Method Article

Développement et efficacité des nanoparticules de squalène-chidamide réactives aux enzymes pour le cancer du pancréas

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille la synthèse et la caractérisation des nanoparticules de squalène-chitosane modifiées à l’acide folique, évalue leur libération de médicaments sensibles aux enzymes et leur captation cellulaire in vitro, et les applique pour renforcer la thérapie du cancer du pancréas via une administration ciblée.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour traiter la pénétration intratumorale limitée des médicaments à petites molécules causée par la matrice extracellulaire dense (ECM) de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). Les promédicaments offrent un grand potentiel pour surmonter ce défi en améliorant la pénétration des médicaments et en tuant les tumeurs. Le squalène (SQ), un précurseur naturel de la biosynthèse du cholestérol doté d’excellente biosécurité et biocompatibilité, peut améliorer la compatibilité membranaire des médicaments hydrophiles et renforcer leur absorption cellulaire lorsqu’il est conjugué à des agents chimiothérapeutiques ou à de petites molécules bioactives. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau système prodrug lipophile basé sur le SQ : le médicament anticancéreux hydrophile chidamide (CHI) a été conjugué à SQ via une liaison amide — une liaison réactive à la pancréatine et à la cathepsine B (enzymes clés surexprimées dans le microenvironnement PDAC). Cette conjugaison a donné un prodrog amphihilique SQ-CHI, qui s’auto-assemblait en nanoparticules modifiées en folate (FA) (FA-SQ-CHI NN). Les NP optimisés présentaient un diamètre hydrodynamique uniforme de 173,3 ± 1,5 nm, un indice de polydispersion (PDI) de 0,181 ± 0,18, une capacité de charge de médicaments élevée de 59,0 % ± 0,77 %, et un potentiel zêta stable de -13,10 ± 0,86 mV. Des études de libération in vitro ont montré que les NP atteignaient 80,2 % ± 4,22 % de libération cumulée du médicament en 72 heures en présence de 0,25 % de pancréatine, tandis que seulement 33 % à 38 % de libération a été observée dans des tampons ajustés au pH (pH 4,5 ou 7,4) sans enzymes. Les tests d’absorption cellulaire ont confirmé que la modification de l’AF améliorait significativement l’efficacité de la délivrance intracellulaire, avec une intensité de fluorescence 1,8 à 2,3 fois supérieure dans les cellules PDAC (PSN-1 et CFPAC-1) par rapport aux NP non ciblés entre 12 et 24 heures. Le protocole actuel propose une méthodologie complète pour la synthèse et la caractérisation du prodrug, l’évaluation in vitro des cinétiques de libération enzymatiques réactives, ainsi que des analyses comparatives de l’efficacité thérapeutique et de la pénétration tissulaire, mettant en avant les principaux avantages du nanoporteur en matière de livraison ciblée, de charge élevée de médicament et de libération contrôlée déclenchée par les enzymes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est une tumeur du tube digestif hautement maligne, avec un taux d’incidence presque égal à son taux de mortalité, et un taux de survie sur 5 ans de seulement 8 % à 9 %. Un microenvironnement tumoral complexe (TME) est la caractéristique caractéristique duPDAC 2. Il est principalement composé d’une matrice extracellulaire anormale (ECM), de fibroblastes associés au cancer activés (CAF) et d’un milieu cellulaire profondément immunosuppressif. Le PDAC ECM est riche en collagène de type I. Son contenu modifié et son architecture anormale favorisent la progression tumorale et sont associés à un pronostic3 négatif. Les CAF sont les cellules stromales les plus abondantes et se composent de sous-types fonctionnellement distincts, tels que les myCAF producteurs de matrices et les iCAF inflammatoires, qui présentent une plasticitéphénotypique 4.

Sur le plan immunologique, le TME du PDAC est dominé par des cellules myéloïdes pro-tumorales. Les lymphocytes antitumoraux sont rares ou dysfonctionnels. Les lymphocytes B matures contribuent également àl’immunosuppression 3,4. Ensemble, ces éléments établissent de multiples barrières thérapeutiques. Le stroma dense, caractérisé par une forte pression de liquide interstitiel, crée une barrière de pénétration significative qui entrave gravement l’administration des agents thérapeutiques dans les régions tumorales profondes, limitant ainsi considérablement l’efficacité clinique des médicamentschimiothérapeutiques 5. Par conséquent, il est crucial de développer des systèmes de délivrance de médicaments capables de surmonter cette barrière stromale et de pénétrer profondément dans le tissu tumoral pancréatique.

