Article de méthode

Procédure d’étanchéité silicone accessible entre la puce et la membrane pour une liaison flexible et fiable

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DOI :

10.3791/69980

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20 mars 2026

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1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

Dans cet article

Résumé

Un protocole de scellement novateur pour produire des joints étanches à base de silicone pour les membranes de dispositifs à puces polydiméthylsiloxane (PDMS). Destiné aux laboratoires, à la mise en place de modèles de puces et au développement de plateformes de puces à petite échelle. Nous démontrons le protocole en utilisant des membranes tissulaires plastiques et natives. Cette procédure ne nécessite que le PDMS, le toluène, le moule, la membrane et une chambre à vide.

Résumé

Les plateformes organ-on-chip sont un aspect en pleine croissance de la recherche biomédicale. L’expansion de ce domaine a permis de produire une gamme de matériaux et de méthodologies différents pour leur construction et leur application. Bien que le nombre de dispositifs différents – fournis commercialement ou développés dans le milieu universitaire – continue d’augmenter, il reste généralement une grande étape à franchir pour les nouveaux chercheurs entrant dans le domaine des organes sur puce. L’un des enjeux centraux des technologies de puces nouvelles et en cours reste de produire un scellement sécurisé et sans fuite des dispositifs à puce. Dans cet article, nous proposons une nouvelle voie pour le développement des puces en présentant un flux de travail de scellement des puces qui permet de créer des connexions fiables et étanches entre les puces en silicone et les trois membranes de culture de différents matériaux. La procédure présentée est accessible pour le développement de nouvelles puces avec des matériaux d’entrée limités et fournit une interface air-liquide (ALI) Organ-on-Chip. Ces puces sont destinées à être alimentées en culture cellulaire à travers une membrane poreuse et exposées apicalement à l’air, comme dans un système digestif, cutané ou, comme présenté ici, Airway-on-chip. Nous proposons deux modèles 3D différents de moules à puces, montrant leur liaison à des membranes plastiques disponibles dans le commerce ainsi qu’à des échafaudages à matrice extracellulaire porcine (ECM). Cette Airway-on-Chip peut être produite en interne ; les différents obstacles rencontrés sont présentés ici, ainsi qu’une présentation de leur utilisation antérieure en tant que voie aérienne sur puce. Cette nouvelle procédure d’étanchéité consiste à aspirer un mortier de polydiméthylsiloxane (PDMS) dilué au toluène pour retirer le toluène qui entraîne une fine couche de silicone solide intégrée dans la surface poreuse du plastique ou de la membrane ECM native. La deuxième nouveauté de cette procédure est le durcissement à température ambiante du mortier PDMS afin d’éviter la perturbation des membranes due à la dilatation thermique différente des matériaux à sceller ensemble. Cela conduit à une technique largement applicable pour lier les matériaux testés, produisant des puces PDMS multi-chambres avec membranes de culture internalisées.

Introduction

Les dispositifs organ-on-chip deviennent une pierre angulaire de la recherche biomédicale, avec une grande variété de modèles commerciaux et en libre accès développés dans des laboratoires du mondeentier. À mesure que ces modèles deviennent une partie clé de la recherche, continuant à remplacer les modèles statiques traditionnels en plastique et animaux 2,3, il est de plus en plus important que ces modèles soient facilement accessibles et accessibles aux chercheurs de divers horizons à travers le monde. Au cœur de cela se trouve l’accessibilité pour un développement personnalisé en petits lots, indépendant des coûts d’intrants etde fabrication 4, en particulier dans les modèles non commerciauxou académiques 1.

L’un des plus grands défis des technologies On-Chip est de produire un scellement sécurisé des puces sans fuites pendant le flux. Une revue récente sur les tests de fuite dans les dispositifs à puce a identifié la fuite entre les chambres ou vers l’environnement comme un mode principal pour les échecs de modèles et expérimentaux, tant dans l’industrie que dans le milieuuniversitaire 5,6. Plusieurs raisons expliquent l’échec à obtenir un joint réussi : les petites dimensions des dispositifs, le débit et la pression appliqués, et principalement le fait que ces dispositifs sont composés de matériaux différents scellés en couches et reliés par différentsprocédés 6. La gamme des différents matériaux utilisés comme membranes de culture sur les plateformes de puces est aussi large que la gamme de leurs applications, incluant le polyéthylène térephtalate (PET), le polycarbonate (PC), le PDMS et les membranesECM 1. En conséquence, il existe de nombreuses procédures et traitements différents pour connecter ces différents matériaux dans les dispositifs finalisés. Ces procédures incluent la compression avec colle/PDMS, la chimie du silane médiée par plasma, la fonctionnalisation chimique des structures, l’électrospinning et la liaison par solvant vaporisé, selon les matériaux impliqués dans le modèle7. Le fait que ces processus nécessitent des compétences et des environnements de laboratoire différents impose certaines limites à l’accessibilité académique de la recherche sur puce. Il a été constaté que, bien que les coûts et les limites liés à l’utilisation de systèmes commerciaux limitent l’accès académique, les longs processus en plusieurs étapes de construction des puces et de l’équipement nécessaire limitent leur développement académiqueindépendant 1,8,9. À la pointe de cette recherche, l’un des enjeux actuels concerne la normalisation et la validation de modèles pour leurreproductibilité 10,11. Mais il subsiste un écart pour atteindre ce point pour de nombreux laboratoires qui cherchent à commencer le développement de puces pour répondre à des questions de recherche spécifiques, remplacer les travaux sur les animaux et travailler sur des modèles plus biologiquementpertinents 12.

Dans cet article, nous présentons un flux de travail de scellement de puces qui ne nécessite que les compétences et équipements disponibles dans la plupart des environnements de recherche. Cette procédure permet d’obtenir des interfaces puce-membrane PDMS étanches pour trois matériaux membranaires différents. Le procédé ne nécessite qu’un temps de travail actif limité, peut être utilisé dans des environnements de laboratoire sans puce, et peut être adapté de la production de puces en petites à moyennes quantités.

