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Amélioration de l’absorption du virus adéno-associé à l’adéno-recombinaison intestinale par une formule de médecine traditionnelle chinoise

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DOI :

10.3791/70413

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24 avril 2026

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle de sac intestinal éversé afin d’évaluer les interactions entre la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et le virus adéno-associé recombinant (rAAV) lors de l’absorption intestinale, fournissant une plateforme ex vivo pour optimiser les stratégies de délivrance des gènes oraux.

Résumé

La délivrance orale du virus adéno-associé recombinant (rAAV) possède un potentiel thérapeutique important mais est limitée par une absorption intestinale inefficace. La médecine traditionnelle chinoise (MTC), largement utilisée dans les formulations orales, représente une source prometteuse d’améliorateurs d’absorption. Cependant, ses effets potentiels sur l’absorption et la transduction du rAAV restent largement inexplorés. Le modèle du sac intestinal éversé fournit une plateforme quantitative ex vivo pour étudier ces interactions. Un protocole détaillé est présenté ici utilisant le modèle du sac intestinal éversé pour évaluer quantitativement la translocation du virus adéno-associé (rAAV) à travers l’épithélium intestinal et la transduction génique subséquente dans le tissu intestinal sous des conditions expérimentales contrôlées. Les étapes clés incluent la prélèvement de segments intestinaux grêles sur des rongeurs de laboratoire, l’évirage des segments pour former des sacs, et le remplissage de chaque sac avec un tampon oxygéné. Les sacs éversés sont immergés dans un tampon oxygéné contenant des particules de rAAV et incubés à 37 °C pour permettre l’exposition luminale et le transport vectoriel. Les analyses finales consistent à prélever le fluide interne (sérosal) pour mesurer les particules de rAAV ayant traversé l’épithélium, ainsi qu’à analyser le tissu du sac pour l’expression des transgènes afin de déterminer l’efficacité de la transduction. En testant plusieurs régions intestinales, le protocole offre un aperçu des différences spécifiques aux segments dans l’absorption du rAAV. De plus, l’inclusion de GZNG, une formule classique de la MTC, lors de l’incubation permet d’évaluer son impact sur l’absorption et la transduction des vecteurs. L’approche du sac intestinal éversé offre une plateforme précieuse pour le dépistage des sérotypes rAAV, des amplificateurs de délivrance et des interactions entre les vecteurs rAAV et les composants de la MTC. Sa conception simple et parallélisable permet également un dépistage à haut débit dans les études précliniques.

Introduction

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) représente une plateforme prometteuse pour la thérapie génique systémique, avec trois voies principales de délivrance actuellement explorées : injectionintraveineuse 1, injection intrapéritonéale2 et administrationorale 3. Bien que les voies d’injection intraveineuse et intraperitonéale aient été largement étudiées, l’administration orale, une approche non invasive, reste relativement peu explorée. La faisabilité de l’administration orale de rAAV a été démontrée pour la première fois par Xin et al.4, qui ont rapporté une transduction réussie de la muqueuse intestinale et l’induction d’une réponse immunitaire anti-VIH après administration orale de rAAV2. De même, Hara et al.3,5 ont démontré que le rAAV/Aβ oral peut transduire la muqueuse gastro-intestinale et réduire le dépôt d’amyloïde cérébrale, tandis que Steel et al.6 ont constaté que la vaccination orale démontrait une survie et une immunité anti-tumorale supérieures à celles de l’injection intramusculaire. La même étude a rapporté que rAAV6 présentait un tropisme intestinal plus fort que rAAV5. Au-delà des applications vaccinales, un potentiel thérapeutique a été atteint dans d’autres modèles pathologiques. Ma et al.7 et Hao et al.8 ont prouvé que le rAAV oral conduisait à la suppression tumorale et à une thérapie anti-fibrosique dans le foie et l’estomac, respectivement, après une transduction gastro-intestinale. Huang et al.9 ont identifié le sérotype modifié Rec2 comme le sélecteur de tissu adipeux brun après administration orale, contrairement au tropisme hépatique prédominant observé lors de l’administrationintraveineuse 10. Malgré ces résultats pionniers, la recherche sur la délivrance orale de rAAV reste limitée, en partie en raison de l’absence de systèmes de dépistage in vitro pour une évaluation à grande échelle.