Ces dernières années, le squalène (SQ), un précurseur naturel de la biosynthèse du cholestérol, a attiré une attention considérable en raison de son excellente biosécurité etbiocompatibilité 6. Étant très hydrophobe, les SQ peuvent être conjugués avec des médicaments hydrophiles pour former des prodrogues amphihiles, améliorant ainsi la biocompatibilité des médicaments hydrophiles à petites molécules avec les membranes cellulaires et améliorant leur efficacité d’absorptioncellulaire 7. Des études antérieures ont démontré que la SQ peut être conjuguée de manière covalente avec divers agents chimiothérapeutiques, tels que le cisplatine, le paclitaxel et la gemcitabine, formant des nanoparticules promédicament avec une grande capacité de charge de médicaments, ce qui améliore l’administration des tumeurs solides 8,9. Ces propriétés soulignent le large potentiel d’application de la SQ dans le développement de systèmes de délivrance de médicaments.

Pour améliorer la ciblage tumoral, cette étude utilise l’acide folique (FA) comme ligand ciblant. L’AF est une vitamine hydrosoluble, cruciale pour le métabolisme à un carbone, la biosynthèse10, l’homéostasie redox11 et les réactions deméthylation 12. La conjugaison de l’A via ses groupes carboxyle au nanoporteur permet la reconnaissance et la liaison spécifiques au récepteur folate (FR), suivies d’une endocytose médiée parle récepteur 13. En tirant parti de l’effet accru de perméabilité et de rétention des cellules tumorales, Zheng et al.14 ont évalué l’expression du récepteur folate α (FRα) dans le cancer du pancréas, le pancréas normal, les tissus adjacents et la pancréatite chronique à l’aide du Western blotting et de l’immunohistochimie, et ont analysé sa corrélation avec les caractéristiques clinicopathologiques. FRα était exprimé dans 94,7 % (72/76) des cas de cancer du pancréas, corrélé à la métastase, mais était absent dans les tissus pancréatiques normaux. Les nanoparticules modifiées par l’AF peuvent s’accumuler sélectivement dans les tissus FR-positifs, permettant une thérapie moléculairamente ciblée.

Le chidamide (CHI) est un nouvel inhibiteur des histones déacétylase. Des études précliniques ont démontré qu’il présente également une puissante activité antitumorale contre les tumeurs solides telles que le cancer du pancréas et du sein, et peut inverser la résistance aux médicaments dans les cellulestumorales 15,16. Cependant, sa forte hydrophilicité est associée à une faible efficacité de pénétration dans le microenvironnement tumoral et à une mauvaise distribution dans les tissus tumoraux solides, ce qui limite fortement son potentiel thérapeutique clinique pour le cancer dupancréas 5. Utilisant le chidamide (CHI) comme médicament modèle, cette étude propose la préparation de nanoparticules auto-assemblées via la conjugaison du CHI avec la SQ et la modification ultérieure par FA. Cette stratégie vise à renforcer l’efficacité antitumorale du CHI contre le cancer du pancréas en surmontant sa mauvaise pénétration dans le microenvironnement tumoral et sa distribution sous-optimale dans le tissu tumoral solide. De plus, en évaluant l’efficacité in vitro du CHI dans les lignées cellulaires du cancer du pancréas, cette approche devrait améliorer de manière significative la pénétration et les effets cytotoxiques du CHI — un médicament hydrophile représentatif à petite molécule — dans le microenvironnement tumoral pancréatique, fournissant ainsi une base expérimentale pour guider la thérapie basée sur le CHI dans le cancer du pancréas.

