Effets anti-inflammatoires des lactones sesquiterpènes provenant d’Eupatorium lindleyanum DC. dans Robent Models

Résumé

Cette étude démontre que les lactones sesquiterpènes proviennent d’Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) exercent des effets anti-inflammatoires significatifs dans les modèles d’œdème de l’oreille de souris induit par le xylène et d’œdème de patte de rat induit par la carragènene en atténuant les lésions histopathologiques, en réduisant la libération de cytokines et en inhibant l’activation de la signalisation NF-κB.

Résumé

L’inflammation aiguë est un processus pathologique fondamental impliqué dans de nombreuses maladies liées au système immunitaire. Eupatorium lindleyanum La DC., une plante médicinale traditionnelle, est riche en lactones sesquiterpènes (SLEL), dont il a été rapporté qu’elles présentent une activité pharmacologique ; cependant, leurs effets anti-inflammatoires et les modifications moléculaires associées restent incomplètement caractérisés. Dans cette étude, des réponses inflammatoires aiguës ont été induites dans un modèle d’œdème de l’oreille de souris induit par le xylène et un modèle d’œdème de patte de rat induit par la carragénienne. Les lésions tissulaires et l’infiltration inflammatoire ont été évaluées par coloration par hématoxyline et éosine. Les niveaux de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6 et IL-1β) ont été quantifiés dans le sérum par ELISA, et leur expression transcriptionnelle dans les tissus enflammés a été analysée par PCR quantitative (qPCR). Les modifications des protéines associées à la voie NF-κB, y compris IκBα phosphorylée et p65, ont été évaluées par western blotting. Le traitement SLEL a réduit l’œdème de l’oreille et des pattes et atténué les caractéristiques histopathologiques de l’inflammation aiguë, notamment l’œdème tissulaire, l’infiltration des cellules inflammatoires et la congestion vasculaire. Parallèlement, l’administration de SLEL était associée à une diminution des niveaux sériques et de l’expression d’ARNm tissulaire de Tnf-α, Il-6 et Il-1β. L’analyse Western blot a démontré une réduction de la phosphorylation d’IκBα et p65 dans les tissus enflammés après un traitement SLEL, indiquant une modulation des événements de signalisation liés à NF-κB. Ensemble, ces résultats démontrent un flux de travail expérimental pour évaluer l’activité anti-inflammatoire du SLEL dans les modèles d’inflammation aiguë et suggèrent que ses effets sont associés à une diminution de l’expression des cytokines pro-inflammatoires et à une signalisation liée à la voie NF-κB modifiée.

Introduction

L’inflammation est une réponse défensive complexe déclenchée par une invasion pathogène ou une lésion tissulaire et joue un rôle crucial dans la limitation des infections, l’élimination des stimuli nocifs et la promotion de la réparation^{tissulaire 1}. Bien que les réponses inflammatoires contrôlées soient essentielles pour maintenir l’homéostasie tissulaire, une inflammation excessive ou persistante peut entraîner des lésions tissulaires, des dysfonctionnements des organes et la progression de maladies chroniques. Cliniquement, l’inflammation se caractérise par des rougeurs, un gonflement, une chaleur et des douleurs, et dans les cas graves peut entraîner des réponses pathologiques systémiques. De plus en plus de preuves ont établi un lien entre une inflammation déréglée et le développement du cancer, des maladies cardiovasculaires et des maladies auto-immunes²˒³.

Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont actuellement les agents les plus utilisés pour gérer l’inflammation. Malgré leur efficacité dans le soulagement des symptômes, l’utilisation prolongée d’AINS est fréquemment associée à des effets indésirables, notamment des irritations gastro-intestinales, des réactions d’hypersensibilité et une^{hépatotoxicité 4}, qui limitent leur applicabilité clinique. En conséquence, l’intérêt pour l’identification d’agents anti-inflammatoires alternatifs avec des profils de sécurité améliorés grandit est croissant. Les produits naturels, y compris les remèdes à base de plantes traditionnelles, ont été explorés comme sources potentielles de composés bioactifs aux propriétés immunomodulatrices. Cependant, les affirmations généralisées concernant une faible toxicité ou des fonctions régulatrices systémiques doivent être interprétées avec prudence et nécessitent une validation expérimentale dans des modèles de maladies^{définis 5}.

