Nous présentons un protocole pour intégrer la randomisation mendélienne multiomique, la transcriptomique unicellulaire et le dépistage in silico basé sur la structure afin de délimiter systématiquement l’axe macrophage du type drebrine (DBNL) en cas d’insuffisance cardiaque. Nous suggérons DBNL comme cible immunométabolique médicamenteuse.
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Article de recherche
Mécanismes moléculaires de la DBNL dans l’insuffisance cardiaque : de l’immunométabolisme des macrophages aux implications thérapeutiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’insuffisance cardiaque (IC) reste un défi majeur pour la santé mondiale, avec des traitements efficaces limités ciblant ses mécanismes pathophysiologiques fondamentaux. Dans cette étude, une approche multiomique intégrée combinant randomisation mendélienne (RM) et séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) a été utilisée pour identifier des biomarqueurs potentiels et des cibles thérapeutiques pour l’IC. Nous avons utilisé des données issues d’études d’association génomique (GWAS), de loci de caractères quantitatifs d’expression (eQTLs), de loci de traits quantitatifs de méthylation (mQTLs) et de loci de traits quantitatifs protéiques (pQTLs) pour étudier les mécanismes génétiques de la morphologie de l’IC. Le séquençage de l’ARN unicellulaire a été réalisé pour analyser l’expression génique dans les macrophages cardiaques, et l’analyse pseudo-temps a été utilisée pour étudier la régulation dynamique de DBNL lors de la différenciation des macrophages. Des simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique ont identifié l’acide pirinixique (WY-14643 ; PubChem CID : 4594 ; Synonymes : 50892-23-4 ; WY-14643) en tant que régulateur potentiel de DBNL. L’analyse multiomique a révélé que DBNL (type Drebrin) est un gène clé associé au risque d’IC. Le séquençage à ARN unicellulaire a révélé que la DBNL s’exprime principalement dans les macrophages cardiaques et est surrégulée dans des conditions pathologiques. L’expression de DBNL par les macrophages est associée au métabolisme immunitaire et aux voies profibrotiques, en particulier les voies de signalisation IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR et TGF-β. L’analyse du pseudotemps a indiqué que la DBNL a un effet régulateur dynamique sur la différenciation des macrophages, en particulier dans l’inflammation chronique. Le docking moléculaire et les simulations dynamiques ont montré que l’acide pyrididique pourrait jouer un rôle dans la régulation du DBNL. Cette étude éclaire le rôle du DBNL dans la progression de l’insuffisance cardiaque et suggère son potentiel comme cible thérapeutique. Il est important de noter que la pertinence thérapeutique provient des prédictions computationnelles. Ces résultats offrent de nouvelles perspectives sur le métabolisme immunitaire et la communication intercellulaire médiée par les macrophages, établissant une base théorique pour de futures applications dans l’optimisation de médicaments ciblant DBNL et la recherche fonctionnelle. Néanmoins, des validations expérimentales supplémentaires et des études précliniques sont nécessaires pour étayer l’efficacité clinique de DBNL en tant que cible thérapeutique.
Introduction
L’insuffisance cardiaque (IC) représente un défi sanitaire mondial important et croissant qui touche des millions de personnes dans le monde et impose une pression économique considérable aux systèmesde santé 1. Par conséquent, il est urgent de faire appel à des interventions efficaces dans la prise en charge de l’insuffisance cardiaque (IC).
La physiopathologie complexe de l’insuffisance cardiaque provient d’une contractilité myocardique altérée du ventricule gauche, entraînant une cascade de complications systémiques, telles que la congestion pulmonaireet périphérique 2. Cependant, s’attaquer directement aux mécanismes pathophysiologiques fondamentaux qui sous-tendent la progression de l’insuffisance cardiaque, en particulier le remodelage indésirable du myocarde, reste un défi critique et non résolu3. Ces dernières décennies, le domaine de la recherche biomédicale a connu un changement de paradigme important, principalement facilité par l’intégration de technologies multiomiques et de méthodologies avancées en bioinformatique. Ces outils offrent des opportunités exceptionnelles pour identifier de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques de maladies. La randomisation mendélienne (RM), une approche épidémiologique génétique rigoureuse, utilise des polymorphismes mononucléotides (SNP) comme variables instrumentales pour déduire les relations causales entre les expositions génétiques et les résultatscliniques 4. En adoptant le cadre méthodologique des essais contrôlés randomisés, la randomisation mendélienne (RM) répond efficacement aux problèmes de confusion et de causalité inverse afin de fournir des preuves solides pour l’identification et la réutilisation des cibles médicamenteuses. Parallèlement, le séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) révèle une hétérogénéité tissulaire avec une résolution inégalée, offrant des perspectives profondes sur l’expression génique spécifique à chaque type cellulaire et les réseaux de communication intercellulaires au sein d’organes complexes tels que lecœur 5. L’approche multiomique, qui synthétise des données génétiques, transcriptomiques et protéomiques, offre un potentiel considérable pour élucider les mécanismes de la maladie et identifier des voies thérapeutiques.