Le modèle du sac intestinal éverti, développé par Wilson et Wiseman en 1954-11, reste une plateforme in vitro précieuse pour étudier les mécanismes d’absorption des médicaments intestinaux. Contrairement à d’autres appareils simulateurs d’absorption, ce système prend en compte de manière unique plusieurs processus physiologiques au-delà de la simple diffusionpassive 12. Cette caractéristique le rend particulièrement avantageux pour l’étude de laMTC 13. Grâce à ce système, il est documenté que les composés de la MTC présentent souvent des schémas d’absorption intestinale dépendants des segments dans tout le tractus gastro-intestinal. Par exemple, une étude a démontré que plusieurs alcaloïdes de Wuwei Qingzhuo San sont absorbés sélectivement dans différents segments intestinaux, le jéjunum et l’iléon présentant l’absorption la plus active14. De plus, la co-administration de constituants de la MTC peut moduler l’absorption intestinale. Liao et al.15 ont rapporté que la co-administration avec l’extrait de Radix Angelicae dahuricae a considérablement amélioré l’absorption intestinale de la puerarine, mettant en lumière l’influence des interactions de la MTC sur l’absorption segmentaire. Par conséquent, le modèle du sac intestinal éversé sert d’outil idéal pour élucider les comportements d’absorption complexes et les interactions synergiques inhérents aux formulations de la MTC et à d’autres médicaments.

Choisir un modèle approprié pour la recherche sur l’absorption du rAAV nécessite une compréhension nuancée des compromis entre la précision physiologique, la complexité technique et le débit. Le tableau ci-dessous résume les principaux modèles expérimentaux utilisés pour étudier l’absorption intestinale.

Cette étude fournit une preuve de concept que le modèle du sac intestinal éversé peut être utilisé pour étudier l’absorption intestinale des vecteurs du virus adéno-associé recombinant (rAAV). Elle fournit des informations précieuses sur la manière dont la co-administration de la MTC influence l’absorption intestinale des vecteurs rAAV, soulignant la nécessité de davantage caractériser leurs interactions mécanistiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. L’optimisation des stratégies d’administration orale améliorées par la MTC grâce à cette approche pourrait faciliter le développement de thérapies rAAV non invasives, améliorant ainsi l’adhésion et l’accessibilité au traitement par les patients.

Les chercheurs doivent évaluer le modèle du sac intestinal éversé selon les critères suivants afin de s’assurer qu’il correspond à leurs objectifs expérimentaux. Les applications appropriées incluent un dépistage rapide des sérotypes, l’évaluation par adjuvants/améliorateurs et la cinétique régionale, tandis que les applications et limitations inappropriées incluent les études d’expression à long terme (>48 h) et la pharmacologie systémique.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées en stricte conformité avec les directives approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale navale (approbation CHEC (A.E)-2025011).

1. Préparation de la solution de Tyrode et des solutions virales

  1. Préconditionnement de la solution de Tyrode :
    1. Préparez deux aliquotes de 500 mL de solution de Tyrode (pH 7,4) (voir tableau des matériaux).
    2. Refroidissez une aliquote à 4 °C et réchauffez l’autre à 37 °C.
    3. Faites buller chaque aliquote avec 95 % O₂/5 % CO₂.
  2. Préparation de la solution virale :
    1. Ajouter AAV9-CMV-EGFP recombinant à la solution de Tyrode à 37 °C pour obtenir une concentration finale de 1 x 1011 vg/mL (condition de contrôle).
    2. Pour la condition expérimentale, compléter la préparation AAV9-CMV-EGFP par une formule TCM GZNG (Tableau 2) dissoute dans le véhicule jusqu’à une concentration finale de 200 mg/mL.
    3. Pour le contrôle uniquement GZNG, ajoutez GZNG (200 mg/mL) à la solution de Tyrode sans AAV9 CMV-EGFP.
      REMARQUE : Préparez des dilutions virales immédiatement avant utilisation afin de préserver l’infectivité. Le pH de la solution GZNG est d’environ 5,0 à 6,0.

2. Préparation animale et prélèvement des tissus intestinaux

  1. Jeûne : Jeûner les rats Sprague–Dawley de 8 semaines pendant 24 heures avant l’opération. Assurez-vous d’avoir un accès libre à l’eau pendant cette période pour maintenir l’hydratation.
    REMARQUE : