Imagerie spectroscopique à super-résolution des molécules d’ADN utilisant le contraste intrinsèque

Résumé

Ce protocole fournit des opérations détaillées sur la préparation des échantillons, la collecte de données et l’analyse des spectres de fluorescence intrinsèque de l’ADN.

Résumé

L’imagerie à super-résolution a révolutionné la recherche biologique en révélant des détails structurels à l’échelle nanométrique. La plupart des méthodes optiques de super-résolution reposent sur le marquage fluorescent des biomolécules, ce qui permet un marquage spécifique des espèces moléculaires mais peut perturber les fonctions cellulaires, introduire des inexactitudes des molécules liantes, et ne pas fournir la densité de marquage élevée et constante requise pour l’imagerie de la chromatine à l’échelle des molécules d’ADN individuelles. Une technologie permettant l’imagerie génomique in situ, sans marqueur, avec une résolution nanométrique, aurait un impact profond sur la biologie. Ici, nous présentons un protocole qui exploite la fluorescence intrinsèque de l’ADN pour réaliser la microscopie spectroscopique de localisation à molécule unique (sSMLM). Le protocole détaille la préparation des échantillons, l’acquisition des données et l’analyse spectrale. En résumé, un gel d’ADN fin est créé en déposant une solution de polynucléotide sur le verre et en la laissant sécher pendant des heures. Après la formation du gel, l’échantillon est imagé en présence d’un tampon d’imagerie à l’aide de sSMLM. Le jeu de données enregistré comprend une image d’ordre zéro, fournissant des localisations spatiales, et une image du premier ordre, encodant le spectre d’émission de chaque localisation. Les reconstructions spatiales sont générées à partir des données d’ordre zéro, après quoi les spectres correspondants sont extraits du signal du premier ordre. Enfin, nous démontrons la faisabilité de cette approche en utilisant plusieurs longueurs d’onde d’excitation et des molécules d’ADN de longueurs, séquences et compositions variables.

Introduction

Les techniques de microscopie à fluorescence à super-résolution — y compris la microscopie à illumination structurée (SIM), la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) et les approches de microscopie à localisation à molécule unique (SMLM) telles que la microscopie de localisation photoactivée (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) — ont largement dépassé la résolution de la microscopie optique la limite ^{de diffraction} 1,2,3,4.^5,6,7, permettant un accès sans précédent à l’organisation nanoscale de^{la chromatine} 8,9,10,11,12. Cependant, les méthodes actuelles de coloration pour visualiser les structures des acides nucléiques reposent sur le marquage des protéines associées à l’ADN plutôt que sur l’ADN lui-même, ou utilisent des colorants à petites molécules qui peuvent perturber la configuration native de la chromatine et compromettre la viabilité cellulaire^13,14. En raison de ces limitations, le développement de méthodes d’imagerie optique à super-résolution sans marquement dans des conditions natives et non perturbantes est très souhaitable. Le protocole présenté ici est destiné aux nucléotides d’ADN synthétiques purifiés simples brin ou double brin, où la fluorescence intrinsèque peut être détectée de manière fiable ; il n’est pas optimisé pour imager des molécules d’ADN nucléaire en cellules fixes ou vivantes.

Comme les acides nucléiques ont longtemps été considérés comme non fluorescents en raison de leur rendement quantique extrêmement faible (de l’ordre de 10⁻⁴ sous excitation UV) et de leur désintégration de fluorescence ultrarapide à température^{ambiante 15}, les études sur la fluorescence intrinsèque de l’ADN (principalement la durée de vie de fluorescence) étaient rares jusqu’au développement de la spectroscopie femtoseconde. Il est bien reconnu que les nucléotides fluorescissent faiblement sous l’éclairage UV, tandis que leur absorption dans la gamme visible est nettement plus faible. Néanmoins, il a été récemment observé que la fluorescence excitée par la lumière visible des acides nucléiques non modifiés à des concentrations physiologiquement pertinentes existe¹⁶. Ce phénomène avait probablement été négligé car la plupart des études photochimiques sur les nucléotides ont été réalisées en solutions diluées (10-100 μM)17,18,19,20, tandis que dans les noyaux et les chromosomes, les concentrations d’ADN peuvent atteindre 0,1-1 ^M 21,22,23. Plus important encore, la commutation stochastique de fluorescence sous éclairage visible a été^{observée 16}, posant les bases de l’utilisation d’acides nucléiques non modifiés comme agents endogènes de contraste pour la microscopie à super-résolution basée sur la localisation.