Malgré ces avancées technologiques, d’importantes lacunes de connaissances persistent concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques qui entraînent l’inflammation cardiaque et le remodelage en cas d’insuffisance cardiaque. Les preuves accumulées suggèrent que les cellules immunitaires, en particulier les macrophages, sont cruciales pour orchestrer les réponses inflammatoires et le remodelage tissulaire subséquent lors des lésions du myocarde et des processus d’insuffisance cardiaque chronique, qui sont à leur tour essentiels à la progression de lamaladie 6. Les recherches précédentes se sont principalement concentrées sur des médiateurs inflammatoires larges ou marqueurs de surface cellulaire, ce qui a entraîné une interruption significative dans l’exploration des cibles régulatrices intracellulaires au sein de ces populations cellulaires immunitaires cruciales. De plus, bien que les études traditionnelles d’association génomique large (GWAS) aient identifié de nombreuses associations génétiques liées à l’insuffisance cardiaque, elles rencontrent fréquemment des difficultés à établir des relations causales définitives, limitant ainsi leur applicabilité à la traduction thérapeutiquedirecte 7. Par conséquent, la mise en œuvre d’un cadre complet multiomique de randomisation mendélienne (MR), qui intègre des variants génétiques influençant la méthylation de l’ADN (mQTLs), l’expression génique (eQTLs) et l’abondance protéique (pQTLs), est essentielle pour obtenir des inférences causales plus robustes à travers plusieurs couches régulatrices biologiques. Cette approche répond aux limites inhérentes aux études QTL monocouches. Notamment, la protéine du type Drebrin-like (DBNL) a fait l’objet de recherches approfondies dans le contexte du développement neuronal et de la dynamique ducytosquelette 8 ; cependant, son importance fonctionnelle et son potentiel thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires, en particulier l’insuffisance cardiaque, restent largement inexplorés. Cette lacune importante dans notre compréhension entrave la considération du DBNL comme une cible nouvelle et potentiellement viable pour le développement de médicaments dans le traitement de l’insuffisance cardiaque.
Pour combler ces lacunes de connaissances critiques, cette étude vise à identifier de manière robuste les gènes clés liés causalement au risque d’insuffisance cardiaque grâce à un cadre intégré multiomique d’IRM combinant des données eQTL, mQTL et pQTL. Cette étude présente une approche novatrice impliquant l’intégration d’analyses multiomiques de randomisation mendélienne — incluant des loci de traits quantitatifs d’expression (eQTLs), des loci de traits quantitatifs de méthylation (mQTLs) et des loci de traits quantitatifs protéiques (pQTLs) — avec des données transcriptomiques unicellulaires à haute résolution (GSE161470) et des données transcriptomiques massives (GSE161472) afin d’identifier systématiquement le gène DBNL comme facteur de risque causal critique pour l’insuffisance cardiaque. Ces résultats démontrent que la DBNL est principalement et spécifiquement exprimée dans les macrophages cardiaques et que son expression change dynamiquement tout au long de leur processus de différenciation. De plus, les résultats de cette étude éclairent le rôle central de la DBNL dans la modulation du microenvironnement immunitaire cardiaque et l’orchestration des voies immunométaboliques associées à l’insuffisance cardiaque, telles que la cascade de signalisation IL-6/JAK/STAT3, ainsi que les voies de signalisation profibrotiques. De plus, en utilisant des techniques de biologie computationnelle, cette recherche prédit que l’acide pyridylique (WY-14643) est un ligand à haute affinité pour le DBNL, fournissant ainsi un cadre théorique complet et multidimensionnel qui soutient la désignation du DBNL comme nouvelle cible thérapeutique pour l’insuffisance cardiaque et facilite le développement d’interventions pharmacologiques ciblées. En utilisant le séquençage à ARN unicellulaire, nous avons caractérisé l’expression cellulaire spécifique et les voies fonctionnelles du gène clé DBNL identifié dans le microenvironnement cardiaque, et nous avons étudié le rôle de DBNL dans les voies de signalisation immunométabolique et profibrotique, ainsi que dans la communication cellulaire-cellule entre types cellulaires cardiaques. Des ligands potentiels de petites molécules pour DBNL ont été identifiés grâce à des simulations de docking moléculaire computationnel et de dynamique moléculaire. Nous émettons l’hypothèse que la DBNL, qui s’exprime principalement dans les macrophages cardiaques, exerce un effet causal sur la progression de l’insuffisance cardiaque en régulant les voies immunométaboliques et la diaphonie intercellulaire. En résumé, en intégrant la randomisation mendélienne multiomiques avancée avec l’analyse monocellulaire à haute résolution, nous avons systématiquement identifié et caractérisé de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’insuffisance cardiaque et exploré des cibles modulatrices potentielles de petites molécules.
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Protocole
Téléchargement de données
Données d’expression génique
Les données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) utilisées dans la présente étude proviennent du dépôt Gene Expression Omnibus (GEO) maintenu par le National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), plus précisément à partir du jeu de données portant le numérod’accès 9 GSE161470 (tissu cardiaque humain comprenant quatre échantillons témoins et un échantillon pathologique). Ce jeu de données a été initialement publié par Zhang et al. en 202210. L’objectif principal de l’étude initiale était d’examiner l’hétérogénéité cellulaire et les mécanismes de régulation moléculaire dans le tissu cardiaque humain en cas d’insuffisance cardiaque. Pour l’analyse actuelle, cinq échantillons de ce jeu de données, chacun comprenant des profils d’expression unicellulaires complets dérivés du tissu cardiaque humain, ont été sélectionnés. L’autre jeu de données utilisé dans cette étude a également été obtenu dans le dépôt public GEO du NCBI, en particulier le fichier matrice en série correspondant au numéro d’accession GSE161472, accompagné du fichier d’annotation GPL11154. Le profil d’expression comprend un total de 84 échantillons, dont 37 échantillons témoins et 47 échantillons de maladies. Cette recherche comprend une analyse multiomique intégrative, toutes les recherches étant menées à partir de données accessibles au public.
Données eQTL
Les données eQTL, obtenues du consortium eQTLGen, se concentrent sur l’élucidation du cadre génétique de l’expression génique dans le sang et des facteurs génétiques influençant les traitscomplexes 3. Le consortium est actuellement engagé dans la deuxième phase de son vaste projet, réalisant des méta-analyses de données génomes à l’échelle du génome relatives à l’expression génique sanguine.
Données d’exposition - mQTLs
Les données mQTL proviennent d’une méta-analyse publiée de la cohorte européenne (EUR), qui examine la méthylation de l’ADN dans le sang entier dans le cadre génétique de 3 701 échantillons provenant de populations d’ascendanceeuropéenne 11. Le jeu de données comprenait des informations sur 426 636 traits mQTL.
Données d’exposition - pQTL
Les données plasmatiques pQTL ont été acquises à partir de la base de données deCODE (https://www.decode.com/summarydata/)4. Cette étude a utilisé la publication de données de 2021 du jeu de données deCODE pQTL, englobant une étude d’association génomique (GWAS) des niveaux de protéines plasmatiques mesurés à l’aide de 4 907 aptamers dans une cohorte de 35 559 individus d’origine européenne.
Données des résultats
Les statistiques résumées de l’insuffisance cardiaque ont été obtenues à partir d’une étude d’association génomique à grande échelle (GWAS) principalement impliquant des participants d’ascendance européenne, accessible via la base de données de l’Institut européen de bioinformatique (EBI) (GCST90162626). L’ensemble de données sur l’insuffisance cardiaque comprenait 115 150 cas et 1 550 331 témoins. Le catalogue GSAS, qui regroupe des publications, des associations majeures et des statistiques résumées détaillées, propose actuellement des données mappées à l’assemblage génome et à la construction dbSNP.