Notre étude développe les procédures expérimentales de préparation de nanoparticules promédicament auto-assemblées CHI-SQ-PEG-FA pour le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, nous décrivons l’optimisation et la caractérisation du processus de préparation des nanoparticules CHI-SQ-PEG-FA, ainsi que des études de libération in vitro de médicaments. Le processus consiste : d’abord, à optimiser la formulation par une approche expérimentale à facteur unique et à déterminer la taille optimale des particules et la charge en médicament ; deuxièmement, caractériser les nanoparticules à l’aide des tests UPLC et MTS ; et enfin, établir un modèle de sphéroïde tumoral co-cultivé in vitro . En utilisant la coumarine-6 (C6) comme sonde fluorescente dans des nanoparticules ciblées, nous validons davantage la pénétration et la distribution des nanoparticules dans les sphéroïdes tumoraux tridimensionnels et obtenons les données pertinentes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthèse du SQ-CHI et du SQ-PEG-FA

  1. Synthèse du SQ-CHI : Pèser 120,4 mg (0,3 mmol) d’acide 1,1',2-tris-norsqualenoïque et le dissoudre dans 1 mL de N, N-Diméthétylformamide (DMF). Ajoutez successivement le NHS (46 mg, 0,4 mmol) et l’EDCI (72 mg, 0,38 mmol) et laissez la réaction se poursuivre pendant 90 minutes sous protection contre l’azote.
  2. Dissouds le chidamide (58,56 mg, 0,15 mmol) dans 1 mL de DMF et ajoutez-le goutte dans le mélange de réaction. Agiter la réaction à température ambiante sous une atmosphère azotée pendant 72 heures.
  3. Après l’achèvement, évaporez le solvant à pression réduite à 5-15 kPa pour obtenir le produit brut. Purifiez le produit brut par chromatographie en colonne flash en utilisant une élution en dégradé de DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Vérification structurelle du SQ-CHI : placer le produit synthétisé du SQ-CHI dans un flacon en verre et le faire sécher sous vide dans un dessicateur pendant 24 heures. Dissoudez le produit dans environ 1 mL de chloroforme déuteré (CDCl 3) et transférez-le dans un tube d’échantillon RMN. Effectuer une analyse RMN d’uneheure pour confirmer la structure chimique duproduit 17.
  5. Synthèse de SQ-PEG-FA : Dissoudre 41,12 mg d’acide 1,1',2-tris-norsqualenoïque dans 35 μL de DMF. Ajoutez séquentiellement N-hydroxysuccinimide (NHS, 15,71 mg) et 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDCI, 24,59 mg) à cette solution.
  6. Laissez la réaction se poursuivre pendant 90 minutes sous une atmosphère azotée. Dissoudre 20 mg de FA-PEG-NH2 dans 35 μL de DMF et ajoutez-les goutte dans le mélange de réaction.
  7. Remuer le mélange obtenu à température ambiante pendant 72 h sous l’azote. Purifiez le produit brut avec un tube centrifugeuse d’ultrafiltration MWCO de 3 kDa à 5 200 g pendant 30 minutes pour éliminer l’acide libre non réagi. Placez la solution aqueuse complexe SQ-PEG-FA purifiée dans un flacon en verre et précongelez-la à -50 °C. Lyophilisez la solution pré-congelée dans un lyophiliseur pour obtenir le complexe SQ-PEG-FA sous forme de poudre lyophilisée.

