Un protocole de microscopie de localisation multi-marquage à molécule unique pour l’étude de la chromatine dans un environnement nucléaire dense

Summary

Nous présentons un protocole tricolore de microscopie de localisation de la chromatine à molécule unique (SMLM) qui permet une cartographie reproductible de l’euchromatine, de l’hétérochromatine et du RNAP II pour une analyse spatiale. Ce protocole permet un marquage multicolore efficace dans des environnements nucléaires denses, y compris des cibles associées à la chromatine, permettant une détection simultanée fiable.

Abstract

La microscopie à super-résolution a considérablement amélioré notre capacité à interroger les structures biologiques au-delà de la limite de diffraction, la rendant indispensable pour étudier les structures nucléaires densément compactes telles que la chromatine, les lamines nucléaires et les corps nucléaires tels que les nucléolos. La chromatine présente une organisation multi-échelle — des nucléosomes de taille nanométrique aux domaines à l’échelle micronique — nécessitant des approches d’imagerie capables à la fois d’une haute résolution et d’une spécificité moléculaire. La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM), en particulier la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), permet une cartographie précise des marques épigénétiques, offrant un éclairage crucial sur la structure et la fonction de la chromatine. Cependant, l’imagerie multi-marque dans l’environnement nucléaire présente des défis uniques, notamment une accessibilité réduite aux anticorps, une augmentation de la liaison non spécifique et une instabilité des fluorophores. Pour répondre à ces problèmes, nous présentons un protocole d’immunomarquage séquentiel optimisé pour les environnements nucléaires à haute densité, permettant un SMLM robuste à trois couleurs avec un minimum de diaphonie et une dégradation du signal moindre. Cette méthode inclut des formulations tampons optimisées, la sélection des fluorophores et des stratégies de validation des anticorps afin d’assurer un marquage reproductible et haute fidélité sur plusieurs cibles. Il est important d’intégrer ce protocole à un pipeline d’analyse computationnelle qui exploite les localisations d’une cible moléculaire comme ancres spatiales (points de départ) pour quantifier les distances inter-cibles, les densités locales et la co-affinité multi-étiquettes. Cela permet une analyse spatiale détaillée des composants de la chromatine à l’échelle nanométrique. Ce protocole sert de cadre reproductible pour l’imagerie multi-composantes et l’analyse quantitative dans des environnements subcellulaires denses, offrant un outil puissant aux chercheurs étudiant des architectures nucléaires complexes comme la chromatine.

Introduction

L’avènement de la microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM) a permis une exploration sans précédent de structures biologiques à l’échelle^{nanométrique} 1,2,3,4,5. Au-delà de l’imagerie à cible unique, l’extension à la SMLM multicolore a encore fait progresser le domaine en permettant la visualisation simultanée de multiples espèces moléculaires, ainsi que des relations spatiales et temporelles entre les structures de sous-diffraction 6,7,8,9,10,11 . Cependant, l’application de SMLM multiplexée à des modifications histoniques abondamment distribuées reste difficile en raison de la nature dense et polymérique de l’ADN nucléaire et de l’accessibilité limitée des anticorps dans cet^{environnement} 12,13,14,15,16,17,18.

La chromatine présente une organisation hiérarchique et multi-échelles couvrant plusieurs ordres de grandeur de longueur, allant des assemblages de nucléosomes à l’échelle nanométrique à l’architecture nucléaire à l’échelle micrométrique. À la plus grande échelle, les chromosomes occupent des territoires chromosomais distincts, au sein desquels le génome est ensuite divisé en compartiments A/B et domaines associés topologiquement (TAD) qui contraignent les interactions régulatrices à longue portée via des mécanismes tels que l’extrusion de^boucles 19,20,21,22 . À l’échelle inférieure à 200 nm, la chromatine est organisée comme un polymère désordonné composé de domaines d’empaquetement hétérogènes () plutôt que de blocs discrets d’euchromatine et d’hétérochromatine, avec des régions transcriptionnellement actives préférentiellement se localisant aux frontières 23,24,25,26,27,28,29. Aux plus petites échelles (5-20 nm), la chromatine se compose d’assemblages nucléosomes irréguliers et de pochettes de nucléosomes, soulignant l’absence d’un motif de repliement uniforme d’ordre supérieur et soulignant la nature émergente et dépendante de l’échelle de l’organisation^{du génome} 24,26,30. Avec l’avancement rapide des approches basées sur le séquençage, telles que le séquençage par immunoprécipitation par chromatine et la capture par conformation à haut débit 19,30,31,32,33, diverses caractéristiques des structures organisationnelles mésoscale de la chromatine ont été ^{identifiées 31,32}. Cependant, ces techniques, contrairement à l’imagerie, ne capturent pas une géométrie spatiale qui n’est observée qu’après résolution de ces structures. Des méthodes de microscopie électronique telles que la microscopie électronique par chromatine (ChromEM²⁴) et la microscopie électronique à balayage de la chromatine (ChromSTEM²⁵) ont révélé que la chromatine est hétérogène et organisée en domaines d’empaquetage à des échelles de longueur de 50 à 200 nm^{25, 28, 29}. Bien que ces techniques permettent une résolution impressionnante pour identifier les domaines d’empaquetement de la chromatine, elles ne peuvent pas fournir une cartographie moléculairamente spécifique comme le SMLM propose. L’accumulation de points d’ADN pour l’imagerie en topographie nanométrique (ADN-PAINT²²) et l’hybridation in situ par fluorescence multiplexée (FISH⁾¹⁹permet un multiplexage élevé ; cependant, DNA-PAINT est fortement affecté par un bruit de fond élevé provenant d’événements de liaison aléatoires dans l’environnement nucléaire riche en oligonucléotides^{, tandis} que les méthodes traditionnelles de dénaturation thermique FISH nécessitent un repliement de chromatine native perturbé. Des études antérieures ont appliqué des techniques d’imagerie à super résolution pour étudier la chromatine à cette échelle de longueur et ont identifié une composition hybride de domaines d’empaquetage, opposée aux modèles antérieurs de séparation^{de phase} 12,23,34,35. Ce protocole découle d’un article publié précédemment discutant de la signification biologique de ces^{découvertes 34}. Ainsi, compte tenu de sa haute résolution et de ses capacités de multiplexage, dSTORM basé sur l’immunocoloration reste la stratégie la plus viable pour l’imagerie par chromatine multicolore dans des conditions proches de la nativité.