Analyse de randomisation mendélienne des mQTLs, eQTLs et pQTLs
Pour étudier systématiquement les relations causales potentielles entre l’expression génique, l’abondance des protéines, les niveaux de méthylation de l’ADN et le risque d’insuffisance cardiaque, des analyses de randomisation mendélienne (RM) ont été réalisées en utilisant des ensembles de données de loci de traits quantitatifs d’expression (eQTLs), loci de traits quantitatifs de protéines (pQTLs) et de loci de traits quantitatifs de méthylation (mQTLs). Lors de la phase de prétraitement des données d’exposition, des polymorphismes mononucléotides (SNP) associés à chaque variable d’exposition (gène, protéine ou site de méthylation) ont été extraits des bases de données respectives à un seuil de signification génomique de P < 1 × 10⁻⁵ pour servir de variables instrumentales (IV) candidates initiales. Par la suite, un agglomération par déséquilibre de liaison (LD) a été réalisé pour chaque IV de chaque facteur d’exposition en utilisant une fenêtre de 10 000 kilobases (kb) et un seuil LD R² de 0,001 afin d’assurer l’indépendance entre les instruments. Ces IV sélectionnés ont ensuite été harmonisés avec des statistiques résumées issues d’une étude d’association génomique à l’échelle de l’insuffisance cardiaque (GWAS ; ID : GCST90162626) en employant la fonction read_outcome_data, en ne conservant que les SNP présentant une valeur d’association P inférieure à 5×10⁻⁵ dans l’ensemble de données des résultats. Pour atténuer le faible biais de l’instrument, la statistique F pour chaque IV a été calculée comme F = (β_exposure/SE_exposure)², et seuls les instruments avec F > 10 ont été inclus dans les analyses ultérieures. Pour l’estimation de l’effet causal, l’alignement des allèles entre les ensembles de données d’exposition et de résultats a été réalisé à l’aide de la fonction harmonize_data du package TwoSampleMR. Des analyses RM ont ensuite été réalisées en utilisant quatre approches statistiques complémentaires : (1) la méthode pondérée par l’inverse de la variance (IVW), qui fournit des méta-analyses des estimations du ratio de Wald entre SNP ; (2) la régression MR-Egger, qui prend en compte la pléiotropie directionnelle en incorporant un terme d’interception sous l’hypothèse Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE) ; (3) la méthode de la médiane pondérée, qui fournit des estimations causales cohérentes même si jusqu’à 50 % des instruments sont invalides ; et (4) la méthode du mode pondéré, qui identifie le groupe d’estimations d’effets causals le plus fréquent, offrant une puissance statistique accrue et une réduction de l’erreur de type I par rapport à MR-Egger. Dans les cas où une seule variable instrumentale était disponible, la méthode du ratio de Wald était appliquée exclusivement. Pour évaluer la robustesse des résultats, des analyses de sensibilité complètes ont été réalisées, incluant des tests d’hétérogénéité via la fonction mr_heterogeneity, une évaluation de la pléiotropie avec mr_pleiotropy_test, et des analyses sans réponse implémentées via la fonction mr_leaveoneout, qui exclut itérativement chaque SNP afin de déterminer l’influence des variants individuels sur les résultats globaux. Des associations significatives ont été visualisées à l’aide d’outils graphiques tels que mr_scatter_plot et mr_forest_plot. Ce pipeline analytique a été appliqué de manière uniforme à travers les ensembles de données eQTL, pQTL et mQTL afin de maintenir la cohérence méthodologique tout au long de l’étude.
Analyse de colocalisation
Une analyse de colocalisation a été réalisée via la méthode Coloc, des données résumées eQTL et un GWAS de l’insuffisancecardiaque 5. Le polymorphisme à nucléotide unique (SNP) d’indice a été utilisé pour calculer la probabilité a posteriori dans une fenêtre de regroupement de 100 kb. Dans l’analyse de la colocalisation (coloc), l’hypothèse H3 désigne la probabilité a posteriori que les deux traits, à savoir l’expression génique et l’insuffisance cardiaque, soient corrélés mais possèdent des variantes causales distinctes. Inversement, l’hypothèse H4 indique la probabilité a posteriori que l’association entre les deux traits soit attribuable à une seule variante causale partagée. Un seuil du SNP. PP. H4 supérieur à 0,90 a été utilisé pour déterminer la colocalisation.
Infiltration immunitaire
La méthode CIBERSORT est une technique largement adoptée pour évaluer les types de cellules immunitaires dans le microenvironnement12. En utilisant les principes de régression des vecteurs de soutien, une analyse de déconvolution de la matrice d’expression des sous-types de cellules immunitaires peut être réalisée. En incorporant 547 biomarqueurs, CIBERSORT peut différencier 22 phénotypes de cellules immunitaires humaines, incluant les lymphocytes T, les cellules B, les plasmocytes et diverses sous-populations de cellules myéloïdes. En utilisant le jeu de données GSE161472, une analyse a été réalisée en utilisant l’algorithme CIBERSORT en conjonction avec sa matrice intégrée LM22, qui caractérise les profils d’expression génique de 22 types distincts de cellules immunitaires humaines. Les niveaux d’infiltration de ces 22 populations de cellules immunitaires ont été quantifiés pour chaque échantillon individuel. Par la suite, la fonction cor.test a été appliquée pour évaluer les corrélations entre l’expression des gènes clés et les niveaux d’infiltration des cellules immunitaires correspondants.
Traitement des données et contrôle qualité du séquençage de l’ARN à cellules uniques
Les données du profil d’expression monocellulaire étaient traitées à l’aide du package Seurat (V4.3.0) dans l’environnement R (V4.3.0) 6. Cette étude a utilisé un flux de travail conventionnel pour l’analyse des données de séquençage d’ARN unicellulaire. Initialement, les profils d’expression étaient importés à l’aide du package Serat. Les cellules ont été filtrées sur la base de plusieurs indicateurs de qualité, notamment le nombre total d’UMI de chaque cellule, le nombre de gènes exprimés, la proportion de lectures mitochondriales et la proportion de lectures ribosomiques. Les valeurs aberrantes ont été identifiées comme des valeurs s’écartant de la médiane de plus de trois déviations absolues (DMA). Les seuils de filtrage spécifiques appliqués étaient les suivants : nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 et nCount_RNA ≤ 5194,27. En général, les cellules présentant des taux totaux d’UMI et un nombre excessivement élevé de gènes exprimés étaient classées comme doublets, tandis que les cellules présentant des pourcentages élevés de lectures mitochondriales ou ribosomales étaient considérées comme de faible qualité, susceptibles de subir une apoptose ou une fragmentation. En suivant ces étapes de filtrage, DoubletFinder (version 2.0.4) a été utilisé pour identifier et retirer les doublets de chaque échantillon individuellement, complétant ainsi le processus de contrôle qualité des cellules. Initialement, la normalisation des données était effectuée à l’aide de la fonction normalizeData. Le statut du cycle cellulaire a ensuite été évalué via la fonction CellCycleScoring, et des gènes très variables ont été identifiés via la méthode FindVariableFeatures. L’ensemble de données a ensuite été mis à l’échelle à l’aide de ScaleData afin de standardiser les données et d’atténuer l’influence des gènes mitochondriaux, des gènes ribosomaux et des effets du cycle cellulaire sur les analyses en aval. La réduction linéaire de la dimensionnalité a été réalisée à l’aide de l’analyse en composantes principales (PCA) via la fonction RunPCA, avec des composantes principales significatives sélectionnées pour une analyse ultérieure. Pour traiter les effets batch entre différents échantillons, l’algorithme Harmony (version 1.1.0) a été utilisé. Cette approche regroupe de manière itérative des cellules similaires issues de lots distincts dans l’espace PCA tout en maintenant la diversité des lots au sein des clusters. Compte tenu des effets de lot relativement légers observés dans le jeu de données, des paramètres par défaut (θ = 2) ont été appliqués. La réduction de dimensionnalité non linéaire a ensuite été réalisée à l’aide de RunUMAP, suivie de la construction d’un graphe de voisinage cellulaire via FindNeighbors et d’un regroupement de cellules via FindClusters. Pour l’annotation des types cellulaires, un cadre d’annotation hiérarchique a été mis en place : l’annotation manuelle principale était basée sur des schémas d’expression génique caractéristiques informés par la base de données CellMarker et la littérature pertinente ; cela était complété par des résultats d’annotation automatisés obtenus à partir du logiciel SingleR comme référence. Pour accroître davantage la précision et la exhaustivité de l’identification des types cellulaires, plusieurs bases de données faisant autorité, dont l’Atlas des cellules primaires humaines (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell et NovershternHaematopoétique, ont été consultées. L’annotation cellulaire a été réalisée en interrogeant la base de données CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) et en examinant la littérature, aidé par le support automatisé des annotations fourni par le logiciel SingleR (V2.4.0) 13. Il vise à identifier les types cellulaires présents dans le tissu correspondant ainsi que leurs gènes marqueursassociés 14.