2. Vérification structurelle du SQ-PEG-FA

  1. Placez le complexe SQ-PEG-FA lyophilisé dans un tube centrifuge de 2 mL et séchez-le davantage sous vide dans un dessiccateur pendant 24 heures. Dissoudre le produit dans environ 1 mL de diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6) et transférez-le dans un tube d’échantillon RMN. Effectuer une analyse RMN d’uneH pour confirmer la structure chimique du complexe.
  2. Optimisation de la préparation et de la caractérisation des NP SQ-CHI-PEG-FA
  3. Pèser 6,64 mg de SQ-CHI et dissoudre dans 2 mL d’éthanol absolu pour préparer une solution de 3,32 mg/mL (4,3 μM).
  4. Ajouter la solution éthanolique SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 ou 0,05 mL) goutte par goutte à 1 mL d’eau déionisée sous remuage. Remuez pendant 5 minutes, puis retirez l’éthanol par évaporation à pression réduite. Sonicez le mélange obtenu pendant 30 minutes pour obtenir une suspension de nanoparticules CHI-SQ. Mesurez le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersion (PDI) des nanoparticules avec un Zetasizer pour identifier la formulationoptimale 18.
  5. Ajoutez 0,1 mL de solution éthanolique SQ-CHI en goutte à 1 mL d’eau déionisée après différentes durées de brassage (0, 5, 10 ou 20 min). Après la période de brassage correspondante, retirer l’éthanol par évaporation réduisante de pression, suivi d’une sonication pendant 30 minutes pour obtenir des suspensions de nanoparticules CHI-SQ. Mesurez le diamètre hydrodynamique et le PDI pour déterminer le temps optimal de brassage.
  6. Ajouter 0,1 mL de solution éthanolique SQ-CHI en goutte à 1 mL d’eau déionisée sous remuage pendant 5 minutes. Après avoir remoussé, retirez l’éthanol par évaporation réduisant la pression. Sonicez le mélange résultant pendant différentes durées (0, 5, 20 ou 30 minutes) pour obtenir des suspensions nanoparticulaires CHI-SQ. Mesurer le diamètre hydrodynamique et la DPI pour déterminer le temps de sonication optimal.
  7. Confirmez les conditions optimales en vous basant sur les résultats ci-dessus. Ici, le rapport volume obtenu entre l’eau et la solution d’origine = 10:1, le temps de brassage = 5 minutes et le temps de sonication = 30 minutes. Répétez toutes les expériences indépendamment en triple exemplaire pour garantir la fiabilité.
  8. Utilisez la méthode à facteur unique tout en gardant les autres paramètres constants. Séquentiellement varier les facteurs suivants pour évaluer leur impact sur la distribution de la taille des particules et le potentiel zêta des nanoparticules : rapport de masse des composants (SQ-CHI : SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), rapport de phase-volume (phase aqueuse : phase organique = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) et temps de sonication (5, 15, 30, 45 min).
  9. Selon le protocole optimisé, mélangez les solutions d’origine SQ-CHI et SQ-PEG-FA au ratio déterminé. Ajoutez ce mélange goutte à goutte dans de l’eau déionisée sous un brassage constant. Continuez à remuer pendant 5 minutes pour assurer un bon mélange. Retirer l’éthanol par évaporation réduisant la pression, suivi d’une sonde par sonde pendant 30 minutes pour obtenir la suspension finale de nanoparticules CHI-SQ-PEG-FA.
  10. Mesurez le diamètre hydrodynamique, la distribution de taille (PDI) et le potentiel zêta des nanoparticules à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière à l’aide d’un analyseur laser de taille de particules. Observez la morphologie des nanoparticules par microscopie électronique en transmission (TEM, grossissement 150 000x) et microscopie électronique à balayage (SEM, grossissement 80 000x).
  11. Détermination de la charge de médicaments par chromatographie liquide ultra-performance (UPLC)
  12. Définir les conditions chromatographiques comme suit : colonne C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm) ; phase mobile : solution aqueuse acide formique à 0,1 % - acétonitrile (75:25, v/v) ; longueur d’onde de détection : 258 nm ; débit : 0,2 mL/min ; température de colonne : 23 °C ; volume d’injection : 5 μL ; Durée : 10 min.
  13. Reconstituez la suspension CHI-SQ-PEG-FA NP et centrifugez-la à 7 500 x g pendant 30 minutes. Recueillez le surnageant et filtrez-le à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm. Utilisez le filtrat obtenu comme solution test. Injecter et analyser la solution test dans les conditions chromatographiques spécifiées. Calculez la charge de médicaments des nanoparticules en fonction de la concentration mesurée de CHI dans le filtrat.

