD8 de CytoSinctGenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidineInvitrogen11206D
Aimant DynaMag-2Invitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
ÉthanolMerck1,00,98,31,000
Électroporateur ExPERT AtxMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & micro ; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Tampon Herculase 5XAgilent600675-52Tampon 5X
Herculase II Fusion EnzymeAgilent600679-51ADN polymérase
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
Tampon d’électroporation MaxCyteCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Tissu nucléospinMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
AmorcesThermoFisher
Propidium iodeSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromycineGibcoA11138-03
Fluoromètre Qubit 3.0InvitrogenQ33216
Analyse ADN qubit HSInvitrogenQ32851
Assemblage de traitement stérile de puits R-50x3MaxCyteLM243882
T Cell TransAct humainMiltenyi130-111-160Réactif de stimulation des lymphocytes T
Station de bande HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196Milieu de croissance des lymphocytes T
Tampon Tris, 1,0 m, pH 8,0, Grade de biologie moléculaireEMD Milipore648314
L’eau, pour la biologie moléculaire, sans ADNase, ARNSE et ProtéaseThermoScientific327390010

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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