Analyse des interactions ligand-récepteur
Dans cette étude, CellCall (version 1.0.7) a été utilisée pour réaliser une analyse complète des réseaux de communicationintercellulaires 15. En utilisant des annotations de type cellulaire dérivées de Seurat avec la matrice de comptage brute, un objet d’analyse normalisé a été construit avec des paramètres configurés pour le génome humain. La fonction TransCommuProfile a été appliquée pour quantifier la force des interactions cellule-cellule via un algorithme pondéré, en implémentant un seuil de signification d’une valeur p < 0,05 pour identifier des paires ligand-récepteur fiables. Les paires d’interactions significatives ont ensuite été soumises à une analyse d’enrichissement des voies KEGG via la fonction getHyperPathway, et les relations entre types cellulaires et voies ont été illustrées à l’aide de graphiques à bulles. Le réseau de communication global a finalement été visualisé à travers un graphique circulaire, dans lequel huit couleurs distinctes indiquaient différents types de cellules. La force d’interaction et la directionnalité étaient représentées par des flèches, fournissant une caractérisation détaillée de la dynamique de la signalisation intercellulaire.
Analyse du pseudo-temps
Pour étudier la régulation transcriptionnelle dynamique des macrophages tout au long de la progression de l’insuffisance cardiaque, cette étude a utilisé l’algorithme Monocle pour mener une analyse en pseudo-temps sur les sous-populations de macrophages. La matrice d’expression génique correspondant aux sous-populations cellulaires cibles a été extraite pour construire des objets d’analyse de trajectoire monocellulaire, avec des gènes très variables sélectionnés comme caractéristiques d’ordre. En utilisant la technique de réduction de dimensionnalité DDRTree, les cellules ont été cartographiées sur un espace bidimensionnel pour reconstruire la trajectoire de différenciation. Des analyses de visualisation ont été réalisées pour déterminer la répartition des cellules le long de l’axe du pseudo-temps et identifier les gènes dont l’expression a changé de manière significative au cours du pseudo-temps. Les analyses ultérieures se sont concentrées sur le gène clé DBNL et ont caractérisé sa dynamique d’expression le long de la trajectoire cellulaire, élucidant les mécanismes de reprogrammation transcriptionnelle des macrophages lors de la progression de l’insuffisancecardiaque 16.
Analyse d’enrichissement d’ensembles de gènes (GSEA)
Dans cette étude, une approche GSEA a été utilisée pour élucider les mécanismes régulateurs associés aux gènes clés impliqués dans l’insuffisance cardiaque. En utilisant des gènes clés identifiés précédemment, les échantillons ont été stratifiés en cohortes à haute et faible expression en fonction de la valeur médiane d’expression. Une analyse d’expression différentielle a été réalisée en utilisant le paquet Limma, générant une liste de gènes classée selon le log fold change (logFC). L’analyse ultérieure d’enrichissement des voies KEGG a été réalisée à l’aide de l’outil clusterProfiler, les ensembles de gènes provenant de la base de données MsigDB servant de fond de référence. L’algorithme GSEA a ensuite été appliqué pour identifier les voies de signalisation significativement enrichies entre les deux groupes d’expression, et un seuil ajusté de p-value inférieur à 0,05 a été utilisé pour déterminer la signification statistique. Pour illustrer les fonctions régulatrices des gènes centraux dans les voies critiques, diverses techniques de visualisation, incluant des graphiques GSEA multi-voies et des diagrammes de réseaux circulaires, ont été utilisées.
Analyse des variations d’ensembles génétiques (GSVA)
La GSVA est une approche non paramétrique et non supervisée utilisée pour évaluer l’enrichissement des ensembles géniques au sein des données transcriptomiques. Cette méthode transforme les variations au niveau des gènes en variations au niveau des voies en calculant des scores composites pour des ensembles de gènes spécifiques, facilitant ainsi l’évaluation des changements fonctionnels biologiques à travers divers échantillons. Dans la présente étude, les ensembles de gènes proviennent de la Molecular Signatures Database. L’algorithme GSVA a été utilisé pour calculer des scores composites pour chaque ensemble de gènes, permettant d’évaluer les altérations potentielles de la fonction biologique à travers différents échantillons. Les résultats de l’analyse d’enrichissement GSVA sont fournis dans le matériel complémentaire (Tableau supplémentaire 1).
Prédiction des médicaments pour la DTC
Le gène cible (DBNL) a été saisi dans le champ de recherche de la Comparative Toxicogenomics Database (CTD), la catégorie de maladie « cardiomaladie » a été sélectionnée, et la requête a été exécutée pour récupérer les données de prédiction des médicaments associées à la condition « insuffisance cardiaque ». Les résultats de prédiction obtenus ont ensuite été importés dans le logiciel Cytoscape pour faciliter la visualisation des données et permettre la construction d’une carte du réseau d’interaction gène-chimique.