3. Étude de libération in vitro de médicaments

  1. Pipette avec précision une aliquote de 2 mL d’une solution CHI fraîchement préparée ou de la suspension de nanoparticules CHI-SQ-PEG-FA dans un sac de dialyse avec une coupure moléculaire de 3 kDa.
  2. Immergez le sac de dialyse dans le milieu de libération contenant différentes concentrations de pancréatine (0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,25 %). À des intervalles de temps prédéterminés (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), prélever 1 mL d’échantillons du milieu de libération et les remplacer immédiatement par un volume égal de milieu frais préchauffé pour maintenir les conditions de puits de dossier.
  3. Déterminer la concentration de CHI dans tous les échantillons à l’aide de la méthode UPLC (conditions chromatographiques spécifiées à la section 3) et calculer la libération cumulative du médicament.
  4. Utilisez un tampon d’acétate d’ammonium (pH 4,5) comme milieu de libération. Pipette avec précision 2 mL de la suspension de nanoparticules dans un sac de dialyse (3 kDa). Ajoutez différentes unités d’activité (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) de cathepsine B directement dans la poche de dialyse. Immergez le sac dans 40 mL de milieu de libération et incubez-le dans un shaker à température constante à 37 ± 0,5 °C et 75 tr/min. Aux moments prédéterminés (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), prélever 1 mL d’échantillons et les remplacer immédiatement par un volume égal de milieu frais, préchauffé, au même pH afin de maintenir l’équilibre du système.
  5. Filtrez les échantillons collectés à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm. Analysez les filtrés par UPLC pour déterminer la concentration du médicament. Calculez le pourcentage cumulatif de libération du CHI et tracez les profils de libération du médicament.
  6. Pipettez avec précision une aliquote de 2 mL soit de la solution d’origine CHI, soit de la suspension CHI-SQ-PEG-FA NP dans un sac de dialyse (MWCO de 3 kDa). Immergez le sac de dialyse dans le milieu de libération contenant différentes concentrations de pancréatine (0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,25 %). Aux moments prédéterminés (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 h), prélever 1 mL d’échantillons et les remplacer immédiatement par un volume égal de milieu de libération frais pré-chauffé pour maintenir les conditions de puits de décharge.
  7. Quantifiez la concentration de médicaments dans les échantillons par UPLC. Calculez la libération cumulative du médicament et générez les courbes de libération.
  8. Évaluation de la stabilité des nanoparticules dans le PBS
  9. Mélangez les NP CHI-SQ-PEG-FA avec PBS (pH 7,4) dans un rapport de 1:20 (v/v). Incubez le mélange dans un shaker à température constante à 37 ± 0,5 °C et 100 tr/min. Prélève des échantillons à 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 h pour mesurer le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta.
  10. Essai de prolifération cellulaire par méthode MTS
  11. Les cellules cancéreuses du pancréas PSN-1 ont été cultivées dans un milieu complet RPMI-1640. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été prélevées par digestion avec 0,25 % de trypsine à 37 °C et repoussées à une densité de 4 à 6 x10 4 cellules/mL dans un milieu complet. La suspension a été ensemencée en plaques de 96 puits à 100 μL par puits, puis pré-cultivée pendant 2 heures dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO-2 afin de permettre une adhésion cellulaire complète.