Ce protocole n’est pas le premier à démontrer le marquage de plus de deux cibles nucléaires, des études antérieures ayant marqué des complexes protéiques ou gènes^{individuels 12,36}. Malgré le marquage réussi des modifications histoniques post-traductionnelles nucléosomistes, le marquage, l’imagerie et l’analyse multicolores de la chromatine SMLM présentent des défis importants. Premièrement, l’immunocoloration dans un environnement dense de chromatine nécessite une optimisation de la concentration d’anticorps, de la séquence d’incubation et de la composition du tampon afin d’assurer une pénétration et une liaison adéquates sans trop de fond. Deuxièmement, une analyse complète de plusieurs marquants est nécessaire, car les interactions entre l’euchromatine, l’hétérochromatine et des enzymes telles que l’ARN polymérase sont susceptibles de dépasser les simples exclusions binaires. Jusqu’à présent, le nombre maximal de couleurs démontrées en imagerie chromatine dSTORM reste de^{deux 18, 37, 38, 39}.

Nous présentons ici un protocole robuste pour l’imagerie et l’analyse SMLM en chromatine à trois couleurs. Notre flux de travail de coloration optimise le temps d’incubation des anticorps et utilise des tampons d’imagerie^{améliorés 40}pour une séance d’imagerie prolongée sur plusieurs marqueurs. Nous décrivons également des pipelines computationnels pour l’analyse de la distance en deux couleurs et l’analyse de la densité des articulations en trois couleurs, permettant la caractérisation quantitative des relations entre l’hétérochromatine, l’euchromatine et la machinerie de transcription. Contrairement aux études antérieures sur la chromatine bicolore SMLM qui suggéraient une séparation de l’hétérochromatine et de l’euchromatine, l’imagerie en chromatine tricolore révèle que le génome est organisé en domaines d’emballage, avec l’euchromatine et la transcription active localisées à la périphérie des noyaux constitutifs d’hétérochromatine³⁴.

Ce protocole fournit à la communauté un cadre reproductible pour réaliser la SMLM à la chromatine multicolore et établit des stratégies d’analyse adaptées à plusieurs cibles nucléaires conjuguées fonctionnellement. En comblant les lacunes méthodologiques, il permet une exploration systématique de l’organisation des domaines de la chromatine au niveau supra-nucléosomique, complétant les approches de séquençage et de microscopie électronique tout en préservant l’architecture nucléaire native. Cet article est un protocole étendu d’un article^{publié 34}.

Protocol

REMARQUE : La section protocolaire suivante sera divisée en le processus de coloration et le processus d’acquisition décrits ci-dessous. Pour des tutoriels d’analyse de données, veuillez consulter la publication^{associée 34} qui détaille l’analyse des multi-étiquettes pour les modifications d’histones marquées.

1. Procédé de coloration :

REMARQUE : Tout au long du protocole, il est fait mention de plats de 35 mm ou de 8 assiettes bien chambrées. Ce sont les vaisseaux que notre groupe utilise pour la culture cellulaire, mais des méthodes plus petites et plus efficaces sont possibles. Veillez à ce que les concentrations recommandées pour les anticorps tampons soient maintenues, si des matériaux alternatifs sont utilisés. En raison de la nature séquentielle de ce protocole, la sélection des anticorps est importante pour un marquage réussi. Nous utilisons un raisonnement standard pour garantir que nos anticorps hôtes pour nos cibles sont différents, de sorte que nos anticorps secondaires puissent cibler des espèces hôtes distinctes, minimisant efficacement les effets hors cible. L’ordre de marquage est déterminé en fonction de la localisation de la cible dans le noyau. Puisque nous ciblons les domaines d’empaquetement de la^{chromatine 25, 28, 34, 35} et comprenons qu’il s’agit d’un processus piloté par la diffusion, nous étiquetons toujours d’abord les cibles hétérochromatiques, suivies de l’euchromatine et enfin des RNAPII afin de minimiser l’exclusion stérique dans les régions hétérochromatiques denses. L’optimisation des tampons a été réalisée empiriquement lors du développement du protocole. Nous avons constaté que l’inclusion du sérum de chèvre après la première cible était utile pour réduire les effets hors cible lors des étapes suivantes.

1. Préparation des tampons
   1. Composants tampons :
      REMARQUE : Pour plus d’informations sur les composants, y compris les temps de stockage et de préparation, veuillez consulter le tableau des matériaux. Nous recommandons que l’utilisateur ait toutes les solutions prêtes avant de commencer le protocole afin d’éviter les erreurs expérimentales. La solution de trempe doit être faite en dernier.
   2. Créez un tampon de blocage
   3. Pesez l’albumine sérique bovine (BSA) de sorte que la concentration finale dans le volume tampon nécessaire pour l’expérience soit de 3 %, puis ajoutez-la dans un tube centrifugeuse. Inclinez le tube à un angle de 45° afin que les cristaux de BSA soient étalés dans le tube, puis ajoutez du sérum tampon phosphate (PBS). Cela est fait pour éviter la formation de tas cristallines qui ne se dissolvent pas.
   4. Laissez le tube à température ambiante jusqu’à ce que tous les cristaux soient dissous. Ne secouer pas le tube ou le vortex – cela provoquera la formation de bulles qui attireront les protéines à la surface et empêcheront la BSA de se dissoudre complètement.
   5. Une fois complètement dissous, ajouter le Triton X-100 de sorte que sa concentration finale soit de 0,2 % (v/v) compte tenu du volume choisi à l’étape 1.3. Si les cristaux ne sont pas complètement dissous, pipettez plusieurs fois pour mélanger lentement la solution sans former de bulles.
      REMARQUE : Si vous préparez un tampon modifié, incluez le sérum de chèvre à 10 % dans ce processus. Cependant, les tampons de blocage modifiés doivent être produits frais pendant l’utilisation et ne pas être conservés longtemps, mais garantir que les concentrations finales restent identiques à celles indiquées dans le tableau des matériaux : 3 % BSA, 0,2 % Triton X-100.
   6. Faites du lavage un tampon :
      Répétez les étapes pour bloquer le tampon dans la version 1.1.2, mais utilisez les concentrations indiquées dans la section matériaux et ici pour votre commodité (0,2 % de BSA, 0,1 % de Triton X-100 en 1X -DPBS, et pour les modifications inclure du sérum de chèvre à 1 %).
   7. Faites une solution fixative :
      1. Ajoutez du PBS à un tube centrifugeuse.
      2. Ajouter la quantité appropriée de 16 % de paraformel au tube centrifugeuse pour une concentration finale de 4 %.
         REMARQUE : Préparez les cellules fraîches et prêtes lors du retrait des cellules de l’incubateur. Bien que la solution fixative actuelle n’utilise normalement pas de glutaraldéhyde, elle peut être incluse et peut être utile grâce à une fixation plus robuste et à une fixation plus durable comparée au paraformaldéhyde. Le système pour dSTORM ne possède pas de capacités pour les signaux de fluorescence à durée de vie provenant du glutaraldéhyde (GA), cependant les utilisateurs qui en ont la possibilité peuvent trouver utile pour se distinguer des structures marquées par fluorophore.
   8. Préparez une solution de trempe :
      1. Pèser le borohydrure de sodium sur le papier de pesée.
      2. Préparez le tube de centrifugeuse.
      3. Ajoutez du borohydrure de sodium dans le tube.
      4. Ajoutez PBS à la tube.
         REMARQUE : La solution doit avoir des bulles après l’ajout du PBS.
   9. Faites de la zone tampon d’imagerie :
      1. Dissoudre le 1,4-Diazabicyclooctane (DABCO) dans de l’RNASE déionisée, de l’eau sans DNASE, pour obtenir une solution de 13 mL de DABCO avec une concentration de 1 M.
      2. Ajoutez 12 M HCl (~240 μL) jusqu’à ce que le DABCO soit complètement dissous et que le pH atteigne 8,0.
      3. Préparez 1 M de sulfite de sodium en le dissolvant dans 10X PBS. La TDT ne nécessite aucune préparation.
      4. Pour la préparation finale, utilisez des stocks antérieurs pour produire 65 mM de DABCO avec 30 mM de sulfite de sodium et 30 mM de DTT (1 M de stock) dans de l’eau désionisée.
      5. Ajustez le pH par titration avec HCl et NaOH jusqu’à atteindre 8,0. Conserver couvert et scellé avec du Parafilm à 4° C au maximum 2 mois. Surveillez le pH tout au long de l’utilisation.
2. Détails du processus de coloration de la première étiquette :
   1. Fixation :
      1. Prenez des cellules vivantes de l’incubateur et retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque. Jetez le milieu de culture cellulaire dans un contenant à déchets biologiques.
      2. Ajoutez assez de PBS pour recouvrir les cellules (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre).
      3. Faites tourner doucement le plat pour laver les cellules avec du PBS, puis retirez le PBS du plat. Jetez le PBS dans un contenant à déchets biologiques.
      4. Ajoutez suffisamment de solution fixative pour recouvrir les cellules (1 mL pour un antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis laissez les cellules fixer pendant 10 minutes.
      5. Pendant que les cellules sont fixées, pesez le borohydrure de sodium pour la solution de trempe et ajoutez-le dans un tube centrifugeuse.
      6. Retirez la solution fixatrice de la plaque et jetez-la dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
   2. Trempe
      1. Ajoutez assez de PBS à la plaque pour couvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker (n’importe quel shaker standard convient) pendant 5 minutes pour laver les cellules.
      2. Retirez la vaisselle du shaker, retirez le PBS et jetez-le dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      3. Ajoutez suffisamment de solution de trempe (250 μL, bol à 8 puits) à la plaque pour recouvrir la surface (1 mL pour une gamelle de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker pendant 7 minutes pour tremper l’autofluorescence dans les cellules.
      4. Pendant que les cellules sont sur le shaker, jetez la solution de trempe restante dans le tube centrifugeuse dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      5. Retirez le plat du shaker, retirez la solution trempante, puis jetez-le dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      6. Ajoutez suffisamment de PBS (250 μL, antenne à 8 puits de plat) à la plaque pour couvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker pendant 5 minutes pour laver les cellules.
      7. Retirez la vaisselle du shaker, retirez le PBS et jetez-le dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      8. Répétez les étapes 1.2.2.6 et 1.2.2.7 deux fois de plus (pour un total de 3 lavages PBS).
   3. Blocage
      1. Ajoutez suffisamment de tampon de blocage à la plaque pour couvrir la surface (250 μL, antenne à 8 puits, 1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame de verre de chambre).
      2. Placez la plaque sur un shaker pendant au moins 1 h pour perméabiliser les membranes cellulaires et bloquer les sites de liaison (occuper les sites non spécifiés, afin qu’ils n’interfèrent pas avec les sites cibles). (Bien que nous ayons testé à plusieurs reprises la durée minimale réussie du blocage à 20 minutes, nous recommandons fortement de bloquer pendant au moins 1 heure ou plus jusqu’à la nuit. Une optimisation peut être nécessaire étant donné la cible et la lignée cellulaire.)