Les caractéristiques photochimiques des monomères nucléotidiques et des molécules d’ADN simple brin avec des séquences simples à des concentrations physiologiques sous excitation à la lumière visible ont été^{explorées 24}. Il a également été démontré que ces molécules d’ADN possèdent des propriétés stochastiques de commutation de fluorescence, ce qui s’aligne bien avec la théorie de l’appauvrissement de l’état fondamental (GSD^)6,7 en examinant la récupération par fluorescence des nucléotides dans des conditions de déplétion variables. De plus, comme les nucléotides présentent des rendements quantiques relativement élevés et de faibles probabilités de croisement intersystème, le nombre de photons et la durée de clignement des événements d’émission de molécule unique sont comparables à ceux des colorants exogènes populaires dans STORM (par exemple, Alexa Fluor 647), présentant des spectres^{distincts 25,26} et faisant de l’ADN un agent de contraste intrinsèque idéal pour l’imagerie à haute résolution. De plus, la mise en œuvre de l’algorithme de régression spectrale décrit dans la section précédente permet une imagerie en super-résolution inférieure à dix nanomètres des polynucléotides et des fibres d’ADN linéaires monobrin²⁷.

Pour capturer l’ensemble du spectre de la fluorescence intrinsèque de l’ADN, nous avons utilisé un prisme à double coin (DWP) pour la détection spectrale, qui permet une analyse et imagerie spectroscopiques à haut débit simultanés sur une molécule unique avec des pertes de transmission minimales et une erreur^{de front d’onde} 28,29,30, ainsi qu’un logiciel d’analyse SMLM spectroscopique open source (RainbowSTORM) pour le traitement automatique ^{des données 31,32}. S’appuyant sur cette capacité, nous avons développé une plateforme SMLM multi-laser intégrée à la détection spectroscopique et à un pipeline dédié à l’analyse spectrale. Le protocole que nous présentons ici englobe la préparation des échantillons, l’acquisition de données et l’analyse, offrant un flux de travail reproductible pour exploiter la fluorescence intrinsèque de l’ADN dans la microscopie de localisation à molécule unique. Au-delà de permettre des études de preuve de concept sur l’imagerie d’oligonucléotides simple brin et de molécules d’ADN double brin avec contraste intrinsèque, cette approche a posé les bases d’applications plus larges en imagerie ADN dans des conditions natives sans marqueur, telles que la prédiction de séquences basée sur la fluorescence intrinsèque de l’ADN combinée à des méthodes informatiques.

Protocole

1. Préparation d’échantillons de gel d’ADN (Figure 1A)

1. Dissolvez l’échantillon d’ADN (oligonucléotidiques ou ADN double brin) en poudre dans de l’eau déionisée sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 100 mM et stockez la solution d’origine à -4 °C.
2. Préparez des aliquotes de 5 μL pour minimiser les cycles répétés de gel-dégel. Si vous utilisez des aliquotes congelées, décongelez-les à température ambiante pendant 5 à 15 minutes, selon le volume.
3. Nettoyez doucement une lame en verre avec une lingette de laboratoire. Pipettez 5 μL de la solution moléculaire d’ADN de 100 mM sur la lame de verre fraîchement nettoyée et laissez-la s’évaporer pendant 1 à 3 heures, formant un gel d’ADN.
4. Faites fonctionner cette étape dans une hotte pour des raisons de sécurité. Préparez le tampon d’imagerie selon le tableau des matériaux. Le tampon β-mercaptoéthanol et le tampon DABCO ont tous deux été validés pour supporter le photo-commutation stochastique des molécules d’ADN.
5. Faites fonctionner cette étape dans une hotte pour des raisons de sécurité. Ajoutez 5 μL de tampon d’imagerie au gel ADN et placez une housse de couverture par-dessus immédiatement avant l’imagerie. Il pourrait y avoir des bulles à l’intérieur de l’échantillon couvert. Utilisez une pince à épiler pour enlever les bulles à l’intérieur de l’échantillon couvert,