  12. Aspirez le milieu culturel d’origine. Mettre en place un groupe témoin (milieu de culture à blanc) et plusieurs gradients de concentration de groupes chidamides (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), avec trois puits réplicatifs par groupe. Ajoutez 100 μL de milieu blanc ou contenant un médicament à chaque puits, puis transférez la plaque cellulaire dans l’incubateur pour la culture continue. Traiter les groupes expérimentaux avec 100 μL de milieu frais contenant des concentrations variables (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) de SQ-PEG, de CHI LIBRE, CHI-SQ-PEG NPs ou CHI-SQ-PEG-FA NPs, tandis que le groupe témoin reçoit un volume égal de milieu vierge. Après une incubation supplémentaire pendant 96 heures, retirez le milieu contenant le médicament de chaque puits.
  13. Ajoutez 20 μL de solution de travail MTS à chaque puits, suivi d’une incubation pendant 4 heures. Secouez la plaque de 96 puits pendant 15 s pour assurer l’homogénéité, puis mesurez immédiatement l’absorption (valeur A) de chaque puits à une longueur d’onde de 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Calculez le taux de prolifération cellulaire en soustrayant la valeur OD du groupe blanc de la valeur OD du groupe traité par le médicament, en divisant le résultat par la différence entre la valeur OD du groupe du milieu blanc et la valeur OD du groupe blanc, puis en multipliant par 100.
  14. Établissement d’un modèle de sphéroïdes tumoraux co-cultivés in vitro
  15. Mélangez les cellules PSN-1 en phase de croissance logarithmique avec les cellules HPSC à un ratio 2:7 et ensemenzez-les en plaques d’attache ultra-faible à 96 puits à une densité de 5 000 cellules par puits. Après la formation des sphéroïdes tumoraux, traiter les sphéroïdes avec différentes nano-formulations (NPs marqués Coumarine 6 CHI-SQ-PEG/C6 et CHI-SQ-PEG-FA/CN NP) ou DMSO (en témoin) et co-incuber pendant 48, 96 et 144 heures afin d’évaluer l’efficacité du médicament.
  16. Après l’incubation, ajoutez un volume équivalent de réactif de viabilité cellulaire à chaque puits. Placez l’assiette sur un shaker orbital et secouez pendant 15 minutes pour assurer une lyse complète, suivie d’une incubation à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes.
  17. Transférez le lysat cellulaire sur une plaque noire à 96 puits. Mesurez le signal de chimiluminescence à une longueur d’onde de 562 nm à l’aide d’un lecteur multifonction de microplaques pour quantifier la viabilité cellulaire.
  18. Étude de l’absorption cellulaire des nanoparticules
  19. Préparez des nanoparticules ciblées (CHI-SQ-PEG-FA/CN N) et des nanoparticules non ciblées (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) incorporant la coumarine-6 (C6) comme sonde fluorescente. Cultivez régulièrement les cellules PSN-1 en phase de croissance logarithmique pendant 24 heures pour former une monocouche. Dissoudre la coumarine 6 dans l’éthanol pour préparer une solution de fond de 200 μg/mL. Mélangez 10 μL de la solution avec du SQ-CHI et du SQ-PEG-FA (ou SQ-PEG) à un ratio de 1:0,7, puis injectez goutte à goutte dans de l’eau déionisée sous remuage. Remuer pendant 5 minutes, retirer l’éthanol par évaporation, puis sonicer pendant 30 minutes. Enfin, purifiez par ultrafiltration (3 kDa, 12 000 tr/min, 20 min) pour obtenir les articles.
  20. Traiter les cellules comme suit : les groupes expérimentaux reçoivent un milieu sans sérum contenant du C6 libre, du CHI-SQ-PEG/CN NP ou du CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP (avec une concentration finale de CHI de 5 μmol/L et une concentration de C6 de 2,6 μmol/L), tandis que le groupe témoin reçoit un volume égal de milieu vierge.
  21. Après incubation de 4 heures, 12 heures et 24 heures, aspirez le milieu contenant le médicament. Noyaux des cellules de staining utilisant le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)19.
  22. Réaliser des observations au microscope à fluorescence (40x, longueur d’onde d’excitation Ex=360 nm, longueur d’onde d’émission Em=477 nm). Évaluer l’absorption cellulaire des nanoparticules en mesurant l’intensité de fluorescence de la coumarine-6.