Eupatorium lindleyanum DC. est une plante médicinale traditionnelle dont les phytochimiques caractéristiques incluent les lactones sesquiterpènes, principalement des composés de type guaïanolïde et eudesmanolide, ainsi que des germacranolides et^{xanthanolides 6}. Extraits d’Eupatorium lindleyanum DC. ont été rapportés comme présentant des activités abaissant les lipides, anti-athérosclérotiques, antitumorales et anti-inflammatoires dans divers contextes^{expérimentaux 6}. En particulier, des extraits d’éthanol d’Eupatorium lindleyanum DC. ont montré des effets protecteurs dans les modèles de lésions pulmonaires aiguës induites par les lipopolysaccharides^{(LPS) 7}. Cependant, l’activité anti-inflammatoire de la SLEL et ses effets dans les modèles classiques d’inflammation aiguë restent insuffisamment caractérisés.

Pour combler cette lacune, nous avons utilisé deux modèles complémentaires d’inflammation aiguë : l’œdème de l’oreille induit par le xylène chez la souris, qui capture les réponses inflammatoires neurogènes et vasculaires rapides, et l’œdème des pattes induit par la carragénène chez les rats, un modèle bien établi reflétant l’inflammation aiguë dépendante du temps impliquant la production de cytokines et l’infiltration cellulaire. Des modèles alternatifs, tels que l’inflammation systémique induite par le LPS, n’ont pas été sélectionnés en raison de leur accent mis sur l’activation immunitaire systémique plutôt que sur l’œdème tissulaire localisé et leur adaptation limitée aux analyses histologiques et moléculaires au niveau^{tissulaire apparié 8}.

Grâce à cette stratégie combinée, les réponses inflammatoires ont été évaluées par des mesures quantitatives de l’œdème, une évaluation histopathologique par coloration par hématoxyline et éosine (H&E), un profilage des cytokines sériques, une analyse transcriptionnelle au niveau tissulaire et des modifications protéiques associées à NF-κB. Ce protocole est particulièrement adapté au dépistage de l’activité anti-inflammatoire dans l’inflammation aiguë, où la formation d’œdèmes, l’expression des cytokines et les lectures moléculaires associées aux voies sont d’intérêt. Néanmoins, il convient de reconnaître les limites des modèles aigus, notamment l’extrapolation restreinte aux affections inflammatoires chroniques et les limites interprétatives lors de l’inférence de causalité à partir des changements de signalisation au niveau tissulaire.

Collectivement, cette étude met en avant une approche basée sur des protocoles qui intègre des modèles complémentaires d’inflammation aiguë avec des analyses histologiques et moléculaires jumelées, fournissant un cadre reproductible pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire des composés d’origine herboriste.

Protocole

Le protocole d’étude animale a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Chongqing (IACUC-CQMU-2025-10073).

Préparation de la fraction enrichie en lactone sesquiterpène (SLEL)

Matières médicinales séchées d’Eupatorium lindleyanum DC. ont été pulvérisés et soumis à une extraction par reflux 2x avec 70 % (v/v) d’éthanol sous pression réduite. Chaque extraction a été réalisée avec un ratio solvant/matériau de 10:1 (v/w) pendant 2 heures. Les extraits combinés étaient filtrés, concentrés à pression réduite à ≤60 °C, puis lyophilisés sous vide pour obtenir la poudre d’extrait d’éthanol brut.

L’extrait séché a été entièrement dissous dans de l’eau distillée (concentration finale : 100 mg/mL) et soumis séquentiellement à une chromatographie en résine polyamide, suivie d’une chromatographie à résine d’adsorption macroporeuse D101 pour enrichir les lactones sesquiterpènes. Après avoir atteint l’équilibre d’adsorption, la résine D101 était lavée à l’eau distillée pour éliminer les impuretés polaires, puis éluée avec de l’éthanol anhydre. Après élution par éthanol, la fraction collectée était concentrée à pression réduite et soumise à lyophilisation pour produire la fraction SLEL, stockée à −20 °C jusqu’à utilisation.

La séparation a été réalisée sur une plateforme UPLC utilisant un système de phase mobile binaire composé d’acétonitrile et d’acide formique à 0,1 % (v/v) dans l’eau. Le programme de gradient comprenait une isolation isocratique initiale de 25 minutes à faible teneur organique, une rampe linéaire courte à 70 % d’acétonitrile, une phase à étapes organiques élevées à 90 % d’acétonitrile, et une étape finale d’équilibrage revenant aux conditions initiales. Le système fonctionnait à 0,25 mL·min⁻¹ avec une température de colonne de 35 °C et un volume d’injection de 0,1 μL (Figure supplémentaire S1).

Animaux

Un total de 36 rats mâles de Sprague–Dawley (200 ± 20 g) et 36 mâles de souris BALB/c (20 ± 2 g) ont été utilisés dans cette étude. Les animaux étaient hébergés dans des conditions standardisées (22 ± 2 °C, 55 ± 5 % d’humidité, 12 heures de cycle lumière/obscurité) avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les animaux étaient acclimatés pendant 7 jours avant l’expérimentation et surveillés quotidiennement pour leur santé générale. Toutes les interventions ont été réalisées pour minimiser la souffrance animale, et une anesthésie a été appliquée avant la prélèvement sanguin et le prélèvement des tissus.

Œdème de l’oreille induit par le xylène chez la souris

Le modèle de l’œdème de l’oreille de la souris a été établi comme décrit précédemment⁹. Après l’acclimatation, les souris ont été réparties aléatoirement en six groupes (n = 6 par groupe) : groupe témoin (CG), modèle (MG), dexaméthasone (DEX, 10 mg/kg), SLEL à faible dose (75 mg/kg), à dose moyenne (150 mg/kg) et à haute dose (300 mg/kg). Tous les traitements étaient administrés par gavage orale une fois par jour pendant 7 jours consécutifs (volume final de dosage : 10 mL/kg). À 1,5 h après l’administration finale, l’inflammation a été induite en appliquant 30 μL de xylène de façon uniforme sur les deux surfaces de l’oreille droite, sauf dans le groupe témoin. Trente minutes plus tard, les souris ont été anesthésiées, des échantillons sanguins prélevés et des poinçons circulaires de 8 mm ont été obtenus à partir de positions anatomiques identiques des deux oreilles.

Œdème des pattes induit par la carrraghéène chez les rats

Le modèle d’œdème de la patte de rat a été établi à l’aide de carragénène comme décrit précédemment¹⁰. Les rats ont été répartis au hasard en six groupes (n = 6 par groupe) : CG, MG, DEX (5 mg/kg), SLEL à faible dose (50 mg/kg), à dose moyenne (100 mg/kg) et à haute dose (200 mg/kg). Les traitements étaient administrés par voie orale une fois par jour pendant 7 jours (10 mL/kg). Les volumes de pattes de base ont été mesurés avant le dosage final. Trente minutes après la dernière administration, 0,1 mL de solution de carraghénine à 1 % (p/v) a été injecté sous-cutanée dans la surface plantaire de la patte arrière droite. Les volumes des pattes ont été mesurés à 1, 2, 3 et 4 heures après l’injection à l’aide d’un pléthysmomètre. L’œdème de patte était calculé comme suit :

Œdème des pattes ( %) = (Vt − V0) / V0 × 100 %

Examen histologique

Les tissus de l’oreille et des pattes ont été prélevés immédiatement après les évaluations fonctionnelles. Les tissus ont été fixés dans du formol tampon neutre à 10 % pendant 72 heures à température ambiante, intégrés dans la paraffine, coupés (5 μm) et colorés à H&E selon les protocoles^{standards 11}.

Dosage immunosorbant lié aux enzymes (ELISA)

Des échantillons séromiques ont été prélevés par centrifugation à 3 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Les niveaux de TNF-α, IL-6 et IL-1β ont été quantifiés à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce selon les protocoles standards.

Analyse du western blot

Des extraits protéiques totaux ont été préparés à partir des tissus de l’oreille et des pattes à l’aide d’un tampon de lyse RIPA complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Les concentrations de protéines ont été quantifiées à l’aide d’un test BCA, et des quantités égales de protéines (30 μg par échantillon) ont été résolues par SDS-PAGE et transférées sur les membranes de PVDF. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante, suivies d’une incubation avec des anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit et des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure à température ambiante. Des bandes immunoréactives ont été détectées grâce à une chimiluminescence améliorée et quantifiées avec le logiciel ImageJ.

PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

L’ARN total a été isolé des tissus de l’oreille et des pattes à l’aide du réactif d’extraction d’ARN indiqué dans le Tableau des matériaux. Un microgramme d’ARN total a été rétro-transcrit en ADNc à l’aide d’un kit commercial de transcription inversée selon les instructions du fabricant. La PCR quantitative a été réalisée à l’aide de la chimie verte SYBR avec des amorces spécifiques à un gène (Tableau 1) dans un volume de réaction de 10 μL sous un protocole d’amplification en deux étapes. Les conditions détaillées de transcription inverse et les paramètres de cycle PCR sont fournis dans la section Protocole. Les niveaux relatifs de transcripts ont été calculés à l’aide de la méthode 2^⁻ΔΔCT , avec le Gapdh utilisé comme gène de référence interne.

Données et analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Les comparaisons statistiques entre deux groupes ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student non apparié, tandis qu’une ANOVA unidirectionnelle a été appliquée pour des analyses impliquant plus de deux groupes. La signification statistique a été définie comme p < 0,05. La signification est indiquée par # p < 0,05 et ## p < 0,01 par rapport au groupe témoin (CG), et * p < 0,05 et ** p < 0,01 par rapport au groupe modèle (MG).

Résultats

Composition chimique en SLEL jusqu’à UPLC-Q/TOF/MSn

Le profil chimique de SLEL a été examiné à l’aide de UPLC-Q/TOF-MSn en modes ions positifs et négatifs. Neuf lactones sesquiterpènes ont été identifiées comme constituants prédominants (Figure supplémentaire S1). Les assignations de formules moléculaires ont été dérivées d’ions adductus observés, incluant [M+H]⁺ et [M+Na]⁺ en mode positif, ainsi que [M−H]⁻ et [M+HCOO]⁻ en mode négatif (Tableau supplém...

Discussion

Dans cette étude, les lactones sesquiterpènes provenant d’Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) a été évaluée à l’aide de deux modèles établis d’inflammation aiguë, à savoir l’œdème de l’oreille induit par le xylène chez la souris et l’œdème de pattes induit par la carragérène chez le rat. En incorporant le score histopathologique, les mesures de cytokines sériques, la quantification de l’ARNm au niveau tissulaire et les relevés de signalisation au niveau des protéines, ce protocole...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anti-GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti I&kappa ; B&alpha ;	Technologie de signalisation cellulaire	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti-P-I&kappa ; B&alpha ;	Technologie de signalisation cellulaire	2859
anti-p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1 & bêta ; Équipement	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
Kit IL-6	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Micropipette	Eppendorf
Lecteur de microplaques	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Kit de transcription inversée	MedChemExpress	HY-K051A
Tampon RIPA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-& alpha ; Équipement	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Congélateur ultra-basse température	SANYO