Méthodes d’amarrage moléculaire
En raison de la structure cristalline tridimensionnelle non résolue de la protéine DBNL humaine (UniProt ID : Q9UJU6), cette étude a prédit la structure tridimensionnelle de DBNL sur la base d’AlphaFold317. L’acide pirixique (WY-14643) est disponible en téléchargement depuis la base de données PubChem (PubChem CID : 5694). Par la suite, la structure protéique a été prétraitée à l’aide du logiciel MGLTools (version 1.5.7)18, incluant des étapes telles que l’ajout d’atomes d’hydrogène. Parallèlement, les protéines et les petites molécules ont été converties dans le format PDBQT nécessaire pour l’amarrage. Le logiciel AutoDock Vina (version 1.1.2)19 a été utilisé pour l’amarrage moléculaire global (exogénicité = 16, num_modes=30) afin d’explorer des modes de liaison potentiels. À la fin des calculs d’amarrage, la conformation complexe avec la plus grande affinité, indiquée par la plus faible énergie libre de liaison, doit être sélectionnée comme structure initiale pour les simulations ultérieures de dynamique moléculaire.
Méthode de simulation de la dynamique moléculaire
Pour étudier systématiquement la stabilité de liaison et les mécanismes d’interaction entre les composés candidats et les protéines, des simulations conventionnelles de dynamique moléculaire (MD) ont été réalisées à l’aide du logiciel GROMACS (version 2024.03)20. Les paramètres protéiques ont été générés à l’aide du champ de force Amber14SB21, le modèle de molécules d’eau a été généré avec le modèleTIP3P 22, et les paramètres de topologie des ligands ont été générés à l’aide de l’outil Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE), basé sur le Champ de Force Ambre Général (GAFF). Le système complexe ligand-protéine a ensuite été situé dans une boîte octaédrique périodique de frontière remplie de molécules d’eau TIP3P. Des ions sodium (Na⁺) et chlorure (Cl⁻) ont été introduits pour atteindre une concentration de 0,15 mol/L et neutraliser la charge globale du système. Une fois la construction du système terminée, la première étape consistait à minimiser l’énergie en utilisant la méthode de descente la plus raide sur 50 000 marches, dans le but d’éliminer toute conformation potentiellement déconsidérable à l’intérieur de la structure. Deux étapes d’équilibrage du système ont ensuite été réalisées : une simulation NVT (nombre constant de particules, volume et température) à 100 ps, suivie d’une simulation NPT (nombre constant de particules, pression et température) à 100 ps. Lors de ces simulations, des contraintes de position ont été appliquées aux atomes lourds de la colonne vertébrale de la protéine afin de préserver l’intégrité structurelle de la protéine. La température était maintenue à 300 K grâce au thermostat V-rescale, et la pression était régulée à 1 bar grâce au barostat de Parrinello-Rahman pour l’accouplement de pression. À l’issue de la phase d’équilibre, une simulation de phase de production s’étendant sur 100 nanosecondes a été réalisée, durant laquelle toutes les contraintes de position sont éliminées. La trajectoire a été intégrée à l’aide d’un pas de temps de 2 femtosecondes, et la méthode Ewald à maillage de particules (PME) a été employée pour gérer précisément les interactions électrostatiques à longue portée. La trajectoire était sauvegardée tous les 10 ps, et un total de 10 000 images étaient produites pour une analyse ultérieure. De plus, des trajectoires stables dans l’intervalle de 90 à 100 ns ont été extraites de la simulation, et l’énergie libre de liaison des complexes protéiques de ligands a été calculée à l’aide de l’outilMMPBSA 23 du GMX.
Analyse statistique
La validité de cette analyse de randomisation mendélienne (MR) dépend de trois hypothèses fondamentales. (1) Pertinence : Les variables instrumentales (IV) doivent présenter une forte association avec l’exposition. (2) Indépendance : Les IV doivent être indépendants de tout facteur de confusion affectant à la fois l’exposition et le résultat. (3) Restriction d’exclusion : Les IV doivent influencer le résultat uniquement par leur impact sur l’exposition. Une violation de cette hypothèse, lorsqu’une intraveineuse influence le résultat par des voies ne concernant pas l’exposition, est appelée pléiotropie horizontale. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec la version R 4.3.0, avec des tests bidirectionnels, et une valeur p inférieure à 0,05 était généralement considérée comme indiquant une signification statistique.
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Résultats
Identification de DBNL comme gène associé au risque d’insuffisance cardiaque par randomisation mendélienne et analyse de localisation
L’identifiant de résultat pour les échantillons liés à l’insuffisance cardiaque, GCST90162626, a été obtenu à partir du jeu de données statistiques sommaires. Les relations causales entre 1 247 paires de loci de traits quantitatifs d’expression (eQTLs) et les résultats ont été déterminées en utilisant les fonctions extract_instruments et extract_outcome_data (Ta...
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Discussion
Bien que l’inflammation constitue un aspect fondamental de la physiopathologie de l’insuffisance cardiaque (IC), les recherches précédentes se sont principalement concentrées sur les médiateurs inflammatoires généralisés et les marqueurs de surface cellulaire 17,18,24. Cette focalisation a limité l’élucidation des mécanismes cellulaires spécifiques impliqués. Pour surmonter ces limites, nous avo...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.
Remerciements
Ce programme de recherche a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang de Chine (LTGY24H020001), le Projet de Science et de Technologie sur la Médecine Traditionnelle Chinoise dans la province du Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), le Projet clé de bien-être public de Ningbo (2024S030), le programme de R&D sur les technologies clés de Ningbo (2022Z149), le Laboratoire clé de médecine de précision pour les maladies athéroscléreuses de la province du Zhejiang (2022E10026). et le projet de fonds spécial pour la recherche médicale clinique de l’Association médicale du Zhejiang (2021ZYC-A11).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Base de données CellMarker | Université Médicale de Harbin (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | Base de données CellMarker ; Pour interroger les gènes marqueurs de tissu/type cellulaire lors d’une annotation unicellulaire |
| Base de données comparative de toxicogénomique (CTD) | CTD (Université Duke et al.) | http://ctdbase.org/ | Base de données CTD ; Pour récupérer les interactions entre produits chimiques, gènes, phénotypes et maladies, utilisé pour la prédiction des médicaments |
| Jeu de données plasma pQTL deCODE (2021, 4 907 aptamers, 35 559 échantillons européens) | Génétique deCODE | https://www.decode.com/summarydata/ | Publication des données pQTL 2021 ; Utilisé comme données d’exposition pQTL pour l’analyse IRM |
| eQTLGen Whole Blood eQTL Data | Consortium eQTLGen | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen phase I/II (version spécifique selon usage) ; Utilisé comme données d’exposition eQTL pour l’IRM et l’analyse de localisation |
| Jeu de données GEO Single-cell RNA-seq GSE161470 (Tissu cardiaque humain : 4 témoins + 1 échantillon pathologique) | Omnibus sur l’expression génique du NCBI (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470 ; Obtenir des données de séquençage d’ARN unicellulaire du tissu cardiaque humain pour une analyse en aval |
| Catalogue GWAS | NHGRI&ndash ; EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | Catalogue GWAS ; Pour récupérer les informations, annotations et analyses auxiliaires GWAS liées aux HF |
| Statistiques résumées GWAS sur l’insuffisance cardiaque (GCST90162626) | NHGRI&ndash ; Catalogue EBI GWAS | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Admission aux études : GCST90162626 ; Utilisé comme données de résultats pour l’IRM et l’analyse de la localisation |
| Base de données des signatures moléculaires (MSigDB) v7.0 | Institut Broad | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0 ; Pour les ensembles de gènes de fond GSEA / GSVA et les annotations de voies |
| Acide pirixique (WY-14643) Données de structure (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID : 5694 ; Utilisé pour obtenir une structure 3D de ligands pour la simulation de l’amarrage moléculaire et de la dynamique |
| Base de données des protéines UniProt (DBNL, ID UniProt : Q9UJU6) | UniProt Consortium | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt : Q9UJU6 ; Utilisé pour obtenir la séquence d’acides aminés de DBNL pour la prédiction de structure et l’amarrage |
| Méta-analyse mQTL du sang entier (Réf. 11, 3 701 échantillons européens, 426 636 traits mQTL) | Auteurs / Consortium (selon votre référence 11) | En attente : l’auteur doit ajouter l’URL originale de la base de données / DOI | DOI de référence ou ID de jeu de données ; Utilisé comme données d’exposition mQTL pour l’analyse IRM |
Références
- Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
- Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
- Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
- Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
- Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
- Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
- van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
- Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
- Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
- Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
- Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
- Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
- Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
- Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
- Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
- Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
- Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
- Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
- Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
- Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
- Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
- Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
- Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
- Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
- Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
- Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).
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