      3. Pendant que les cellules sont sur le shaker, préparez la solution primaire de coloration par anticorps (voir la concentration recommandée sur le site du fournisseur ou voir le tableau dans la section matériaux).
      4. Pour déterminer le volume total de solutions colorantes à produire, ajoutez 0,5 mL au volume nécessaire pour recouvrir les cellules (par exemple, pour un plat de 35 mm, préparer une solution de 1,5 mL).
      5. Retirez le volume déterminé dans la section 1.2.3.1 du tampon de blocage et ajoutez ce volume dans un nouveau tube centrifugeuse pour préparer la solution de coloration.
      6. Ajoutez un volume approprié de stock d’anticorps primaires au tampon de blocage pour obtenir la concentration finale correcte. Les volumes principaux d’anticorps pour plusieurs anticorps fréquemment utilisés se trouvent dans la section matériaux.
      7. Retirez la vaisselle du shaker, retirez le tampon de blocage, puis jetez-la dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
   4. Coloration primaire par anticorps :
      1. Ajoutez suffisamment de solution primaire anticorps pour colorer la plaque pour couvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la platine sur un shaker pendant au moins 1 à 2 heures jusqu’à la nuit pour marquer les cibles cellulaires.
      2. Retirez la plaque du shaker, retirez la solution primaire anticorps et jetez-la dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      3. Ajoutez suffisamment de tampon de lavage à la plaque pour recouvrir la surface (1 mL pour une plaque de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker pendant 5 minutes pour laver les cellules.
      4. Retirez la vaisselle du shaker, retirez le tampon de lavage et jetez-la dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      5. Répétez les étapes 1.2.4.3 et 1.2.4.4 deux fois de plus (pour un total de 3 lavages de tampon de lavage).
      6. Pendant que les cellules sont sur le shaker lors du dernier lavage, préparez une solution secondaire de coloration anticorps (voir la concentration recommandée sur le site du fournisseur ou consulter les expériences précédentes).
      7. Pour déterminer le volume total de solutions colorantes à produire, ajoutez 0,5 mL au volume nécessaire pour recouvrir les cellules (par exemple, pour un plat de 35 mm, préparer une solution de 1,5 mL).
      8. Retirez le volume déterminé à la section 1.2.4.7 du tampon de blocage et ajoutez ce volume à un nouveau tube centrifugeuse pour préparer la solution de coloration.
      9. Ajoutez un volume approprié de stock d’anticorps secondaires au tampon de blocage pour obtenir la concentration finale correcte. Les volumes secondaires de stock d’anticorps pour plusieurs anticorps fréquemment utilisés se trouvent dans le tableau des matériaux.
      10. Enroulez le tube de centrifugeuse avec la solution secondaire de coloration par anticorps dans du papier aluminium jusqu’à ce qu’il soit prêt à être ajouté aux cellules du plat.
   5. Coloration secondaire par anticorps :
      1. Ajoutez suffisamment de solution secondaire anticorps pour colorer la plaque pour recouvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker pendant au moins 40 minutes pour ajouter des fluorophores aux cibles cellulaires marquées.
      2. Assurez-vous que la plaque est recouverte de papier aluminium pour éviter le blanchiment fluorophore.
      3. Retirez la plaque du shaker, retirez la solution secondaire anticorps et jetez-la dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      4. Ajoutez assez de PBS à la plaque pour couvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame en verre de chambre), puis placez la plaque sur un shaker pendant 5 minutes pour laver les cellules.
      5. Retirez la vaisselle du shaker, retirez le PBS et jetez-le dans le contenant de déchets chimiques liquides correctement étiqueté.
      6. Répétez les sections 1.2.5.4 et 1.2.5.5 une fois de plus (pour un total de 2 lavages PBS).
      7. Les cellules peuvent désormais être imagées ou stockées pour imagerie ultérieure. Si vous faites des images immédiatement, suivez les étapes de la section Acquisition. Si vous stockez pour l’imagerie ultérieure, continuez à suivre les étapes ci-dessous.
      8. Ajoutez suffisamment de PBS à la platine pour couvrir la surface (1 mL pour une antenne de 35 mm et 500 μL pour une lame de verre de chambre) avant de stocker.
      9. Enveloppez le plat de parafilm, puis de papier aluminium pour éviter à la fois l’évaporation du liquide et le blanchiment au fluorophore.
      10. Conservez le plat emballé à 4°C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être photographié.
          REMARQUE : Pour les labels utilisés dans ce protocole, les antennes peuvent être stockées pendant 2 à 3 jours avant que la qualité de l’image ne soit significativement affectée ; Cependant, différents anticorps peuvent avoir des stabilités variables mais, avec un stockage approprié, ils restent stables pendant un certain temps après la fin du protocole. Le stockage d’un plat étiqueté plus d’une semaine n’est pas recommandé car la solution fixative n’est pas suffisamment concentrée pour assurer une stabilité à long terme.
3. Processus ultérieur de coloration de l’étiquette :
   1. Blocage :
      1. Référez-vous aux 1.2.3.1 - 1.2.3.2 mais utilisez un tampon de blocage avec le sérum de chèvre. Le temps d’incubation pour le blocage peut être aussi court que 1 heure, mais nous recommandons des temps plus longs avec une limite supérieure de nuit (18-24 h) pour ces marques suivantes afin de réduire la liaison hors cible. Veuillez vous référer aux expériences précédentes.
      2. En attendant, préparez des solutions primaires d’anticorps, au lieu du tampon de blocage, dans un tampon de blocage avec du sérum de chèvre.
   2. Coloration primaire par anticorps :
      1. Préparez le tampon de blocage modifié et le tampon de lavage avec un sérum à chèvre, et le tampon de lavage avec un sérum de chèvre comme détaillé dans la section préparation des tampons.
      2. Voir les sections des étapes 1.2.3-1.2.4 (Blocage et coloration primaire des anticorps) utilisant les tampons modifiés de blocage et de lavage :
         REMARQUE : Le temps d’incubation de l’anticorps primaire peut être aussi court que 1 heure, et aussi long que pendant la nuit (8-24 h). Cependant, les meilleures performances d’étiquetage ont été obtenues grâce à des temps d’incubation plus longs, notamment pour les multi-étiquettes. Les données de ce protocole ont été préparées par étapes d’incubation nocturnes.
      3. Peu avant la fin du temps d’incubation, préparez des solutions secondaires d’anticorps dans le tampon de blocage modifié 1.1.3.
   3. Coloration secondaire par anticorps :
      1. Consultez la section 1.2.5 (Coloration secondaire par anticorps) mais utilisez un tampon bloqueant avec du sérum de chèvre.
         REMARQUE : Veuillez noter que le temps d’incubation peut être aussi court que 1 heure, mais nous avons testé des temps plus longs (2 à 4 heures) avec des performances similaires. Pour les étiquettes suivantes, veuillez répéter la section 1.3.

2. Processus d’acquisition

REMARQUE : Pour l’acquisition de données, utilisez le logiciel Nikon Imaging Software (NIS) Elements compatible avec le microscope utilisé. Tout logiciel capable de contrôler le filtre, le chemin de lumière et les réglages de la caméra convient parfaitement à ce protocole. Le protocole d’imagerie suivant est adapté pour l’illumination par fluorescence interne totale (TIRF) de l’échantillon ; cependant, le protocole d’affichage est compatible avec plusieurs formes d’imagerie. L’imagerie non-TIRF est possible avec ce protocole d’étiquetage pour STORM et est nécessaire pour les applications STORM 3D. Veuillez utiliser un protocole standard pour des méthodologies d’imagerie alternatives.

1. Processus ultérieur de coloration de l’étiquette :
   1. Allumez les composants optiques nécessaires et établissez une connexion avec le logiciel approprié. Dans la plupart des cas, comme dans le NIS, le logiciel ne s’initialise pas complètement à moins que l’ordinateur ne puisse communiquer correctement avec le microscope, la caméra et le contrôle de la scène.
   2. Ouvre le logiciel NIS (ou équivalent).
   3. Configurer la vue en direct : Activez la vue en direct >basculez, gardez l’échelle automatique > dans les paramètres de l’appareil photo, réglez le temps d’exposition à 30 ms.
   4. Configurez le chemin des données pour les acquisitions.
   5. Naviguer jusqu’au panneau supérieur Acquérir> Accéléré rapide > Chemin
   6. Sélectionnez le nom de fichier approprié pour la première acquisition et fixez le nombre de trames à 10 000.
      REMARQUE : Ces mesures sont prises pour limiter le temps d’exposition de l’échantillon à la source lumineuse une fois l’imagerie commencée.
   7. Assurez-vous que l’angle critique et l’angle zéro du TIRF sont prédéfinis avant l’acquisition. Veuillez consulter des sources en ligne sur des tutoriels pour y parvenir. Comme mentionné précédemment, si vous n’utilisez pas l’éclairage TIRF, cette étape peut être sautée.
   8. Sélectionnez le bon chemin de lumière pour la caméra et activez l’option d’illumination Épidélienne sous Lampes (sur NIS ou logiciel équivalent) pour vous assurer que le miroir est configuré pour l’éclairage grand champ à partir d’une source lumineuse non standard laser.
2. Préparation de l’exemple :
   1. Récupérer des échantillons et ajouter un tampon d’imagerie (formulation décrite dans la section 1.1 Préparation du tampon) à l’échantillon. (Selon le tampon d’imagerie utilisé, différentes précautions peuvent être nécessaires. Protégez les échantillons de la lumière.)
   2. Après avoir ajouté de l’huile à l’objectif, placez l’échantillon sur la scène avec un support approprié, activez la mise au point Parfaite , puis mettez la mise au point sur l’échantillon.
3. Étapes d’imagerie :
   1. Trouvez un point laser et naviguez vers un endroit sur la plaque/assiette sans cellules.
   2. Activez l’éclairage TIRF .
   3. Changez le filtre pour qu’il corresponde au filtre approprié afin de faire passer la lumière rouge (ou le laser utilisé pour recueillir les données de cet échantillon spécifique).
      REMARQUE : Utilisez un filtre multi-encoche comme décrit dans le tableau des matériaux. Le filtre multi-encoches n’est pas nécessaire, et les utilisateurs peuvent alternativement imaginer des cubes de filtre non distincts conçus pour les fluorophores utilisés dans leur coloration.
   4. Allumez le laser à la puissance laser la plus faible ~ 1 mW (cela dépend de la source d’éclairage mais cela permet d’éviter un blanchiment accidentel) et réglez l’angle du miroir à l’angle critique.
   5. Si aucune cellule n’est à proximité, augmentez la puissance du laser jusqu’à ce que le point laser soit clairement visible dans la vue en direct.
   6. Utilisez l’outil Région d’Intérêt (ROI), dessinez, réglez et enregistrez le ROI là où se trouve le point laser.
      REMARQUE : Pour les échantillons multi-étiquettes, veuillez vous assurer que les points laser pour toutes les sources lumineuses nécessaires à l’échantillon sont alignés. Dans ce protocole, nous utilisons trois lasers et nous veillons à aligner tous les points. C’est essentiel car la co-enregistrement des données spatiales nécessite un alignement laser.
   7. Revenez à l’illumination Epi et au filtre Bright Field.
   8. À l’aide de l’outil de définition du ROI, naviguez pour trouver une cellule saine appropriée (par exemple, une cellule HCT116 appropriée doit avoir une forme adhésive, polygonale ou ovale avec une frontière cellulaire claire).
   9. Centrez le ROI sur le noyau et cliquez sur OK pour zoomer en position ROI (Effectuez en utilisant l’éclairage en champ clair car la santé de la cellule ne peut pas être déterminée directement à partir d’images fluorescentes large champ du noyau.
   10. Revenez à l’éclairage TIRF en utilisant la même méthode que dans la version 2.3.2.
   11. Sélectionnez le filtre approprié pour la cible étiquetée la plus longue longueur d’onde (dans la plupart des cas, c’est une cible marquée Alexa Fluor 647). Habituellement, la plus longue longueur d’onde choisie en premier pour éviter le photo-blanchiment de l’échantillon avec des longueurs d’onde plus courtes, dans le cas où les cibles marquées auraient des secondaires qui chevauchent les spectres.
   12. À faible puissance laser pour chaque laser nécessaire (dans le cas multi-étiquettes, cela signifierait 3 lasers), allumez le laser et illuminez le noyau pour vous assurer que l’échantillon est correctement aligné.
   13. Utilisez les contrôles TIRF pour vous assurer que l’échantillon est éclairé avec le TIRF.
   14. Sélectionnez la position Z appropriée pour l’acquisition en fonction des besoins. Cependant, cela peut être ajusté juste avant l’acquisition.
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. Cliquez sur Acquérir> Accéléré en accéléré.
   17. Définissez les trames à ≥10 000 et cliquez sur Appliquer pour créer le fichier dans le répertoire spécifié.
   18. Mettez la puissance laser à 50 % et faites un échantillon de javel photo.
   19. Le noyau devrait d’abord blanchir, mais peu après (quelques secondes plus tard), il devrait commencer à cligner.
   20. Revenez à l’angle critique et à la position Z désirés en basculant les positions enregistrées ou en contrôlant manuellement l’angle du miroir et la position Z, et obtenez un accéléré en time-lapse.
   21. S’assurer qu’il n’y a pas de dérive dans l’étage ou qu’il n’y ait pas de co-enregistrement des images multi-canaux qui ne sera pas fait correctement. Utilisez des marqueurs fiduciaires (microperles fluorescentes) ou sauvegardez la position Z au début de l’acquisition pour l’utiliser plus tard pour la correction de dérive en utilisant la méthode de sauvegarde de position pour l’acquisition multipoint dans l’appareil.
   22. Changez le filtre (ou laissez-le si vous utilisez une multi-encoche avec bande passante pour le fluorophore nécessaire) et répétez la section 2.3.17-2.3.20 (Pour les labels suivants, veillez à toujours commencer avec une faible puissance laser, ajustez les paramètres et acquérez).
4. Traitement des données :
   1. Chargez la pile d’images brutes dans FIJI en utilisant le plugin Bio-Formats. Générez une projection à intensité minimale en sélectionnant Image> Stacks> Z Project et en choisissant Min intensity comme type de projection. Soustrayez cette projection minimale de la pile d’images brutes à l’aide de Process > Image Calculator. Sur l’image obtenue, effectuez une soustraction de fond (Processus > soustraction de fond) avec un rayon de boule roulante de 5 pixels.
   2. Définir la région d’intérêt (ROI) pour chaque cellule soit manuellement, soit avec le plugin Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
   3. Effectuer une analyse de localisation sur la pile d’images prétraitées dans le ROI défini en utilisant le plugin ThunderSTORM (Plugins > ThunderSTORM > Run analysis). Utiliser des paramètres appropriés pour une localisation robuste (par exemple, filtre image : B-spline, ordre = 3, échelle = 2 ; seuil d’intensité maximale = 1,5× std (Wave.F1) ; méthode de localisation sub-pixel : Gaussienne, sigma = 2 ; rayon d’ajustement = 4 ; méthode d’ajustement : vraisemblance maximale). Les coordonnées obtenues peuvent être utilisées pour reconstruire l’image en super-résolution.
   4. Pour les expériences multi-canaux, fusionnez les canaux afin de générer une image composite chromatine reconstruite dSTORM (image > Color > Merge Channels).

Results

Images représentatives de chromatine tricolore dSTORM

Le protocole proposé de coloration séquentielle a été testé valable pour diverses lignées cellulaires, notamment BJ fibroblast, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A, etc. La figure 1 montre les images représentatives des cellules BJ fibroblastes, HeLa et MCF10A.

Validation du pipeline d’analyse à l’aide de jeux de données simulés

Le développement d’un protocole d’immunofluorescence à trois couleurs a nécessité la création d’une approche computationnelle spécialisée capable de gérer la complexité des données de SMLM nucléaire multi-cibles (Figure 2A,2 B). Compte tenu de l’environnement dense de chromatine où plusieurs cibles coexistent à proximité, nous avons mis en place un cadre d’analyse en nuage de points qui traite directement les coordonnées de localisation plutôt que les images reconstruites. Cette approche exploite les vastes outils d’analyse de clustering disponibles pour les données de nuage^{de points 40, 41, 42}. Nous avons évalué systématiquement la capacité de la chaîne d’analyse à distinguer des motifs spatiaux biologiquement significatifs à l’aide de jeux de données simulés contrôlés. Quatre types de distribution ont été générés pour représenter des scénarios distincts d’organisation de la chromatine : distribution normale pour les modifications très groupées, distribution uniforme pour les motifs dispersés, distribution toroïdale modélisant les zones d’exclusion, et distribution aléatoire comme contrôle organisationnel (Figure 2C). Ces motifs simulés étaient ancrés à de véritables positions de clusters d’hétérochromatine dérivées de données expérimentales H3K9me3, préservant des contraintes spatiales nucléaires réalistes. Ce cadre d’analyse utilise le clustering DBSCAN (epsilon = 50 nm, points minimums = 3), qui est l’une des nombreuses méthodes d’analyse de grappes dans les données^SMLM 40,41,42. Pour garantir des paramètres de clustering appropriés, nous avons précédemment décrit une méthode d’optimisation adaptée à la détection des domaines d’empaquetement^{de la chromatine 34}. Veuillez noter qu’en utilisant cela comme première étape de l’analyse, les utilisateurs devront optimiser les paramètres informant la sélection à travers la structure, l’environnement et la fonction de leur cible. Ici, les frontières du cluster sont déterminées par des calculs d’enveloppe convexe, éliminant ainsi les hypothèses sur la géométrie des domaines. Notre validation a démontré une discrimination claire entre tous les schémas de distribution simulés grâce à des profils histogrammes de distance distinctifs (Figure 2D). Chaque type d’organisation spatiale produisait des signatures caractéristiques lors de l’analyse des localisations par rapport aux centroïdes hétérochromatine. L’analyse de l’occupation conjointe a été testée à l’aide de simulations à double marqueur avec des relations spatiales contrôlées (Figure 2E). Les marqueurs spatialement séparés (configuration normale-toroïdale) ont donné une densité articulaire minimale comme prévu, ce qui a donné des profils de distribution plats (Figure 2E). Les motifs de marqueurs qui se chevauchent (configuration normale-aléatoire) produisaient une densité des joints décroissante à mesure que la distance augmentait des points de référence, correspondant aux prédictions théoriques. Ces résultats de validation démontrent la capacité de notre cadre à détecter et quantifier les relations de couplage spatial dans des ensembles de données complexes multi-cibles. Pour plus d’informations sur la manière dont ces ensembles de données simulés ont été générés, veuillez consulter la publication^{complète 34}.

Résultats représentatifs de l’analyse de l’organisation de la chromatine

La mise en œuvre de notre approche d’analyse validée dans des échantillons biologiques révèle des schémas caractéristiques d’organisation spatiale réalisables grâce à ce protocole. En utilisant des cellules HeLa traitées avec notre procédure de coloration tricolore pour H3K9me3, H3K27ac et ARN polymérase II, nous démontrons les capacités analytiques rendues possibles par cette méthodologie. L’hétérochromatine H3K9me3 sert de système de référence idéal, compte tenu des preuves établies d’une organisation concentrique de la chromatine à l’échelle de 200 nm issues des études précédentes à super-résolution 23,28,35. L’analyse commence par l’identification par DBSCAN des domaines hétérochromatine, qui sont ensuite catégorisés par rayon effectif : petits domaines (25-40 nm), domaines moyens (40-80 nm) et grands domaines (80-253 nm). Cette stratification de taille explique l’hétérogénéité documentée des dimensions des domaines d’empaquetement de l’ADN, avec des domaines moyens mesurant environ 80 nm dans un rayon²⁵. Les mesures de distance utilisent une fenêtre de recherche de rayon de grappe de 1,5x (Figure 2B ci-dessus) pour capter les signaux proximaux d’euchromatine et de polymérase (Figures 3A,B).

Les résultats représentatifs montrent que H3K27ac et la polymérase à ARN II se localisent de manière constante près des frontières d’hétérochromatine dans toutes les catégories de domaines, en accord avec les études^{antérieures 28,44} et les modèles de localisation de transcription par rapport aux domaines^{de chromatine 23,35,45,46}. L’analyse quantitative de la distance révèle des positions moyennes très proches des périphéries des domaines : les grands domaines montrent H3K27ac à -1,0 nm et la polymérase ARN II à 8,4 nm des frontières, tandis que les domaines plus petits présentent des associations périphériques comparables avec de légères différences de position. Ces mesures indiquent que les éléments actifs de la chromatine se concentrent à l’interface entre les domaines répressif et permissif plutôt que d’être complètement exclus. L’analyse de densité conjointe démontre la capacité du protocole à révéler le couplage spatial entre des cibles co-marquées (Figure 3C-F). L’analyse relative aux domaines hétérochromatine montre une densité articulaire maximale se produisant juste à l’extérieur des limites des domaines (r/r₀> 1), indiquant une co-localisation préférentielle de la polymérase H3K27ac-ARN II dans les régions périphériques (Figure 3G-I). Ces résultats montrent comment cette chaîne de coloration et d’analyse peut aider à étudier des relations spatiales complexes dans des environnements denses.

Figure 1 : Trois images couleur des cellules utilisées. Images en trois couleurs de (A) BJ fibroblaste (B) HeLa et (C) MCF10A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Cadre d’analyse quantitative pour l’organisation spatiale des cibles par rapport aux clusters d’hétérochromatine. (A) Pipeline d’analyse pour les données SMLM multi-canaux utilisées dans cette étude. (B) Schéma des calculs de distance à la périphérie pour les amas d’hétérochromatine identifiés et la méthode de comptage d’affinité conjointe. Les deux méthodes sont utilisées pour déterminer quantitativement l’agencement de deux cibles par rapport à la structure du cluster d’hétérochromatine. (C) Exemples de distributions de diffusion autour de clusters spécifiques d’hétérochromatine utilisés dans une étude³⁴ pour déterminer des organisations biologiques distinctes de structures ciblées (regroupées à l’intérieur d’un domaine vs autour du domaine vs non associées et distribuées aléatoirement). (D) Histogramme distance à la périphérie pour les courbes d’affinité articulées centralement, distribuées aléatoirement et toroïdales, et (E) courbes d’affinité articulaire pour les cas de simulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Relations spatiales quantitatives des marqueurs de transcription autour des domaines histones. (A) Résultats de l’histogramme distance à la périphérie pour des données biologiques exemplaires de cellules HeLa multi-marquées. Pour les domaines petits (< 40 nm), moyens (40-80 nm) et grands (>120 nm) pour les RNAPII et (B) H3K27ac par rapport aux clusters H3K9me3. (C-E) Exemples d’images pour trois images dSTORM d’une cellule HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, avec image en encant et zoomée pour un seul domaine. (F) Ajustement de l’enveloppe convexe (rouge) du domaine illustré en E avec la zone d’analyse en gris. (G) Les graphiques d’affinité pour les RNAPII par rapport à H3K27ac et H3K27ac (H) par rapport aux RNAPII dans l’analyse du ROI pour tous les domaines des données de taille moyenne dans l’ensemble de données. (I) Densité conjointe des RNAPII et H3K27ac dans l’analyse ROI pour tous les domaines de taille moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Ce protocole SMLM à trois couleurs représente une avancée significative dans notre capacité à étudier l’organisation de la chromatine dans un environnement nucléaire dense. L’approche séquentielle de marquage par immunofluorescence, combinée à l’analyse spatiale par nuage ponctuel qui utilise des estimations de localisation comme points comme base de l’analyse, fournit aux chercheurs un outil puissant pour examiner les relations à l’échelle nanométrique entre différentes modifications de la chromatine et des mécanismes de transcription actifs auparavant indétectables par des techniques de microscopie conventionnelles.

La stratégie de coloration séquentielle du protocole répond aux défis fondamentaux inhérents à l’imagerie nucléaire multi-cibles. Contrairement aux structures cytoplasmiques ou associées à la membrane qui sont relativement clairsemées, les cibles de la chromatine nucléaire existent en très haute densité avec des domaines spatiaux qui se chevauchent. Notre approche de blocage modifiée, incorporant le sérum provenant d’une espèce hôte d’anticorps secondaire après chaque cycle de marquage, empêche efficacement la réactivité croisée entre paires d’anticorps tout en maintenant la spécificité de la cible. Les incubations nocturnes à 4°C assurent une pénétration complète des anticorps dans tout le volume nucléaire, essentielle pour atteindre la densité de marquage uniforme nécessaire à l’analyse quantitative SMLM. Ce protocole produit de manière fiable des images avec une résolution de 15-20 nm sur plusieurs lignées cellulaires, ce qui le rend largement applicable aux études d’organisation de la chromatine.

Voici les conseils de dépannage pour la séance d’imagerie. Si les noyaux ne blanchissent pas, la cause la plus probable est une intensité laser insuffisante à l’échantillon, qui peut résulter d’un réglage de faible puissance ou d’un angle TIRF incorrect ; dans ce cas, dépannez en vérifiant l’alignement du laser, en augmentant la puissance du laser et en ajustant soigneusement l’angle du TIRF. Si les clignements dans le noyau sont très rares mais restent constamment brillants, cela indique que les noyaux n’ont pas suffisamment blanchi. Si les clignements sont très clairsemés et que les noyaux ne sont pas visibles du tout, l’explication la plus probable est l’échec de la coloration, et les réactifs et anticorps doivent être vérifiés avant de répéter le protocole. Inversement, si le nombre de clignements nucléaires est très élevé (un résultat souhaitable), un temps de blanchiment plus long est nécessaire avant que des clignements individuels bien séparés puissent être résolus visuellement. Dans les expériences conventionnelles SMLM, la densité de marquage appropriée peut souvent être estimée à l’aide de structures de référence bien définies telles que les microtubules ; Cependant, la chromatine présente une organisation très hétérogène et manque d’une structure de vérité bien définie, ce qui rend cette estimation plus difficile. Sur la base d’optimisation empirique et d’expérience préalable, nous veillons donc à ce que la densité d’affichage effective atteigne environ 100 localisations par μm² afin de permettre une reconstruction robuste des domaines d’emballage de la chromatine. Dans notre protocole, nous n’utilisions aucun marqueur fiduciaire mais recommandons si les utilisateurs en possèdent. Dans nos expériences, les décalages latéraux restent à moins de 0,2 pixel (moins de ~5 nm), ce qui peut être négligé. Par conséquent, nous n’avons pas utilisé de marqueurs fiduciaires.

Le choix de H3K9me3, H3K27ac et ARN polymérase II fournit des informations complémentaires sur l’organisation de la chromatine au niveau nanométrique. H3K9me3 sert de référence spatiale idéale car il forme des clusters discrets et bien définis qui représentent l’hétérochromatine constitutive et peuvent être identifiés de manière fiable grâce à des algorithmes de clustering automatisés. H3K27ac marque la chromatine associée à l’amplificateur qui participe activement à la régulation des gènes, tandis que l’ARN polymérase II indique directement les sites de transcription active. Ensemble, ces trois cibles permettent d’étudier comment la machinerie transcriptionnelle et les modifications régulatrices de la chromatine s’organisent par rapport aux régions hétérochromatiques au sein de l’architecture nucléaire.

Le cadre d’analyse des nuages de points répond aux limites critiques des études précédentes sur l’organisation de la chromatine en permettant une analyse spatiale complète dans des environnements nucléaires denses. Les méthodes traditionnelles de comparaison par paires ne peuvent pas capturer les relations spatiales complexes qui se produisent lorsque plusieurs modifications de la chromatine coexistent dans les mêmes régions nucléaires. Notre approche utilise une analyse de densité conjointe pour révéler où H3K27ac et ARN polymérase II co-localisent par rapport aux clusters H3K9me3, fournissant des informations quantitatives qui ne peuvent être obtenues à partir d’expériences séparées à deux couleurs.

Les résultats représentatifs démontrent systématiquement un modèle organisationnel cohérent plutôt qu’une compartimentalisation stricte de la chromatine. H3K27ac et ARN polymérase II se localisent préférentiellement aux périphéries des groupes d’hétérochromatine sur différentes tailles de domaines, avec des mesures quantitatives montrant un positionnement à moins de 10 nm des frontières des grappes, ce qui soutient les résultats d’autres groupes aux méthodes et modèles de transcription^similaires 23,28,35,45,46 . L’analyse de densité conjointe révèle que la machinerie de transcription active et la chromatine associée aux amplificateurs se couplent le plus fréquemment dans les régions entourant des amas hétérochromes. Ces résultats remettent en question des modèles simples de séparation de phase et soutiennent des principes organisationnels intégrés où différentes modifications de la chromatine maintiennent une proximité spatiale étroite plutôt que de former des compartiments distincts et séparés.

La conception modulaire du protocole permet d’examiner diverses questions de biologie de la chromatine par substitution de cibles tout en maintenant le même cadre analytique. Les études sur le timing de la réplication peuvent remplacer les protéines du cycle cellulaire telles que l’antigène nucléaire des cellules de prolifération (PCNA) et le maintien des mini-chromosomes (MCM), tandis que les investigations sur la réponse aux dommages à l’ADN pourraient cibler le γH2AX et les facteurs de réparation. Les études du cycle cellulaire pourraient examiner les modifications des histones qui changent au cours de la division, et la recherche sur la différenciation pourrait se concentrer sur les marques épigénétiques associées à l’engagement de la lignée. L’approche de marquage séquentiel prend en compte toute combinaison de protéines nucléaires ou de modifications de la chromatine pour lesquelles des anticorps fiables existent, limitée principalement par la compatibilité spectrale et les considérations de réactivité croisée. Cette flexibilité permet aux chercheurs de répondre à des questions fondamentales sur la dynamique de la chromatine lors de divers processus cellulaires tout en maintenant des capacités d’analyse spatiale quantitative.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888 CCD  à multiplication d’électrons ;	Andor	DU-888U3-CSO-#BV  ;	NA
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A7030	Utilisé pour bloquer et laver les tampons. Ne stockez pas de tampon de blocage basé sur BSA pendant plus d’un mois à 4° ; C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Modèle MGL-FN-532 (532 nm) & nbsp ;	PSU-H-LED  ;	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	NA
Boîte laser OBIS cohérente (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) & nbsp ;	Cohérent	1228877  ;	Des lasers collimés avec 3&ndash ; 10 kW/cm³ ; puissance moyenne à l’échantillon, minimum 10 000 trames collectées par canal de longueur d’onde avec  ; 10&ndash ; 30  ; ms  ; acquisition Time & NBSP ;
DABCO (1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octane)	Sigma	D27802	NA
DBPS (1X)	Thermo Fisher	14190-136	NA
Eau distillée	NA	NA	Toute eau distillée est très bien et nbsp ;
DTT (Dithiothréitol), 1M	Sigma	43816	NA
Verre de couverture bien chambré	Cellvis	C8-1.5H-N	Cela peut être n’importe quelle plaque de fond en verre, mais les volumes doivent être ajustés selon le récipient.
Anti-souris de chèvre AF568	Thermo Fisher	A11004	Concentration d’origine : 2 mg/mL Stabilité post-marquage : 2&ndash ; 3 jours
Anti-Lapin de Chèvre AF647	Thermo Fisher	A21245	Concentration d’origine : 2 mg/mL Stabilité post-marquage : 4 et ndash ; 5 jours
Anti-Chèvre A488	Thermo Fisher	A11006	Concentration d’origine : 2 mg/mL Stabilité post-marquage : 2&ndash ; 3 jours
Anticorps primaire H3K27ac	Thermo Fisher	MA5-23516	Concentration en base : 1,0 mg/mL  ;
Anticorps primaire H3K9me3   ;	Abcam	AB1769156	Concentration en bouillon : 1,287 mg/mL  ;
Tube conique poly-propylène haute clarté 15 mL  ;   ;	Corning  ;	352096	Utilisé pour les solutions fixatives et de trempe & nbsp ;
Tube conique polypropylène à haute clarté, 50 mL	Corning	352070	Utilisé pour des stocks de 40 mL de tampons de blocage et de lavage
Acide chlorhydrique (HCl), 12M	Sigma	258148	NA
Nikon Eclipse Ti-E avec système de mise au point parfaite   ;	Nikon	TI-DH 611392 & nbsp ;	Microscope inversé   ;
Nikon SR APO TIRF, grossissement 100x, 1,49 NA  ;	Nikon	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  ;	NA
Sérum de chèvre normal	Abcam	AB7481-1002	Utilisé après la première étiquette terminée. Elles doivent être présentes dans les tampons de blocage et de lavage
Paraformaldéhyde 16 %  ;	Sciences de la microscopie électronique	15710	Utilisé dans une solution fixative qui devrait être consommée dans les deux semaines suivant la fabrication. Protégez-vous de la lumière à 4°rés ; C
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) 10X	Ambion	AM9625	NA
Pointes de pipette 1000 uL	SureOne	02-707-404	N’importe quelle pointe de pipette convient tant que c’est s approprié pour le volume
RNAPII-PS2	Abcam	AB252855	Concentration d’origine : 0,98 mg/mL
Borohydrure de sodium	Thermo Fisher	S678-10	Utilisez du frais pour tremper le tampon à chaque fois.
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Thermo Fisher & nbsp ;	A16037.36	NA
Sulfite de sodium	Sigma	S0505	NA
Triton X-100 10 %	Thermo Fisher & nbsp ;	28314	NA