La procédure de scellement présentée peut être réalisée avec des membranes plastiques poreuses ou ECM ; Les puces d’exemple fournies sont construites avec cette procédure pour une application en tant que dispositif air-on-chip avec exposition à l’air. Cette procédure peut être utilisée pour d’autres dispositifs comparables, à condition que les membranes contiennent des pores, essentiels à la procédure. L’application principale des puces fournies est pour la culture ALI et les cellules épithéliales des voies respiratoires, mais peuvent être utilisées pour d’autres applications et des modèles de co-culture avec des cellules mésenchymateuses ou intestinales, par exemple 8,13. La première puce fournie est une voie respiratoire standard sur puce avec une grande zone de culture (92mm 2) avec deux chambres de culture, incluant une chambre apicale pour l’exposition à l’air séparée par une membrane poreuse de la chambre basale contenant un milieu et, éventuellement, un autre type de cellule cultivée submergée (par exemple, fibroblastes, cellules endothéliales). Pour les applications ALI, il est essentiel que les cellules à semence apicale soient capables de maintenir une barrière hermétique pour éviter la fuite de milieux dans le canal supérieur. La seconde puce présente le même design que la première, avec deux chambres supplémentaires de chaque côté de la membrane, ici avec l’utilisation d’un ECM porcin, pour faciliter l’étirement de la membrane de culture par l’application de pression négative, imitant l’étirement d’une voie respiratoire native.

Notre processus de scellement réunit plusieurs éléments du domaine du développement de puces PDMS avec l’ajout de nouvelles conditions, qui sont doubles. Premièrement, l’application rapide du vide sur le mortier PDMS dilué au toluène, qui empêche l’attaque chimique du toluène sur les membranes, favorise l’intrusion du silicone dans les pores ou les surfaces de la membrane, et conduit à une surface fine et résistante au déplacement. Le toluène produit un gonflement et une déformation en surfaces solides de PDMS, mais à fortes concentrations agit comme solvant, d’où son utilisation pour diluer les PDMS liquides dans cette procédure. Pour les plastiques tels que les membranes PC et PET utilisées ici, le toluène provoquera des déformations et des fissures de contrainte s’il n’est pas rapidement retiré. Il est essentiel de faire attention, lors de l’application manuelle du mortier, de ne l’appliquer que sur la paroi de la moitié de puce préconstruite et de ne jamais en mettre dans la zone de culture, car cela bloquera les pores des membranes de culture et produira des zones de PDMS qui perturberont et varieront la capacité de culture cellulaire. Deuxièmement, le durcissement du mortier PDMS à température ambiante (RT) sur 72 h empêche le déplacement de la membrane par rapport à la moitié de la puce ainsi que par le mortier, ce qui peut se produire lorsque les matériaux se rétractent à différents degrés après dilatation thermique.

Nous proposons deux modèles de moule à puces pouvant être réalisés avec une imprimante 3D ou une microfraiseuse (comme décrit dans le Fichier Supplémentaire 1, Fichier Supplémentaire 2), ainsi que la méthode pour créer un mortier fin à partir de PDMS et de toluène14. Cette méthode permet de sceller les membranes plastiques commerciales (PET, PC) à l’intérieur d’un dispositif. De plus, nous avons testé l’étendue de l’applicabilité de ce procédé en créant la même puce avec une membrane ECM native porcine pour produire une puce biologique capable d’étirement cyclic. Comme les organes-on-puce sont conçus pour reproduire les propriétés physiologiques de l’environnement in vivo , les voies respiratoires sur puce qui ont la capacité de produire les forces mécaniques ressenties dans le corps lors de la respiration, telles que les contraintes de cisaillement causées par l’air écoulé et le paysage mécanique des voies respiratoires constrictes, sont hautement pertinents sur le planbiologique 16. La membrane utilisée se compose de la membrane basale, de la lamina propria, ainsi que du collagène, de la laminine et d’autres protéines de la matrice environnante. À notre connaissance, il s’agit de la première puce native à membrane de soclement, et la première à pouvoir s’étirer, facilitant ainsi l’imitation de la contrainte mécanique par exemple de la respiration, sur une membraneECM 15 non siliconée. Cette application novatrice met en lumière la fonction de notre procédure de scellement avec du plastique et de l’ECM. Enfin, nous présentons l’application de cette procédure de scellement par puce et membrane sous forme de voie aérienne sur puce pouvant être utilisée pour la culture cellulaireALI 8.

Protocole

Cette étude était exemptée de l’approbation du comité d’éthique en vertu de la loi sur les expériences sur les animaux, car les matériaux provenaient de l’autopsie et aucun animal n’avait été sacrifié à des fins scientifiques (Wet op de dierproeven). Le protocole d’isolement des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires humaines a été établi selon le code de recherche du Centre médical universitaire de Groningue (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg consulté le 14 janvier 2025) et les directives nationales et éthiques professionnelles sur l’utilisation du matériel corporel humain (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf consulté le 14 janvier 2025). Cette étude était exemptée de l’exigence d’approbation du comité d’éthique car le tissu trachéobronchial était résiduel des greffes et entièrement anonymisé conformément au Code civil néerlandais et à la Wet op de orgaandonatie (loi sur les donneurs).

1. Préparation de la moitié de puce et de la membrane

  1. Production de puces
    1. Télécharger. Fichiers de conception STL pour les moitiés supérieure et inférieure de la puce issus des fichiers supplémentaires 1 et 2 de cet article. Le moule supérieur produit une moitié à copeaux de 5 mm de profondeur, le moule inférieur une moitié à copeaux de 3 mm ; Les deux moitiés de puces possèdent des chambres de culture de 1 mm de profondeur. Sinon, il faut produire une conception de puce en utilisant un logiciel de CAO approprié.
    2. Préparez soit un fichier tranchant pour l’impression 3D, soit un chemin de fraisage pour le microfraisage des moules à puces. Les moules micro-fraisés seront prêts à être utilisés ; Les moules imprimés en résine nécessitent deux lavages à l’éthanol 99,9 % de 24 heures avant la réticulation UV pour être préparés correctement à une utilisation comme moule PDMS.
  2. Production de demi-puce PDMS (Figure 1)
    1. Mélangez soigneusement la base liquide PDMS avec l’agent de durcissement dans un ratio 10:1 et dégazez dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées.
    2. Remplissez les moules avec une large seringue à buse, dégazez pendant ~10 minutes dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées. Placez les moisissures dans un four sec jusqu’à ce qu’elles soient durcies pendant 2 h à 65 °C.
    3. Retirez les moitiés solides des moules avec un scalpel et coupez le solin sur les bords. Ajoutez quatre entrées dans la moitié supérieure à chaque extrémité de la chambre et les deux anneaux adjacents indiquant l’emplacement des entrées de la chambre inférieure avec une biopsie.
      REMARQUE : Pour les résultats présentés, une perforatrice de biopsie de 2 mm a été utilisée, et un tube en silicone de 2 mm a été inséré pour le milieu et l’air pendant la culture. Les entrées de 1 mm et 2 mm facilitent l’ensemencement des cellules avec une pipette, correspondant respectivement à la taille des pointes de 200 et 1000 μm. D’autres tailles de poinçons peuvent être utilisées pour différents systèmes de tubes ou de pompes.
  3. Préparation de la membrane (Figure 2)
    1. Télécharger. Fichiers de conception STL pour le pochoir à membrane issus du Fichier Supplémentaire 3 dans cet article. Préparez le pochoir par impression 3D ou une méthode de fabrication équivalente afin d’assurer une forme de membrane cohérente.
    2. Placez le pochoir sur la membrane PET ou PC, en la tenant fermement pendant que la membrane est découpée avec un scalpel.
      REMARQUE : À ce stade, les membranes peuvent être recouvertes de protéines matricielles pour la culture cellulaire dans une boîte de Petri sans perturber la liaison membranaire. Cela garantira que seule la membrane est fonctionnalisée pour la croissance cellulaire, laissant les parois du PDMS libres de cellules comme décrit précédemment8.

2. Liaison membranaire

  1. Préparation du mortier PDMS
    1. Mélangez le PDMS liquide (étape 1.2.1) avec du toluène dans un ratio 7:5 et mélangez soigneusement en faisant une seringue à buse large comme décritprécédemment 14. Seules 8 gouttes sont nécessaires pour chaque puce ; 1,4 mL de PDMS avec 1 mL de toluène est recommandé par lot de mortier, suffisant pour 8 puces de cette échelle. Un mélange régulier du mortier est important pour une liaison par membrane fiable.
      ATTENTION : Le toluène est volatil et hautement inflammable. L’exposition peut endommager les systèmes nerveux et respiratoire. Utilisez exclusivement dans une hotte à fumée, loin de toute source d’allumage, et gérez les déversements avec des matériaux absorbants et une ventilation. Lors de la manipulation, portez des lunettes de protection pour éviter les éclaboussures et des gants imperméables (nitrile). Laissez tous les matériaux de laboratoire (pointes de pipette, contenants, etc.) dans la hotte à fumée pendant 24 heures, après quoi le toluène aura évaporé, et tous les matériaux pourront être éliminés dans des contenants homologués et étiquetés via des services spécialisés en gestion des déchets. Ne jetez jamais le toluène dans un évier. Consultez la fiche de données de sécurité (SDS) pour plus d’informations.
      REMARQUE : Préparez le mortier au point d’utilisation pour éviter l’évaporation prématurée du toluène et la contamination plastique, dans un contenant non en verre, de préférence jetable, et jetez-le directement après utilisation. Le PDMS durcira la surface du verre et sera partiellement inamovible ; Le toluène va se dissoudre et endommager la plupart des plastiques couramment utilisés en laboratoire.
  2. Fixation de membrane PET/PC (Figure 2)
    1. Appliquez rapidement le mortier à la surface de la moitié de puce PDMS où la membrane sera placée avec une pointe de pipette.
      REMARQUE : Toute la zone sous la membrane doit être humidifiée avec du mortier. Une prise ferme doit être appliquée avec la pointe pour obtenir la couche la plus fine possible. La microscopie indique que les couches se situent entre 3 et 5 μm.
    2. Maintenez la membrane préparée (étape 1.3) à une extrémité avec une paire de pinces propre, placez la pointe sur le mortier humide à la bonne position pour le puceau, puis laissez la membrane s’ajuster.
      REMARQUE : Ne laissez pas la membrane se déplacer après ce point ; Un PDMS humide entrant dans la chambre produira des parois irrégulières et inutilisables sur la membrane. Si un déplacement survient, le silicone recouvrira la zone de culture, ce qui perturbera le potentiel de culture cellulaire de chaque côté de la membrane, éliminera la membrane, puis répétera l’étape précédente.
    3. Maintenez doucement la membrane en place avec la pince et réappliquez le mortier PDMS au-dessus de la membrane, en s’éloignant doucement de la chambre à chaque coup pour éliminer les bulles et fixer la membrane sans la déplacer de sa position initiale.
      REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer le PDMS dans la zone interne de la membrane ; C’est essentiel car le silicone empêche l’adhérence cellulaire et perturbe la surface naturelle de la membrane de culture.
    4. Placez immédiatement les moitiés de puces avec membranes après l’attache du mortier humide dans une chambre à vide et durcissez-les à température ambiante sous 25 mBar sous vide pendant 72 heures.
      REMARQUE : Les moitiés de puce avec membranes attachées doivent être durcies à température ambiante. Le PET/PC et le PDMS subissent différents degrés de dilatation thermique, et le durcissement thermique provoque une dilatation puis un rétracte du silicone en refroidissant, produisant une membrane distendue (Figure 3).
  3. Construction complète de puces
    1. Les moitiés de puce à membrane peuvent désormais être fixées à la seconde moitié de la puce. Pour des résultats les plus constants, exposez les deux moitiés au traitement au plasmaO2 (320 mBar, 30 s) et pressez-les rapidement ensemble à la main sous une légère pression.
      ATTENTION : Les fours à plasma à oxygène produisent des environnements saturés en oxygène, des oxydes dangereux comme l’ozone et des rayons UV intenses. Les fours doivent être installés dans un espace bien ventilé ou une hotte à fumées. La fenêtre du four devrait bloquer tous les rayons UV, mais il est conseillé de porter des lunettes de protection. Les matériaux combustibles et les métaux doivent être tenus hors de la zone du plasma d’oxygène afin d’éviter une combustion accélérée ou la libération de fumées toxiques. Se référer au document de la SDS du plasma d’oxygène est essentiel pour une utilisation avec tout matériau autre que ceux mentionnés dans ce protocole.
      REMARQUE : Si aucun four plasma n’est disponible, une liaison similaire peut être obtenue avec une baguette plasma ou en appliquant un mortier PDMS sur la seconde moitié et en durcissant les moitiés ensemble à température ambiante sous légère compression pendant 72 h13. Bien que moins efficaces comparées à un four plasmaO2 complet, ces options peuvent être utilisées lorsque les fours ne sont pas disponibles.

Résultats

Test d’intégrité du joint de membrane
Pour tester l’intégrité de la copey scellée, la chambre de culture supérieure est remplie de demi-eau avec un colorant bleu, et le fond de demi-eau pure. Des copeaux sont laissés toute la nuit pour évaluer une éventuelle fuite de colorant bleu de la chambre supérieure autour de la membrane vers la chambre inférieure.

Les copeaux de silicone entièrement construits, préparés avec notre méthode, peuvent être déformés dans le sens de la longueur jusqu’à 35° sans perturber l’intégrité de la membrane, désormais enfermés et liés à la moitié supérieure avec un mortier PDMS flexible de chaque côté. La déformation des puces PDMS est une partie normale de l’utilisation, par exemple, lorsque les moitiés ou les puces collent à une boîte de Petri.

Les puces étaient connectées à un système de pompe à seringue bidirectionnelle pour tester leurs performances à la pression induite par le flux. Les puces avec membranes PET et PC peuvent être utilisées sans fuite entre chambres ni rupture des puces jusqu’à 30 kPa (pression maximale fournie par les pompes). Dans des études antérieures, les puces sont normalement alimentées à 150 μL/h, ce qui exerce une pression de 0,7 Pa sur les chambres de chaquedispositif 8.

Visualisation de la liaison membranaire
Pour visualiser l’intrusion du mortier liquide PDMS dans les pores de 0,4 μm de la membrane sous le microscope grâce au vide RT, le mortier PDMS a été teint avec du Nile Red. Nile Red a été choisi car il s’agit d’un colorant hydrophobe qui se mélange bien au PDMS sous forme liquide. La coloration a été préparée en mélangeant soigneusement 1 % de Rouge du Nil dans du PDMS liquide afin de produire une couleur rouge sous microscopie optique. La procédure de durcissement RT a été répétée comme décrit ci-dessus. Des membranes avec mortier teint étaient intégrées dans la paraffine et sectionnées à l’aide d’un microtome. Les tranches membranaires étaient montées sur des lames en verre et imagées à l’aide d’un microscope optique (Figure 4). Pour valider la nécessité à la fois d’amincir le PDMS en mortier avec du toluène et d’appliquer un vide pour l’intrusion du PDMS dans les pores membranaires, une comparaison des membranes avec et sans ces méthodes peut être vue dans la Figure Supplémentaire 3.

Test de viabilité cellulaire
Dans une étude précédente, la toxicité chimique potentielle due à l’utilisation du toluène dans la fabrication de ces dispositifs a été testée. Les puces ont été préparées avec et sans toluène dans un mortier PDMS, des cellules épithéliales de Calu-3 adénocarcinomes pulmonaires humains ont été cultivées jusqu’à la confluence en 2 jours, puis cultivées pendant 1 jour dans les puces comme décrit précédemment8. La mort cellulaire a été évaluée par coloration bleue par Trypan, en retirant toutes les cellules de l’appareil, et en comptant les cellules mortes (bleues) contre les cellules viables non colorées. La prolifération a été évaluée en incubant les réactifs dans le milieu de puce avant de réaliser un test AlamarBlue, en évaluant l’absorption fluorescente via un lecteur de plaques, qui reflète la prolifération (Figure 5)8.

Fixation de membrane de socle ECM
Pour démontrer l’applicabilité générale de cette procédure à la production de liaisons fortes et flexibles avec une gamme de membranes, le protocole a été répété avec une membrane entièrement basée sur une matrice extracellulaire (ECM) (Figure 6). Une membrane basale contenant des échafaudages ECM a été préparée à partir de vessies urinaires porcines comme décrit précédemment17. En résumé, des vessies urinaires porcines provenant de femelles âgées de 4 à 8 mois ont été prélevées dans un abattoir local (Kroon Vlees b.v., Groningue, Pays-Bas) et traitées dans les 3 heures suivant la collecte. Le tissu conjonctif et la graisse ont été retirés de la vessie, la vessie a été retournée à l’envers, et la couche épithéliale a été disséquée de façon obtuse, tout en maintenant le tissu dans le PBS à température ambiante. Les échafaudages ECM ont été déshydratés pour la procédure d’attachemembranaire 17. Les échafaudages préparés étaient découpés et liés aux moitiés de puce PDMS comme décrit dans le protocole ci-dessus. Un nouveau moule a été produit avec des chambres supplémentaires pour l’étirement de la membrane à l’intérieur de l’appareil afin de montrer que les liaisons en silicone sous vide peuvent également supporter une contrainte mécanique horizontale (Fichier supplémentaire 2).

Test d’intégrité membranaire ECM
Le test d’intégrité du joint de membrane a été réalisé comme indiqué ci-dessus. Ensuite, la puce d’étirement était fixée à des pompes à seringue, qui aspiraient un vide sur les chambres latérales de l’appareil pour produire 1 mm d’étirement horizontal sur la membrane ECM pendant la nuit (Figure 7).

Différenciation des cellules épithéliales et co-culture de fibroblastes dans la voie aérienne standard sur puce avec membrane PET
Pour valider la performance de la puce fournie en tant que voie respiratoire sur puce pour les cellules ALI, des cellules épithéliales de Calu-3 (ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées jusqu’à la confluence et exposées à l’air dans le dispositif, dans une étudeprécédente 8. Après 10 jours d’exposition à l’air apical, on peut observer que les cellules épithéliales de Calu-3 se différencient en cellules productrices de mucus, comme le démontre la production de mucus, mesurée par la coloration au bleu d’Alcien (Figure 8)8.

Pour valider notre procédure de co-culture prolongée sans fuite, un exemple peut être consulté dans une publication précédente ; Pour la méthodologie complète de la culture cellulaire, voir cet article8. Les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines ont été cultivées dans la chambre de culture apicale de la puce sous un flux d’air constant pendant 21 jours, avec des fibroblastes primaires des voies respiratoires cultivées à l’envers de l’autre côté de la membrane. En résumé, les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires ont été isolées par traitement par protéase (0,2 mg/mL en HBSS, 2 heures, 37 °C), un grattage cellulaire et une cryopréservation de cellules prélevées dans le tissu trachéobronchique résiduel de 3 donneurs pulmonaires sains, dont aucune information supplémentaire n’était disponible. Les fibroblastes des voies respiratoires (FA) humains ont été isolés de la même manière à partir du tissu bronchique du tissu pulmonaire transplanté pour la BPCO d’un seul donneur.

À la Figure 9, on peut voir un graphique de la puce et de la façon dont les cellules mentionnées ci-dessus apparaissent à travers et le long des chambres de l’appareil.

Culture de cellules épithéliales en co-culture avec des fibroblastes sur la membrane ECM
L’échafaudage contenant la membrane basale facilite la culture cellulaire épithéliale et mésenchymateuse. Les kératinocytes humains immortalisés (cellules HaCaT) ont été ensemencés à une densité de 60 x 103 cellules/cm2 sur le côté épithélial (interne) de la membrane, et leur viabilité était de 95 % après 24 heures contre 91 % dans un flasque de culture cellulaire en plastique (Figure 10A). Ensuite, des fibroblastes MRC-5 pulmonaires humains normaux ont été ensemencés à une densité de 60 x 103 cellules/cm2 sur le côté stromal (externe) et cultivés en coculture avec les cellules HaCat pendant 14 jours afin d’évaluer la viabilité épithéliale-mésenchymatose à long terme pour la co-culture sur la membrane native de la MEE (Figure 10D). Les cellules épithéliales formaient une monocouche confluente sur la face interne de la membrane, tandis que les fibroblastes se répartissaient moins densément sur la surface externe de la membrane ECM mais conservaient leur morphologie caractéristique en forme de fuseau (Figure 10C). La vidéo de reconstruction 3D peut être vue dans le fichier supplémentaire 417.

L’étude actuelle présente une procédure améliorée de scellement de membrane qui permet de créer une solide connexion membranaire PDMS, capable de résister aux perturbations causées par la manipulation manuelle de la puce, et de permettre une culture à long terme sous flux en utilisant des pressions allant jusqu’à 0,7 Pa. Nous avons montré que ces membranes sont liées par du silicone qui a pénétré les membranes de culture par leurs pores, facilitant ainsi les liaisons covalentes de silane entre les deux moitiés de puces et le mortier PDMS sous vide. De plus, la procédure présentée n’induit pas de cytotoxicité, à condition que le mortier soit appliqué correctement. De plus, les puces produites ont facilité des co-cultures épithéliales mono- et mésenchymatoreuses épithéliales à long terme. Bien que cette procédure ne s’applique qu’aux membranes poreuses, elle reste une procédure à faible consommation d’entrée pour la production de puces ALI fiables et prêtes à la culture cellulaire.

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Figure 1. Graphismes de la production des demi-puces PDMS et de la préparation de membrane. Pour la production en demi-puce PDMS (étape 1.2), les moules à puces sont remplis de PDMS liquide avec une seringue à buse large, 4,4 mL dans le moule supérieur et 2,4 mL dans le moule inférieur. Les moitiés PDMS sont durcies pendant 2 heures à 65 °C, après quoi 4 entrées dans la moitié supérieure de la puce sont perforées aux extrémités de la chambre et aux pointes indiquées dans le moule. Pour la préparation de la membrane (étape 1.3), le pochoir de membrane imprimé est maintenu fermement à la surface de la membrane. À l’aide d’une nouvelle lame, on coupe autour du pochoir et on retire la membrane de copeaux du matériau environnant. Les membranes peuvent être recouvertes pour la culture cellulaire ou utilisées directement à l’étape 2. Créé dans BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2. Procédure de liaison membranaire. Le mortier PDMS est mélangé comme décrit ci-dessus immédiatement avant utilisation. Le mortier est goutté sur les quatre coins autour de la chambre de culture et s’étale doucement autour de l’endroit de liaison de membrane avec l’extrémité inclinée d’une pipette. Une extrémité de la membrane est placée sur le mortier, puis, une fois alignée avec la chambre de culture, elle est délicatement laissée en place. Le mortier est réappliqué goutte-à-goutte et peint sur les bords de la membrane avec un grand soin pour éviter qu’aucun silicone ne touche la surface de la membrane à l’intérieur de la zone de culture. Les membranes liées à la moitié de la puce sont immédiatement placées dans une chambre à vide pour éliminer les microbulles, assurer l’invasion du silicone à la surface et les pores, et éliminer le toluène pour minimiser l’attaque chimique sur la membrane. Créé dans BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3. Exemples de placement de membranes. (A) Placement réussi de la membrane, durcissement à RT. (B) Liaison membranaire durcie dans un four (65 °C au lieu de RT), la membrane peut être vue distendue dans la chambre lorsque le silicone s’est contracté après chauffage. (C) Puces complètes avec un placement correct des membranes PET et PC. (D) Un mauvais placement de la membrane provoque une variation du volume de chaque côté de la puce avec le mouvement de la membrane, provoquant un flux variable, exerçant une contrainte sur les cellules à l’intérieur de la puce ainsi que sur les pompes attachées à celle-ci. Créé dans BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4. Images au microscope optique de membranes PET et PC tranchées et montées. On montre l’invasion du silicone dans les pores membranaires à la suite de notre procédure de durcissement sous vide RT. (A) Des images de la même membrane sans PDMS appliqué à la membrane, des pores clairs peuvent être visibles, ainsi qu’une surface propre dans l’image polarisée. (B) Le mortier PDMS a été taché au Nile Red, et le silicone peut être observé en magenta comme ayant réussi à envahir les pores et à recouvrir finement la surface sous vide. Mis en évidence en blanc/magenta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5. La viabilité des cellules dans les dispositifs à puce n’a pas été modifiée par la construction avec ou sans toluène comme agent d’amincissement dans le mortier PDMS. Les cellules de Calu-3 ont été ensemencées à 6,5 ×10 4 cellules par puce et, une fois la confluence atteinte, ont été incubées toute la nuit avant qu’un test AlamarBlue ne soit effectué sur le surnageant et TrypanBlue sur les cellules. Les différences entre les groupes (n=4) préparés avec et sans toluène ont été testées par le test t de Student non apparié, p > 0,05 = ns (non significatif)8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 6. Des puces de membrane de sous-sol. (A) L’intégrité de la membrane a échoué car le mortier PDMS/toluène n’a pas été aspiré assez rapidement ; Cela a endommagé les protéines de la matrice et perturbé le scellement des puces. (B) Le scellement de membrane et de copeaux a réussi, mais la membrane a été scellée à l’état lâche. (C) Un scellement réussi de membranes et de copeaux permet à la puce de fonctionner pour le flux et l’étirement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 7. Deux images de la puce ECM sous étirement. (A) Éclat au repos. (B) Éclat sous une extension horizontale de 1,2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 8. Coloration du bleu d’alcien (noyaux en magenta, mucus en bleu) des cellules épithéliales Calu-3 pulmonaires humaines développées dans les éclats après exposition à l’air dans l’appareil. Les cellules de Calu-3 ont été poussées jusqu’à la confluence et cultivées pendant 10 jours sous un débit continu de 150 μL/h dans le compartiment basal et exposées soit à l’air moyen, soit à l’air du côté apical. Le débit était produit avec une pompe péristaltique à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2. À la fin de la culture, les membranes ont été retirées et teintées. Vue transversale de la coloration Alcian Blue de cellules de Calu-3 cultivées pendant 10 jours immergées (A) et exposées à l’air (B)8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 9. Visualisation des cellules épithéliales humaines primaires et des fibroblastes en co-culture prolongée à l’intérieur du dispositif. Des fibroblastes des voies respiratoires ont été ensemencés dans l’appareil et laissés s’attacher toute la nuit avant d’inverser l’appareil et de semer les cellules épithéliales de l’autre côté de la membrane. Les cellules ont été poussées jusqu’à la confluence, exposées à l’air, puis cultivées pendant 21 jours sous un débit continu de 150 μL/h, produites par une pompe péristaltique dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2. Les membranes ont été retirées après la culture, fixées, intégrées et montées sur des lames avant la teinture. Des cellules épithéliales ont été colorées pour Mucin 5AC (MUC5AC)18, un composant du mucus, et la protéine de boîte à fourchette J1 (FOXJ1)19, un facteur de transcription impliqué dans la signalisation de la production de cilles. Les fibroblastes ont été colorés avec l’agglutinine germinale du blé (WGA) pour visualiser les bicouches cellulaires de phospholipides. Les cellules ont été incubées avec 5 μg/mL dans le HBSS pendant 15 minutes et lavées trois fois avec PBS avant l’imagerie. Tous les noyaux cellulaires ont été visualisés avec DAPI. (A) Vue en coupe transversale : produite à partir d’une projection en Z-stack d’images de (B) et (C). (B) Coloration épithéliale MUC5AC/FOXJ1/DAPI sur une membrane de puce. (C) Structure externe complète de la couche fibroblastique dans la chambrebasale 8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 10. Viabilité cellulaire et coculture sur l’échafaudage membranaire basale. (A) la viabilité vivante/morte des cellules HaCaT ensemencées du côté épithélial, 3 échantillons indépendants ont été testés, 3 champs aléatoires ont été capturés à partir de chaque échantillon (n = 3). Un test ANOVA simple classique avec correction de Tukey a été réalisé. Le graphique montre la moyenne avec l’écart-type. La coculture de (B) cellules HaCaT du côté épithélial et (C) des fibroblastes pulmonaires MRC-5 du côté stromal de l’échafaudage basal contenant la membrane entourée de fibres de collagène, les barres d’écailles de 50 μm. (D) Vue 3D de la coculture depuis les vues isométriques de haut et de bas, les barres d’échelle font 100 μm, la visualisation animée se trouve dans la Figure 4 supplémentaire . (E) Épaisseur de l’échafaudage de la membrane basale avant et après la décellularisation, 14 muqueuses ont été mesurées, et parmi celles-ci, 6 (représentées par des triangles) ont été prélevées pour la décellularisation. Sur chacun des échantillons, trois champs aléatoires ont été scannés et au moins 10 points par champ correspondaient à la mesure17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1. Conception de moules de puces pour les moitiés supérieure et inférieure de la puce PET/PC standard. (A) Image du moule inférieur de la puce pouvant être produite à partir de la puce . STL dans le fichier supplémentaire 1. (B) Image du moule supérieur de la puce pouvant être produite à partir de la puce . STL dans le Fichier Supplémentaire 2. (C) Image du pochoir de membrane pour découper les membranes de la puce pouvant être produites à partir de la . STL dans le dossier complémentaire 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2. Conception de moules à puces pour les moitiés supérieure et inférieure de la puce à membrane ECM stretch. (A) Image du moule inférieur de la puce pouvant être produite à partir de la puce . STL dans le Fichier Supplémentaire 4. (B) Image du moule supérieur de la puce pouvant être produite à partir de la puce . STL dans le fichier supplémentaire 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3. Validation de la procédure d’étanchéité : comparaison de l’intrusion du PDMS dans les pores sans toluène pour réduire la viscosité du mortier et durcissement à RT sans vide. Toutes les affections concernent les membranes PET (pores de 0,4 μm), après le traitement PDMS (Nil rouge 1 %), les membranes ont été intégrées dans la paraffine avant le montage et l’imagerie au microscope optique. (A) PDMS non dilué aspiré sur une membrane PET. Une épaisse couche de PDMS est visible à la surface de la membrane, tandis qu’aucun PDMS n’est observé comme étant entré dans les pores (surligné par des encadrés blancs). (B) Mortier PDMS dilué aspiré sur une membrane PET. Une couche de PDMS est visible à la surface de la membrane, tandis qu’aucune PDMS n’est observée comme ayant pénétré dans les pores (surlignée par des encadrés blancs). (C) Mortier PDMS dilué aspiré sur une membrane PET. Une fine couche de PDMS est visible à la surface de la membrane ainsi qu’une intrusion dans les pores le long de la membrane (surlignée par des boîtes blanches). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4. 3D visualisation des cellules HaCat (épithéliales) et MRC-5 (stromales) sur l’échafaud ECM porcine. Vue 3D animée de la coculture depuis les vues isométriques de haut et de bas, dont les images peuvent être vues à la Figure 10D, les barres d’échelle font 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1. 3D . Fichier STL du moule du bas. Le moule peut être utilisé pour produire la moitié inférieure de la puce standard par impression 3D ou par une méthode de fabrication équivalente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. 3D . Lime STL du moule supérieur. Le moule peut être utilisé pour produire la moitié supérieure de la puce standard par impression 3D ou par une méthode de fabrication équivalente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3. 3D . Fichier STL du pochoir à membrane. Le pochoir peut être utilisé pour produire des membranes de la taille correcte pour la puce fournie et peut être produit par impression 3D ou par une méthode de fabrication équivalente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4. 3D . Lime STL du moule inférieur de la puce étiratrice. Le moule peut être utilisé pour produire la moitié inférieure de la puce d’élasticité par impression 3D ou une méthode de fabrication équivalente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5. 3D . Lime STL du moule supérieur de la puce élastique. Le moule peut être utilisé pour produire la moitié supérieure de la puce élastique par impression 3D ou une méthode de fabrication équivalente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole de scellement de puce que nous proposons ici représente une nouvelle manière de produire des joints à membrane à membrane de PDMS étanches, viables pour une culture à long terme sous flux, pouvant être produits avec un équipement limité et ne nécessitant aucune compétence spécialisée pour être abordés. Nous montrons la procédure de production de plaquettes à puces avec des membranes (PET, PC, ECM) fixées à la surface avec du mortier en silicone, et montrons que l’application rapide du vide facilite l’intrusion du PDMS dans les pores et à travers la surface des membranes plastiques. Nous montrons également que les puces résultantes sont bien scellées et capables d’une large gamme d’applications en culture.

Il existe plusieurs façons d’aborder la liaison PDMS-plastique, une stratégie courante en raison des propriétés bénéfiques pour la culture cellulaire du PDMS, telles que la perméabilité ou la modélisation des gaz, et les membranes plastiques pour leur viabilitéen culture cellulaire 7. Cela inclut l’activation de surface avec plasmaO2 , corona ou traitement à l’ozone, qui facilite la formation de liaisons covalentes entre le silicone oule verre 20. Sinon, des techniques de collage chimique utilisant des organosilanes tels que l’APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane) ou le MPTMS ((3-mercaptopropyl)triméthoxysilane) permettent de fonctionner la surface des deux matériaux en ajoutant des groupesréactifs 21. Alternativement, les PDMS et les substrats plastiques peuvent être collés avec une méthode d’adhésif utilisant de l’époxy ou d’autresadhésifs 22. Nous présentons un hybride entre l’activation de surface et le collage chimique, avec l’utilisation de membranes poreuses et de vide pour produire une connexion physique à travers la membrane pouvant être liée uniquement par l’activation de surface du plasmaO2 . En amincissant le PDMS avec du toluène, nous permettons l’invasion du PDMS à travers les pores d’une membrane sous vide, ce qui permet de lier covalentement différentes membranes via les liaisons PDMS-PDMS à travers les moitiés de la puce et la membrane incrustée dans le mortier. En produisant un réseau physique en silicone à travers ces pores, nous évitons le besoin de traitement chimique de surface ou de chaleur et de pression fournies par une machine d’embossage à chaud, ce qui facilite souvent cestechniques 23.

Dans l’étude actuelle, une puce à deux chambres à grande échelle est fournie (Fichier Supplémentaire 1) pouvant remplir une gamme de fonctions. Deuxièmement, une puce capable d’étirement horizontal cyclique (Fichier Supplémentaire 2). Ces appareils fonctionnent comme une voie aérienne sur puce, tandis que le modèle peut aussi être utilisé comme un système gut-on-chip, comme montréprécédemment dans le 13. Principalement, un guide étape par étape est fourni avec plusieurs options différentes pour la production de moules, la préparation de membranes et la construction de puces, pouvant être appliquées à d’autres nouvelles plateformes de puces selon l’application souhaitée par les chercheurs. Il est recommandé d’utiliser un four plasmaO2 pour la fermeture finale. Néanmoins, un dispositif plasma portatif ou une compression manuelle avec mortier PDMS a également été démontré efficace pour cette étape24. Dans ce protocole pour cette procédure de scellement, les principaux obstacles et spécifications ont été mis en évidence à chaque étape. Cela inclut la possibilité de pré-recouvrir les membranes, l’importance d’utiliser immédiatement le mortier PDMS/toluène, l’importance que le mortier n’entre pas dans la zone de culture, et l’importance que la membrane ne bouge pas après la connexion avec le mortier.

La reproduction de cette procédure de scellement a été réalisée à plusieurs reprises par les enquêteurs avec un protocole écrit ; Seules les clarifications suivantes ont été nécessaires pour réussir le scellement lors d’une seconde tentative. En cas de fuites lors de tests de contrainte ou de cultures cellulaires prolongées, quelques options peuvent être explorées. Tout d’abord, le chercheur doit s’assurer que le mortier est fraîchement préparé à partir d’un liquide PDMS qui n’a pas encore commencé à durcir et est bien mélangé au toluène. La faible viscosité du mortier permet une fine couche lisse qui peut s’écouler dans les pores de la membrane lorsque l’air est aspiré. Deuxièmement, il faut appliquer suffisamment de mortier pour couvrir l’ensemble du bas et du haut de la membrane, tandis qu’un excès provoquera un écoulement dans la zone de culture sous compression, mais trop peu laissera des espaces qui faciliteront la fuite entre les chambres. Troisièmement, les membranes doivent être plates avant et pendant l’attache. Enfin, malgré l’effort manuel nécessaire, les copeaux doivent rester en grande partie sans saleté pour garantir une liaison finale totale, il est donc essentiel de travailler rapidement et proprement.

Bien que nous ayons montré l’attachement de trois types différents de membranes poreuses dans cet article, la fonction de cette méthode pour d’autres membranes ne peut être prédite. Cela s’explique par le fait que différentes résistances chimiques au toluène, ainsi que d’autres densités et tailles de pores, influencent le résultat de cette procédure de scellement. Cependant, nous montrons la première liaison membranaire extensible entièrement basée sur la MCE, ce qui suggère une grande polyvalence du protocole. Cependant, la consistance de la performance d’étirement n’a pas été vérifiée de manière fiable, car différentes régions de membranes, organes et sources de base produiront des différences mécaniques. De plus, la viabilité des membranes ECM pour la culture cellulaire est également sujette à évoluer avec le temps, tant en culture qu’enstockage. Bien que cette procédure fonctionne pour différentes membranes et configurations de puces, elle nécessite une peinture manuelle du mortier pour être efficace, ce qui prend relativement peu de temps mais sera plus souvent efficace avec des modèles à plus grande échelle comme ceux que nous fournissons. Enfin, alors que le processus de liaison par membrane ne nécessite que PDMS, toluène, membrane et chambre à vide, le scellement final de la puce dépend de l’application de plasmaO2 , qui n’est pas universellement disponible.

Malgré les limites, le protocole proposé est novateur et ne nécessite aucune compétence spécialisée pour être abordé. À notre connaissance, la production de réseaux en silicone par les pores membranaires par aspiration du mortier PDMS à faible viscosité est la première du genre. Contrairement à d’autres ponts fonctionnels chimiques ou mécaniques entre les différents matériaux sous-jacents à une puce fonctionnelle, cette solution est possible dans la plupart des environnements de laboratoire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le consortium Precision Medicine for More Oxygen (P 4O2) ainsi que par un financement de Stichting Proefdiervrij. Ma plus profonde gratitude à Isadora Kraguljac pour l’idée d’utiliser la teinture Nile Red, car elle se mélangerait avec le PDMS pour la visualisation des réseaux en silicone, et à Marjan Reinders-Luinge pour son talent de découpe et de montage des membranes. Les auteurs expriment leur plus profond remerciement au département d’analyse pharmaceutique et à Sabeth Verpoorte pour leur accès à leur four à plasma à oxygène, le processus n’aurait pas été possible sans lui.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue à large nez de 2 mLBD Emereld307727
Perforatrice de biopsie 2 mmKAI MedicalBP-20F
Gamme cellulaire Calu-3ATCCHTB-55RRID :  ; CVCL_0609
HBSS (Solution saline équilibrée Hanks)Gibco14170112
O2 Four à plasmaHarrick PlasmaPDC-002
Membranes de culture cellulaire gravées à piste PCipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
Membranes de culture cellulaire gravées à trace PETipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Polydiméthylsiloxane/Sylgard 184 Base et agent de durcissement en élastomère siliconéeDow CorningDOWC25100445
Polyméthacrylate de méthyle (8 mm)ColltecN/A
Résine photopolymère standard (gris) (1 kg)ElegooN/A
ToluèneMerck  ;1,08,325
Chambre à videFisherScientific12080253

Références

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  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
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