4. Analyse statistique

  1. Réalisez toutes les expériences avec au moins 3 réplications pour obtenir les données présentées dans cette étude. Analysez les statistiques à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Présenter les données expérimentales comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (DS), et comparer entre groupes en utilisant le test t de Student, l’ANOVA unidirectionnel ou le test de Wilcoxon lorsque cela est approprié. Fixez le seuil de signification statistique à P < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a conçu avec succès et évalué systématiquement un nouveau système ciblé de délivrance de nanomédicaments — les nanoparticules auto-assemblées à base de prodrogants par la squalénylation de chidamide (CHI-SQ-PEG-FA NP ; Figure 1). Nous avons synthétisé les NP CHI-SQ-PEG-FA (Figure 2) et évalué systématiquement les effets de divers paramètres, notamment le rapport huile/phase eau (Figure 3A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude propose un guide pratique étape par étape pour mettre en œuvre un système à taille basse basé sur l’auto-assemblage des nanoparticules. Les nanoparticules auto-assemblées obtenues dans cette étude présentaient une forme sphérique régulière, une bonne dispersion, une taille de particule uniforme, une grande efficacité de charge et d’encapsulation de médicaments, et démontraient une stabilitésatisfaisante 21. Un modèle de co-culture de sphéroïdes tumorau...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LZ23H290001, LY19H280001) ; des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82474338 et 82274364) ; Programme de collaboration en science et technologie agricoles de la province du Zhejiang (2025SNJF075) ; ainsi que le projet de recherche sur le bien-être public du Grand des sciences et technologies de Huzhou (2021GZ261) ; ainsi que le Projet de Recherche Scientifique Générale du Département provincial de l’Éducation du Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 % de trypsine-EDTAGibco (États-Unis)25200072
1-Hydrhydrate d’éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDCI)Sigma-Aldrich (États-Unis)E6383
Fioles cryogéniques de 2 mLCorning (États-Unis)430488
Plaques de culture cellulaire à 96 puitsCorning (États-Unis)3598
Éthanol absoluChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
AcétoneChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2,5L
acétonitrileTedia (États-Unis)A998-4Qualité HPLC
Acétate d’ammoniumChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
Sulfate de sodium anhydreSigma-Aldrich (États-Unis)31481
Cabinet de sécurité biologiqueThermo Fisher Scientific, États-Unis1380, 1332, 1356
Fioles de culture cellulaireCorning (États-Unis)CLS430372
Incubateur de culture cellulaireThermo Fisher Scientific, États-UnisHERA51901126
chidamide (CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (Chine)pureté >95 %
Lecteur de microplaques multimodes Cytation 5BioTek, États-UnisCYT5MV
Agitateur magnétique thermostatique DF-101SZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., Chine
dichlorométhaneChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich (États-Unis)D2650
dioxaneAladdin (Chine)D116156-5 ml
Médium DMEMGibco (États-Unis)12100046
Solution physiologique tamponnée phosphate de Dulbecco (DPBS)Gibco (États-Unis)14040141
Acétate d’éthyleChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
Éther éthyliqueChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B Balance électroniqueShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChineFA2004B
Sérum bovin fœtal (FBS)Gibco (États-Unis)10099141C
Folate-poly(éthylène glycol)-amine (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Chine)PS2-NFA-2000
Acide formiqueAladdin (Chine)F112034Qualité HPLC
LyophilisateurThermo Fisher Scientific, États-Unis
Cathepsine humaine BSigma-Aldrich (États-Unis)SRP0289
Lignées cellulaires du cancer du pancréas humain (PSN-1, CFPAC-1)la Collection de culture de type américain (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
cellules étoilées du pancréas humain (HPaStec, HPSC)la Collection de culture de type américain (ATCC)
Trypsine humaineSigma-Aldrich (États-Unis)
Acide chlorhydriqueChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
Microscope inverséOlympus, JaponIX83
Médium Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM)Gibco (États-Unis)12440053
IX 1000 mélangeur vortex & nbsp ;Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChineIX 1000
MéthanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
méthanol   ;Tedia (États-Unis)MS1922-001Qualité HPLC
Tubes microcentrifuges (1,5/2,0 mL)Axygen (États-Unis)MCT-150-C
micropipettes (20, 100 et 1000 & mu ; L)Thermo Fisher Scientific, États-Unis4642050, 4642070, 4642090
Système de purification d’eau Mill-Q   ;Millipore, États-UnisZR0Q00800
  ; Kit de test MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfopényl)-2H-tétrazolium)Promega (États-Unis)G3582
N,N-Diméthylformamide (DMF)Aladdin (Chine)
N-bromosuccinimide (NBS)Sigma-Aldrich (États-Unis)B81255
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich (États-Unis)56480
Optima Max ultracentrifuge & nbsp ;Beckman, États-Unis393490
Solution de pénicilline/streptomycineGibco (États-Unis)15140-122
acide périodiqueSigma-Aldrich (États-Unis)P7875
Éther pétrolierChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Phénazine méthosulfate (SPM)Sigma-Aldrich (États-Unis)3180806
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Gibco (États-Unis)70011069
Poly(éthylène glycol)-amine (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Chine)PG2-AM-20k
RPMI-1640 moyenGibco (États-Unis)31800022
Poudre de gel de siliceSigma-Aldrich (États-Unis)53698300 mailles
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich (États-Unis)401676
Chlorure de sodiumChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
dichromate de sodium dihydratéSigma-Aldrich (États-Unis)1.93689
SqualèneSigma-Aldrich (États-Unis)Y0002131
Tubes centrifugeuses stériles (15 et 50 mL)Corning (États-Unis)430791, 430828
Acide sulfuriqueChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TétrahydrofuraneChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4LQualité analytique
tubes centrifuges ultrafiltrants (seuil de masse moléculaire : 3,5 kDa)Beckman, États-Unis344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles