Isolement des cardiomyocytes ventriculaires à partir d’un modèle murin de cardiotoxicité par doxorrubicine

Résumé

Ce protocole décrit une méthode reproductible, sans Langendorff, pour isoler des cardiomyocytes ventriculaires adultes de souris viables à partir d’un modèle de cardiotoxicité induit par la doxorubicine. Il utilise une perfusion antérieure directe du ventricule gauche suivie d’une digestion enzymatique contrôlée pour obtenir des myocytes en forme de bâtonnets tolérants au calcium, adaptés aux analyses structurelles, moléculaires et fonctionnelles.

Résumé

La doxorubicine (DOX) est un médicament chimiothérapeutique efficace dont l’application clinique est limitée par une cardiotoxicité progressive et dépendant de la dose, qui affecte principalement le myocarde ventriculaire. L’étude des mécanismes de lésions cellulaires dans ce contexte nécessite une isolation fiable des cardiomyocytes adultes, un processus techniquement complexe dans les cœurs malades ou structurellement fragiles. Nous décrivons ici un protocole simplifié et reproductible sans Langendorff pour isoler les cardiomyocytes ventriculaires fonctionnels de souris présentant une cardiotoxicité induite par la DOX. Après avoir établi le modèle DOX chez des souris C57BL/6, le cœur est rapidement excisé et l’aorte est clampée ex vivo. La perfusion antegrade non recirculante est réalisée directement à travers le ventricule gauche à l’aide de tampons sans calcium et contenant des enzymes. Une dissociation mécanique douce du tissu ventriculaire digéré produit des cardiomyocytes individuels, suivie d’une réintroduction contrôlée du calcium pour restaurer la tolérance au calcium. Cette méthode fournit des cardiomyocytes de haute qualité, viables, en forme de bâtonnet, compatibles avec les tests en aval, incluant l’immunofluorescence, l’analyse d’organisation des sarcomères, la détection d’apoptose et les études de signalisation moléculaire. En éliminant le besoin d’équipements spécialisés de perfusion Langendorff, ce protocole offre une solution accessible et à haut rendement pour les laboratoires étudiant les mécanismes des lésions cardiaques induites par la DOX.

Introduction

La doxorubicine (DOX) est un puissant agent chimiothérapeutique anthracycline, mais son utilité clinique est limitée par une cardiotoxicité cumulative pouvant évoluer vers une cardiomyopathie dilatée et une insuffisance^{cardiaque 1,2}. L’apoptose cardiomyocytaire est un processus pathogène clé dans cette^{toxicité 3,4,5}, et l’étude de ces événements cellulaires nécessite un accès fiable aux cardiomyocytes fonctionnels adultes dérivés de cœurs lésés par DOX. Cependant, l’exposition à la DOX rend les cardiomyocytes structurellement fragiles et métaboliquement^{compromis 6}, augmentant considérablement leur susceptibilité au stress enzymatique et mécanique pendant l’isolement et entraînant une faible viabilité. Dans la littérature plus large, la perfusion de Langendorff reste la méthode prédominante pour l’isolement des cardiomyocytes^{chez l’adulte 7}. Cependant, il présente des limites notables lorsqu’il est appliqué sur un myocarde endommagé. La méthode exige du matériel spécialisé, une canulation aortique précise et une maîtrise technique considérable ; dans les cœurs traités par DOX, la contrainte mécanique supplémentaire introduite lors de la perfusion de Langendorff peut aggraver davantage les lésions cellulaires, produisant des résultats incohérents et souvent^{sous-optimaux 8}.

Pour surmonter ces défis, nous avons mis en place un protocole simplifié et accessible pour isoler les cardiomyocytes ventriculaires adultes tolérants au calcium à partir d’un modèle murin de cardiotoxicité aiguë induite par^{la DOX 9}. En éliminant le besoin de perfusion de Langendorff conventionnelle et en mettant en place une perfusion contrôlée ex vivo antegrade directement à travers le ventricule gauche, cette méthode minimise l’exposition ischémique et réduit la manipulation mécanique du myocarde. Ces caractéristiques devraient améliorer la cohérence des procédures et renforcer la survie des cardiomyocytes vulnérables issus de cœurs compromis ^7,10.

L’approche actuelle s’appuie sur les avancées émergentes dans l’isolement des cardiomyocytes sans Langendorff, étendant ces concepts aux cellules ventriculaires adultes, qui nécessitent la préservation d’une architecture contractile mature et des propriétés de gestion du calcium, caractéristiques qui ne sont pas suffisamment soutenues par des méthodes de digestion simplifiées développées principalement pour les cœurs^{néonatals 11,12}. Ce protocole offre donc une alternative pratique et reproductible pour les laboratoires dépourvus de systèmes de perfusion spécialisés. Les cardiomyocytes isolés conservent leur intégrité structurelle et sont bien adaptés à diverses applications en aval, notamment l’analyse des sarcomères, l’imagerie par immunofluorescence et les études de signalisation par apoptose, permettant une investigation mécanistique directe des lésions cardiaques induites par la DOX dans un contexte physiologiquement pertinent. Collectivement, ce protocole répond à un besoin critique non satisfait d’isoler les cardiomyocytes viables des cœurs blessés par la DOX.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Jiaotong de Xi’an (Approbation n° XJTUAE2022-1441). Les consommables, réactifs et équipements utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Établissement du modèle de cardiotoxicité aiguë induite par la DOX chez les souris C57BL/6

1. Préparation animale : Utilisez des mâles C57BL/6 souris (24-28 g) âgés de 8 à 12 semaines. Animaux domestiques dans des conditions standard, avec un cycle clair/obscur de 12 heures et un accès à la nourriture et à l’eau à volonté de manière indépendante. Attribuer aléatoirement les souris aux groupes témoins traités par DOX ou à la solution saline (n = 3 par groupe).
2. Administration DOX
   1. Préparez une nouvelle solution DOX à 1,5 mg/mL dans du sérum stérile. Protégez la solution de la lumière en enveloppant le récipient dans du papier aluminium.
   2. Peser chaque souris et calculer le volume d’injection pour une dose intrapéritonéale unique (p.i.) de 15 mg/^{kg 13,14}.
   3. Maîtrisez doucement la souris et administrez la solution DOX par injection intrapéritonéale. Ramenez la souris dans sa cage et procédez selon le calendrier expérimental.
      ATTENTION : DOX est un agent cytotoxique. Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, protection oculaire) et manipulez le réactif dans une zone de sécurité chimique désignée.
3. Calendrier et surveillance : Surveillez quotidiennement les souris pour vérifier leur santé générale et leur comportement. Notez le poids corporel un jour sur deux. Effectuez l’isolement cardiomyocytaire 7 jours après l’injection de DOX.

2. Préparation de solutions et d’outils chirurgicaux pour l’isolement des cardiomyocytes

1. Préparation du tampon : Voir le Tableau Supplémentaire 1 pour les méthodes de préparation détaillées de ces solutions.
   1. Préparez le tampon de perfusion et le tampon EDTA. Ajustez le pH de toutes les solutions à 7,4 avec NaOH.
   2. Préparez une solution de digestion enzymatique contenant la collagénase de type II, de type IV et la protéase XIV avec un tampon de perfusion.
   3. Préparez l’arrêt du tampon en complétant le tampon de perfusion avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 5 %.
   4. Préparez un milieu de culture complet en ajoutant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA), d’insuline-transférrine-sélénium (ITS), 10 mM de 2,3-butanedione monoxique (BDM), de concentré lipidique et de pénicilline/streptomycine (P/S) au milieu M199.
   5. Préparez les tampons de réintroduction du calcium en ajoutant un milieu de culture complet au tampon de perfusion à des concentrations finales de calcium de 0,34 mM, 0,68 mM et 1,02 mM, respectivement.
      REMARQUE : Préparez toutes les solutions en conditions stériles en utilisant une filtration à 0,22 μm. Conservez les solutions à 4 °C, protégées de la lumière, pendant jusqu’à deux semaines. Pour l’isolement d’un cœur de souris, préparez 50 mL tampon EDTA, 100 mL tampon de perfusion (60 mL pour la solution de collagénase, 10 mL pour le tampon d’arrêt, le reste pour la perfusion et la sédimentation gravitationnelle), 60 mL tampon de collagénase et tampon d’arrêt de 10 mL.
2. Préparation de l’outil chirurgical : Stérilisez tous les instruments chirurgicaux en autoclavant avant l’intervention. Disposez les outils suivants séquentiellement dans la zone chirurgicale : ciseaux fins, ciseaux courbés, pinces, pinces hémostatiques courbées (Figure 1A) et pompe à seringue (Figure 1B).

3. Isolement des cardiomyocytes provenant de cœurs traités par DOX

REMARQUE : Un aperçu schématique de la procédure d’isolement des cardiomyocytes est présenté à la Figure 2. Après avoir vérifié que tous les instruments, équipements et solutions chirurgicaux sont prêts, commencez l’isolement.

1. Pincement aortique et excision cardiaque
   1. Anesthésiez la souris avec 3 % d’isoflurane et confirmez l’anesthésie en vérifiant l’absence de réponse à une pincée^{de l’orteil 15}.
   2. Fixez la souris en position couchée sur la planche de dissection.
   3. Faites une incision médiane à travers la peau et la paroi thoracique pour exposer le cœur, puis coupez l’aorte descendante.
   4. Perfusez 7 mL de tampon EDTA à un rythme contrôlé et régulier à la base du ventricule droit pendant environ 1 minute pour retirer rapidement le sang des ventricules tout en minimisant l’exposition ischémique et en préservant l’intégrité structurelle cardiaque, en particulier dans les cœurs fragiles atteints de DOX (Figure 2A).
   5. Clampez rapidement l’aorte ascendante (Figure 2B), excisez le cœur, puis transférez-le immédiatement dans une boîte de 100 mm contenant un tampon EDTA glacé.
      REMARQUE : Le temps total entre la thoracotomie et le transfert cardiaque est idéalement maintenu en dessous de 2 minutes pour minimiser l’ischémie.
2. Installation en perfusion
   1. Coupez soigneusement les tissus environnants.
   2. Placez le cœur dans une boîte de dissection contenant un tampon de perfusion glacé.
   3. Perfusez 10 mL de tampon EDTA régulièrement à travers l’apex du ventricule gauche à l’aide d’une aiguille permanente pendant 6 minutes pour déstabiliser les connexions extracellulaires.
   4. Transférez le cœur dans une autre boîte de 100 mm et retirez l’EDTA résiduel des chambres cardiaques en perfonçant 3 mL de tampon de perfusion dans le même cathéter pendant 2 minutes.
      REMARQUE : Observez le gonflement cardiaque pendant la perfusion et fixez l’aorte avec des pinces hémostatiques courbées pour établir un système de perfusion fermé. Contrôlez soigneusement le taux de perfusion et la pression pour éviter une force hydrostatique excessive et minimiser le risque de rupture de l’auriculation gauche.
3. Digestion enzymatique
   1. Transférez le cœur excisé dans un plat de 100 mm contenant 5 mL de solution enzymatique digérante.
   2. Connectez l’aiguille à l’intérieur à une seringue de 20 mL remplie de la solution enzymatique de digestion et fixez solidement l’aiguille sur la surface de travail de l’armoire de biosécurité à l’aide d’un ruban indicateur de stérilisation.
   3. Placez la seringue dans une pompe à microinjection et initiez la perfusion à un débit contrôlé de 3 min/mL (Figure 2C).
   4. Perfusez le cœur à travers le ventricule gauche avec la solution enzymatique pendant 60 à 90 minutes jusqu’à ce que la digestion soit complète, ce qui est indiqué par une perte totale d’élasticité tissulaire et une coloration pâle de la surface ventriculaire (Figure 2D). Si une digestion incomplète est observée après la perfusion initiale, administrez 15 à 20 mL supplémentaires de solution enzymatique pour la poursuite de la digestion.
      REMARQUE : Éviter le délogement de l’aiguille lors du changement de seringue ; Si elle est déplacée, réinsérer dans le site du ventricule gauche d’origine pour préserver le trajet de perfusion.
4. Dissociation tissulaire
   1. Transférez le cœur digéré dans un plat de 60 mm contenant 5 mL de tampon d’arrêt.
   2. Déchirez le tissu ventriculaire en petits morceaux à l’aide de pinces fines (Figure 2E).
   3. Triturez doucement la suspension du tissu ventriculaire avec une pipette de 5 mL pour dissocier les cardiomyocytes individuels (Figure 2F).
   4. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre cellulaire de 100 μm pour retirer les gros fragments de tissu.
   5. Rincez la passoire avec 5 mL supplémentaires de tampon d’arrêt pour maximiser le rendement de la cellule.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de trituration avec douceur et limitez la pipetation à un maximum de 50 répétitions afin d’éviter des dommages mécaniques aux cardiomyocytes.
5. Réintroduction du calcium
   REMARQUE : Laissez les cardiomyocytes subir 3 à 4 périodes sédimentaires gravitationnelles consécutives de 15 minutes dans des tubes centrifugeuses de 15 mL (Figure 2G). Après chaque sédimentation, retirez soigneusement 80 % du surnageant et remettez le pellet en suspension dans 3 mL du tampon de réintroduction du calcium suivant. Augmentez progressivement la concentration de calcium en utilisant les solutions en gradient préparées à chaque^{étape 16}.
6. Comptage et plaquage cellulaire
   1. Quantifiez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et calculez la proportion de cardiomyocytes en forme de bâtonnet versus cardiomyocytes^{arrondis 1,9} (Figure 2H).
   2. Plaque 1 à 5 × 10^{cellules 5} dans un milieu de placage en plaques à 6 puits pré-enduites de laminine (10 μg/mL) pendant 1 h à 37 °C et lavés avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS). Préparez les assiettes un jour à l’avance et conservez-les à 4 °C si nécessaire. Changez de milieu pour un milieu de culture frais, préchauffé, après 1 heure, puis toutes les 48 heures par la suite.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après l’étape 3.6. Les cellules peuvent être maintenues en culture à court terme jusqu’à 6 heures pour des expériences immédiates.

4. Évaluation de l’intégrité structurale des cardiomyocytes par immunocoloration

1. Fixez les cellules avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante.
2. Lavez les cellules trois fois avec du PBS, 5 min chacune.
3. Perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton X-100 dans PBS pendant 10 minutes et laver trois fois avec du PBS, 5 minutes chacun.
4. Bloquez la liaison non spécifique avec 1 % de BSA dans le PBS pendant 1 heure.
5. Incuber les cellules avec un anticorps primaire contre la α-actinine sarcomérique pendant la nuit à 4 °C.
6. Lavez doucement trois fois avec du PBS, puis incubez avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié pendant 1 h à température ambiante.
7. Lavez doucement trois fois avec du PBS, puis contre-colorez les noyaux avec du DAPI pendant 5 minutes.
8. Montez les couvercles sur des glissières en verre avec un support antifondu.
9. Acquiescez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser les motifs de coloration.

5. Analyse de la signalisation apoptotique dans les cardiomyocytes isolés

1. Extraction et quantification des protéines
   1. Lyse cardiomyocytes dans un tampon à base de RIPA, complété avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
   2. Centrifugez les homogénéations à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Collectez le surnageant pour une analyse ultérieure.
   3. Déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un test colorimétrique à l’acide bicinchoninique.
2. Analyse du western blot
   1. Séparez 30 μg de protéines sur des gels de SDS-polyacrylamide et transférez les protéines résolues sur les membranes PVDF.
   2. Bloquez les membranes avec 5 % de lait écrémé dans le TBS contenant 1 % de Tween-20, puis incubez-les toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre Bax, Bcl-2 et caspase-3 clivée, marqueurs protéiques clés couramment évalués dans les études de cardiotoxicité^{DOX 17}.
   3. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort appropriés. Détecter les signaux à l’aide d’un réactif chimiluminescence amélioré et acquérir des images avec un système d’imagerie numérique¹⁸.
3. Analyse des données
   1. Présentez les données quantitatives comme moyenne ± SEM provenant de trois réplications biologiques indépendantes.
   2. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de GraphPad Prism, en appliquant une ANOVA bidirectionnelle pour les comparaisons entre plusieurs groupes et points temporels, ou un test t à deux queues non apparié pour les comparaisons entre deux groupes. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Évaluation du rendement cellulaire et de la viabilité

Les souris recevant la DOX ont montré une baisse marquée du poids corporel par rapport au groupe traité par solution saline (Figure supplémentaire 1A). L’établissement réussi du modèle de cardiotoxicité aiguë induit par la DOX a été confirmé par une augmentation marquée des marqueurs de lésions cardiaques sériques, incluant cTnT et CK (Figure supplémentaire 1B,C

Discussion

L’isolement réussi de cardiomyocytes adultes de haute qualité et tolérants au calcium est essentiel pour les études cellulaires de la physiopathologie cardiaque. Ce protocole permet de produire de manière fiable des cardiomyocytes fonctionnels provenant aussi bien de cœurs de souris sains que pathologiques, deux étapes étant particulièrement cruciales pour préserver la viabilité cellulaire. Tout d’abord, optimisez et surveillez soigneusement la durée de la perfusion enzymatique. Une dige...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plats de cluture cellulaires de 100 mm	Bio-filtration par jet & nbsp ;	TCD000100
100 & mu ; Filtre à cellules M	Corning	431752
Tubes centrifugeuses de 15 mL	Bio-filtration par jet & nbsp ;	CFT011150
Tubes centrifugeuses de 50 mL	Bio-filtration par jet & nbsp ;	CFT011500
Antennes de culture cellulaire de 60 mm	Bio-filtration par jet & nbsp ;	TCD100060
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A1470 & nbsp ;
Colaganase II	Sigma-Aldrich	C6885
Colagnase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Pinces hémostatiques courbées	Sciences de la vie RWD	F22003-10
Ciseaux à extrémités courbes	Sciences de la vie RWD	S12001-09
Ciseaux fins	Sciences de la vie RWD	S12000-09
Pinces	Sciences de la vie RWD	F13014-12
Canule à résidence (26G)	Becton, Dickinson and Company	381312
Insuline-Transferrine-Sélénium (ITS)	MedChemExpress	HY-150287
Isoflurane  ;   ;	Sciences de la vie RWD	R510-22-10
Laminine (murine)	Thermo Scientific	23017015
Concentré lipidique (défini chimiquement)	MedChemExpress	HY-K3019
M199 Medium	Sigma-Aldrich	M4530
Pénicilline-Streptomycine	MedChemExpress	; HY-K1006
Protéase XIV	Sigma-Aldrich	P5147
Ruban indicateur de stérilisation	Minnesota Minière et Fabrication (3M)	CT060934701
Pompe à seringue (ISPLab01)	Pompe de précision Baoding Shenchen	SC-49464A