2. Étalonnage du système sSMLM et acquisition des données (Figure 1B)

1. Préparer un réseau de nanotrous fabriqué avec un diamètre de 100 nm et un espacement de 4 μm, disposé en 8 rangées x 5 colonnes pour l’étalonnage suivant du système spectroscopique^{SMLM 33}.
   REMARQUE : Sinon, le tableau de résolution de 1951 (R3L1S4N) de l’United States Air Force (USAF) peut également être utilisé pour l’étalonnage^{spectrale 33}.
   1. Produire le réseau de nanotrous par sputtering métallique séquentiel et fraisage par faisceau ionique focalisé (FIB). D’abord, déposer un film d’aluminium de 150 nm d’épaisseur sur une gaine de verre borosilicate de 22 x 22 mm en utilisant un sputtering DC à 75 W avec un débit d’argon standard de 20 centimètres cubes par minute (SCCM) à 3 mTorr.
   2. Modelez un réseau de 5 x 8 nanotrous dans la couche d’aluminium à l’aide d’un fraisage FIB fonctionnant à une tension d’accélération de 30 kV.
2. Allumez le système spectroscopique SMLM (Figure 2), insérez des filtres à bande passante étroite (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm et 750 nm) directement devant la caméra, et utilisez une source de lumière blanche (par exemple, la lampe du microscope) pour illuminer l’échantillon d’étalonnage.
3. Collectez 10 images avec chaque filtre. Réglez le temps d’exposition à 532 nm, 580 nm, 633 nm et 680 nm à 200 ms et à 2000 ms pour 750 nm en raison de la faible intensité de la lampe et de la faible efficacité de l’appareil dans la région du proche infrarouge (Figure 3).
4. Chargez l’échantillon de gel d’ADN sur le microscope, assurez-vous que le côté de la couverture est orienté vers l’objectif, et ouvrez le logiciel de la caméra pour l’acquisition des données.
5. Identifiez la position z appropriée à l’aide du système automatique de suivi de la mise au point, en veillant à ce que le clignotement stochastique soit visible clairement. Cette étape est cruciale et demande de la patience, car les échantillons de gel d’ADN manquent d’indices morphologiques évidents tels que la structure cellulaire, ce qui rend difficile la navigation vers un signal approprié.
6. Assurez-vous que l’objectif ne touche pas le bord de la coulisse, car cela pourrait provoquer une fuite de tampon dans l’huile d’immersion et interférer avec le stallage.
7. Acquérir entre 10 000 et 30 000 images avec une puissance d’éclairage typique de 5 kW/cm² et un temps d’exposition de 30 ms. Ajustez le nombre de frames, la puissance d’éclairage et le temps d’exposition selon les besoins. Après l’acquisition, le logiciel sauvegardera les données au format ND2 par défaut.
8. Après avoir terminé l’expérience, jetez la lame en verre dans un récipient approuvé pour déchets tranchants (par exemple, un bac à déchets en verre brisé ou à objets tranchants), et jetez tous les tampons restants dans le contenant désigné pour déchets chimiques liquides conformément aux directives de sécurité institutionnelles.

3. Analyse des données d’étalonnage et de spectroscopie (Figure 1C)

1. Chargez la pile d’images brutes acquises de l’échantillon d’ADN dans FIJI (Windows 64 bits), en utilisant le plugin Bio-Formats.
2. Soustrayez la projection minimale de la pile pour obtenir un ensemble de données soustrait en arrière-plan et le sauvegardez pour l’analyse spectrale. Pour la pile d’images brutes chargées, sélectionnez Image > Piles > Z Project et choisissez Intensité Min dans le type de projection. Ensuite, sélectionnez Processeur > Calculateur d’image pour soustraire la projection minimale de la pile d’images brutes et sauvegardez-la en TIFF.
3. Effectuer l’identification de localisation sur la pile d’images brutes d’ordre zéro à l’aide du plugin ThunderSTORM (version 1.3). Utilisez des paramètres appropriés (par exemple, seuil = 1,2 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, rayon d’ajustement = 3) pour reconstruire l’image d’ordre zéro et extraire les coordonnées de l’événement d’émission (unités : nm). Pour la pile d’images brutes d’ordre zéro recadrées, sélectionnez Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
4. Utilisez FIJI et le logiciel open source RainbowSTORM (lien GitHub dans^{le 32}, avec la version MATLAB plus récente que 2020b) pour traiter les données d’étalonnage afin d’obtenir la relation entre les décalages horizontaux et verticaux et les longueurs^{d’onde 31,32}.
   1. Effectuez l’identification de localisation sur les images de calibration des 5 longueurs d’onde à l’aide du plugin ThunderSTORM. Utilisez des paramètres appropriés (par exemple, seuil = 5 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, rayon d’ajustement = 3) pour reconstituer les localisations des nanotrous à l’ordre zéro et leurs localisations spectrales correspondantes au premier ordre.
   2. Ajustez le seuil (par exemple, dans une plage de 5 à 10 x std (Wave.F1)) jusqu’à obtenir 80 localisations pour chaque image d’étalonnage.
   3. Exécutez RainbowSTORM et cliquez sur Étalonnage spectral > Parcourez et chargez les fichiers CSV pour chaque longueur d’onde d’étalonnage (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) de l’étape précédente. Cliquez sur Enregistrer fichier de calibration.
5. Convertir les coordonnées basées sur le nanomètre en coordonnées de pixels et les mapper à la fenêtre spectrale correspondante en fonction des déplacements horizontaux et verticaux du zéro au premier ordre, déterminés dans l’étalonnage (Figure 4), afin de mesurer l’ensemble du spectre de fluorescence intrinsèque de l’ADN.
   1. Utilisez des scripts Python^{personnalisés 34} (version 3.11.7) pour extraire les données complètes en suivant les étapes suivantes.
   2. Définissez les chemins de fichiers corrects pour la pile d’images soustraite en arrière-plan (.tiff) à partir de l’étape 3.2, le fichier CSV de localisation (.csv) produit à partir de l’étape 3.3, et le fichier d’étalonnage à partir de l’étape 3.4 (.mat).
   3. Utiliser 900-950 pixels comme décalage horizontal pour les données de 488 nm acquises avec le DWP 3D, correspondant à une fenêtre spectrale de 484-588 nm, légèrement plus large que la plage de filtres 500-550 nm pour assurer la couverture.
   4. Utiliser 925-984 pixels comme décalage horizontal pour les données de 532 nm acquises avec le DWP 3D, correspondant à une fenêtre spectrale de 525-750 nm, choisie à nouveau pour être plus large que la plage de filtres 590-650 nm.
   5. Utilisez 23 pixels comme décalage vertical pour les données 488 nm et 532 nm avec le DWP 3D.
      Les valeurs ci-dessus ont été dérivées de la courbe d’étalonnage spectrale obtenue à l’aide de RainbowSTORM. Les scripts Python pour la mesure à spectre complet se trouvent dans³⁴.
6. Linéariser le spectre non linéaire pour une analyse ultérieure (comparaison, classification, etc.) en utilisant un ajustement polynomial d’ordre 3 (Figure 3).

Résultats

Le processus complet — de la préparation de l’échantillon à l’acquisition et à l’analyse des données — pour une pile d’images d’un échantillon d’ADN prend environ 120 minutes, en supposant que la formation du gel d’ADN nécessite 1 h (Figure 1). Le temps combiné de décongélation, de formation du gel et d’étalonnage spectral est fixé à environ 90 minutes, quel que soit le nombre d’images ou d’échantillons dans l’expérience. Pour maximiser l’efficacité, nous recommandons de collecter plusieurs piles d’images sur plusieurs échantillons en une seule session.

Des images représentatives en temps réel obtenues après la DWP sont montrées dans les figures 1B et 3A, où les signaux de fluorescence sont divisés en ordre zéro (à gauche, contenant l’information spatiale) et au premier ordre (à droite, contenant l’information spectrale). Dans la figure 1B, les images ont été acquises en utilisant la configuration DWP 2D, dans laquelle la séparation entre les images zéro et du premier ordre est relativement faible. En revanche, la figure 3A montre les données collectées à l’aide du DWP 3D, où les deux ordres de diffraction sont plus largement séparés en raison de la différence de chemin optique conçue requise pour l’imagerie 3D biplane. Toutes les données présentées dans les figures 1C, 3 et 4 ont été collectées en utilisant la configuration 3D DWP. Le choix entre imagerie 2D et 3D dépend de l’objectif expérimental : pour les mesures spectrales de fluorescence intrinsèque d’échantillons d’ADN synthétisés, la DWP 2D est généralement préférée car ces échantillons ne présentent pas de caractéristiques structurelles tridimensionnelles pertinentes, bien que la configuration DWP 3D puisse également être utilisée lorsque l’information axiale est souhaitée.

Ensemble, ces résultats représentatifs démontrent la capacité principale de la plateforme d’imagerie basée sur le DWP à résoudre simultanément en temps réel les spectres de localisation spatiale et d’émission provenant de molécules d’ADN individuelles. La performance adéquate du système est indiquée par la séparation claire et stable entre l’image spatiale d’ordre zéro et l’image du premier ordre à dispersion spectrale, chaque localisation d’une seule molécule dans l’ordre zéro correspondant à une trace spectrale distincte du premier ordre. L’analyse spectrale quantitative est réalisée en identifiant des événements isolés à molécule unique dans l’image d’ordre zéro, en mesurant le décalage relatif des pixels du signal de premier ordre associé, et en convertissant ce décalage en longueur d’onde à l’aide d’une fonction de cartographie calibrée. Parce que la relation entre le déplacement des pixels et la longueur d’onde d’émission est non linéaire, un ajustement polynomial du troisième ordre est appliqué pour reconstituer avec précision les spectres d’émission linéaires à partir des données^{brutes 28}. Les spectres à molécule unique résultant peuvent être intégrés davantage dans des pipelines d’analyse computationnelle, y compris les modèles d’apprentissage automatique ou d’apprentissage profond, afin de permettre la classification spectrale et l’inférence de la composition des séquences d’ADN ou de la structure moléculaire basée sur des signatures de fluorescence intrinsèques sous différentes conditions d’illumination et états photophysiques.

Toutes les données présentées dans ce protocole ont été collectées à l’aide du tampon d’imagerie à base de β-mercaptoéthanol³⁵. En principe, tout tampon d’imagerie améliorant le comportement de photo-commutation fluorophore devrait être compatible avec cette approche, par exemple le tampon d’imagerie³⁶ basé sur DABCO. Les molécules d’ADN testées incluent des brins simples à 20 bases A, G, C, T ; Chaîne AC simple brin à 40 bases (A₁C₁, A₅C₅, A₁₀C₁₀, A₂₀C₂₀) ; guanine monobrin à 5, 8, 12, 16 bases ; GC et AT double brin à paires de 20 bases (voir Tableau des matériaux pour des informations détaillées). La sélection des constructions d’ADN à 20 et 40 bases repose sur l’observation qu’une chaîne d’ADN à 40 bases adopte une conformation compacte avec une taille effective inférieure à 40 x 3,4 = 13,6 nm, la plaçant en dessous de la limite de résolution de l’image SMLM reconstruite. Les longueurs d’onde d’excitation (488 nm et 532 nm) n’étaient pas optimisées de manière unique pour des séquences spécifiques, mais ont plutôt été sélectionnées pour démontrer que la fluorescence intrinsèque de l’ADN peut être détectée de manière robuste à travers différentes compositions de bases et états conformationnels en utilisant l’une ou l’autre longueur d’onde. Nous avons testé le tampon d’imagerie comme montré dans la Figure 1 supplémentaire et avons constaté qu’aucun signal de clignement stochastique n’a été détecté, excluant ainsi les composants tampons et les traitements de surface vitrée. Seul le gel ADN + le tampon d’imagerie présentait un nombre significatif de clignements. Les lames et les gaines de verre étaient propres et soigneusement manipulées, tandis que le gel échantillon était formé dans un environnement clos. Par conséquent, les signaux détectés sont peu susceptibles de provenir d’impuretés ou d’autofluorescence du substrat. Nous avons également mesuré le signal du gel séchant et de la solution d’ADN, et avons constaté qu’il n’y avait pas de différence significative, donc les artefacts photochimiques lors du séchage ne sont pas la principale source des signaux. Les produits de photodégradation présentent généralement un large spectre et ne possèdent pas de propriétés de clignotement, ce qui n’a jamais été observé dans notre étude. Les limites quantitatives de détection, reflétées par le nombre minimal de photons des localisations, sont de 30 à 50 [nombre de photons]. Cette valeur reste la même pour les échantillons d’ADN et les systèmes marqués, tels que H3K9me3 marqué AF647 dans des cellules fixes. La précision moyenne de localisation de la fluorescence intrinsèque de l’ADN est d’environ 15 à 25 nm, tandis que l’AF647 est d’environ 10 à 15 nm.

Dans le scénario 2D, l’image SMLM reconstruite a une taille de pixel de 22 nm. La précision des localisations des émissions stochastiques est en moyenne de ~20 nm, ce qui décrit l’intervalle de confiance de la localisation de la molécule unique. Cependant, les échantillons testés pour la fluorescence intrinsèque ne possèdent pas de structures biologiques, de sorte que la résolution des structures ne peut pas être interprétée. La microscopie à diffusion Raman cohérente est rapportée avec une résolution de 250 à 300^{nm 37}, et la microscopie UV à deux photons a une résolution de 300^{nm 38}. Le rapport signal/bruit de l’imagerie par diffusion Raman cohérente est de l’ordre de 10 à^{100 39}, tandis qu’il est de 2 à 20 (souvent exprimé comme signal par rapport aux deux écarts-types, SSDR) pour la microscopie UV à 2 photons^40,41. Le SNR pour la fluorescence intrinsèque de l’ADN utilisant sSMLM est d’environ 5 en raison du faible nombre de photons et des limitations imposées par le bruit de détection de la caméra.

Figure 1 : Flux de travail avec durées estimées. (A) La préparation de l’échantillon consiste à décongeler le stock, à préparer le gel d’ADN et à ajouter un tampon d’imagerie. Le temps total varie de 1 à 3 heures selon l’échantillon et l’environnement. (B) Chaque acquisition nécessite un processus d’étalonnage avec un échantillon spécialement conçu pour un réseau de nanotrous. Le temps total d’étalonnage sera d’environ 20 minutes, et le temps d’acquisition des données pour une pile d’images d’environ 10 minutes, y compris la recherche d’échantillons (10 000 images et 50 ms d’exposition). (C) Le pipeline d’analyse implique le prétraitement FIJI et l’analyse spectrale en Python. Le prétraitement aux FIJI prend environ 10 minutes, tandis que l’analyse spectrale est rapide avec les codes établis. Les spectres présentés ont été prélevés à partir de guanine à 16 bases. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Schéma optique. Les quatre lignes laser (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) sont dirigées vers le microscope inversé via un alignement laser, rendant le système stable et facile à utiliser. Le DWP est placé juste avant la caméra sCMOS, permettant la détection spectroscopique d’une seule molécule. Lors de l’étalonnage pour le DWP, une roue de filtres est insérée entre la caméra et le DWP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Calibration spectrale. Les longueurs d’onde d’étalonnage utilisées sont 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm et 750 nm. En plaçant séquentiellement des filtres de bande passante étroite avec ces longueurs d’onde centrales après le DWP et devant la caméra, les décalages horizontaux et verticaux correspondants de différentes longueurs d’onde peuvent être mesurés, permettant de cartographier une courbe d’étalonnage entre la position du pixel et la longueur d’onde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Spectres de molécules d’ADN double brin et simple brin sélectionnées sous excitation de 532 nm et 488 nm, respectivement. (A - B) Les spectres non linéaires et linéaires de GC_alter, qui désignent un type de molécule d’ADN double brin, avec les deux brins sous forme de 20-base 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-3'. Le spectre vert mis en évidence montre la courbe moyenne. (C - D) Les spectres non linéaires et linéaires de A₁₀C₁₀, qui désignent un type de molécule d’ADN simple brin, avec une longueur de 40 bases et 10 adénine et 10 cytosine répétées (5' - AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'). Le spectre bleu surligné montre la courbe moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Expériences témoins pour la fluorescence intrinsèque de l’ADN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, nous présentons pour la première fois un protocole permettant de capturer l’ensemble du spectre de la fluorescence intrinsèque de l’ADN, tant à simple brin qu’à double brin, couvrant le flux de travail de la préparation de l’échantillon à l’acquisition des données et à l’analyse informatique. Ce protocole permet l’imagerie super-résolution sans marqueur des molécules d’ADN en exploitant la fluorescence intrinsèque plutôt que les sondes exogènes. En principe, cette approche pourrait être étendue aux cellules fixes et potentiellement à l’imagerie des cellules vivantes, car elle évite le marquage chimique et l’amplification basée sur les anticorps. La chromatine à l’intérieur du noyau implique l’ADN, l’ARN et différents types de protéines, ce qui constitue un système bien plus complexe que le gel d’ADN. Actuellement, en raison du faible nombre de photons provenant des molécules d’ADN, les émissions stochastiques depuis l’intérieur du noyau dans les cellules fixes/vivantes sont difficiles. Sauf pour les chromosomes isolés, ou noyau, le signal de fluorescence intrinsèque de l’ADN avait été^rapporté 16,24,27. Cependant, sous sa forme actuelle, le protocole est limité aux environnements in vitro utilisant des échantillons d’ADN synthétisés. En comparaison, le marquage de l’ADN ou de la chromatine nucléaire par immunocoloration implique généralement de longues procédures en plusieurs étapes — incluant le trempage, le blocage, ainsi que les incubations primaires et secondaires d’anticorps — qui peuvent durer plusieurs heures (souvent ~5 h par cible^)12,42, introduisant à la fois une complexité expérimentale et des perturbations potentielles à la structure native de la chromatine. En éliminant les marquages exogènes, l’imagerie basée sur la fluorescence intrinsèque réduit non seulement considérablement le temps de préparation de l’échantillon, mais évite aussi les perturbations structurelles et les erreurs de liaison associées aux sondes fluorescentes volumineuses et aux anticorps, permettant ainsi une localisation plus fidèle à l’échelle nanométrique de l’ADN.

Malgré son absence d’étiquette et sa simplicité conceptuelle, la mise en œuvre réussie de ce protocole nécessite une attention particulière à plusieurs détails expérimentaux critiques. Par exemple, lors de la préparation de l’échantillon, un temps insuffisant pour la formation d’un gel d’ADN réduit le nombre de localisations détectables d’une seule molécule par rapport aux gels entièrement formés. En général, il faut environ 1,5 h pour que le gel se forme. Si la solution n’est pas complètement sèche, attendez simplement un peu plus longtemps. Pour un couverdissage de 22 x 22 mm, 5 μL de tampon d’imagerie suffisent, tandis qu’un volume plus important de tampon peut provoquer des fuites, ce qui peut perturber l’interface d’immersion en huile de l’objectif et affecter négativement la performance d’imagerie. En cas de fuite, elle peut être délicatement retirée à l’aide d’une lingette de laboratoire. Pendant la mise au point, augmentez progressivement l’objectif depuis la position z la plus basse. Après que l’objectif s’est engagé dans l’huile d’immersion, utilisez le mode d’ajustement fin pour identifier le plan focal présentant des événements d’émission stochastiques fréquents à une seule molécule. Si de grands amas de gel produisent des signaux agrégés avec des spectres du premier ordre qui se chevauchent, sélectionnez une zone d’imagerie alternative.

Malgré ses avantages, ce protocole présente plusieurs limitations importantes qui doivent être prises en compte lors de l’évaluation de son applicabilité et de ses performances. Premièrement, une extraction spectrale précise repose sur une séparation spatiale suffisante entre les événements individuels de la molécule unique ; Des densités de localisation élevées, telles que celles issues de gros amas de gel d’ADN ou d’assemblages macromoléculaires densément compacts, peuvent conduire à des traces spectrales du premier ordre qui compliquent ou empêchent une reconstruction spectrale fiable. Deuxièmement, la méthode est sensible à l’alignement optique et à la stabilité de la mise au point, car de petits désalignements du prisme à double coin ou des écarts par rapport au plan focal optimal peuvent introduire des erreurs systématiques dans la calibration des longueurs d’onde et réduire le rapport signal/bruit. Troisièmement, le protocole ne met actuellement pas en œuvre le démixage spectral, limitant son utilisation dans des échantillons à forte densité moléculaire ou à multiples espèces qui se chevauchent spectralement. Collectivement, ces facteurs définissent le régime opérationnel pratique de la méthode et doivent être soigneusement pris en compte lors de l’extension du protocole à des systèmes biologiques plus complexes ou surchargés.

Dans ce protocole, RainbowSTORM est utilisé uniquement pour l’étalonnage spectrale, bien que le logiciel fournisse également des outils puissants pour l’étalonnage 2D/3D, l’analyse des données sSMLM et la reconstruction d’images. De tels outils d’analyse sont bien adaptés pour relier les informations de localisation spatiale aux relevés spectrales en imagerie spectroscopique à super-résolution et pourraient être davantage exploités dans de futures extensions de ce protocole. Enfin, ce protocole est potentiellement envisageable pour d’autres types de macromolécules biologiques 43,44,45, telles que l’ARN, la tubuline, etc. Le spectre détecté peut être ensuite intégré dans des modèles informatiques, tels que les modèles^{d’apprentissage profond 46}, pour effectuer la classification, prédisant ainsi la séquence ou la structure moléculaire à partir de spectres intrinsèques sous différentes propriétés d’éclairage ainsi que photophysiques. Cette étude ouvre également la voie à l’imagerie de la chromatine sans marqueur, spécifique aux molécules, qui évite le marquage externe ou la dénaturation des structures natives.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre d’émission 488 nm pour imagerie	Chroma Technology Corp.	ET525/50M
Filtre passe-bande 532 nm pour l’étalonnage	Thorlabs	FL532-3
Filtre d’émission 532 nm pour l’imagerie	Chroma Technology Corp.	ET620/60M
Filtre passe-bande 580 nm pour l’étalonnage	Thorlabs	FB580-10
Filtre passe-bande de 633 nm pour l’étalonnage	Thorlabs	FL632.8-3
Filtre passe-bande 680 nm pour l’étalonnage	Thorlabs	FB680-10
Filtre passe-bande 750 nm pour l’étalonnage	Thorlabs	FB750-10
Bêta-mercaptoéthanol   ;	Sigma	M6250
Tampon d’imagerie BME	NA	NA	7 & mu ; L GLOX, 7 & mu ; L Bêta-mercaptoéthanol et 690 & mu ; Tampon de glucose L
Catalase à partir du foie bovin	Sigma	C100
DABCO (1,4-di-azobicyclo-(2.2.2.)-octane)	Sigma	D27802
Tampon d’imagerie DABCO	NA	NA	65 mM DABCO+30 mM sulfite de sodium + 30 mM DTT 1 M  ; dans l’ADNase, de l’eau déionisée libre d’ARNase. Le sulfite de sodium doit être dissous dans le PBS 10 et fois ; à 1 M avant de créer le tampon d’imagerie.
Deplex de l’ADN pour SMLM spectroscopique	IDT	NA	paire double brin de 20 bases GC_alter, GC_conti, AT_alter et AT_conti. Par exemple GC_alter a les deux brins de 5' - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3' ; GC_conti a une brine de 5' - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3' et l’autre à 5' - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3' Tous les échantillons sont conformes à la norme HPLC.
ADN oligonucléotide/ADN double brin	IDT	NA
Oligos à ADN pour SMLM spectroscopiques	IDT	NA	20 bases de A, G, C, T ; chaîne AC simple à 40 bases (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20) ;   ; Guanine monobrin 5, 8, 12, 16 bases Par exemple A10C10 est 5'- AAAAAAAAAACCCCC CCCCCAAAAAAAAAA AACCCCCCCCCCCC - 3' Tous les échantillons sont conformes à la norme HPLC.
Eau distillée sans DNase/RNase	Invitrogen	10977015
DTT (DL-Dithiothréitol)	Sigma	43816
GLOX	NA	NA	14 mg de glucose oxydase, 50 et mu ; L catalase (17 mg/ml) + 200 et mu ; Tampon L A, qui est de 10 mM Tris (pH 8,0) et 50 mM de NaCl.  ;
Tampon de glucose	NA	NA	50 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl et 10 % de glucose.
Glucose oxydase	sigma	G7141
Glucose, poudre	Thermo Fisher	15023021
PBS (10X)	Thermo Fisher	J62036. K3
PBS (1X)	Gibco	10010023
Chlorure de sodium	Thermo Fisher	424290010
Sulfite de sodium   ;	Sigma	S0505
Tris (1M) pH 8,0	Invitrogen	AM9856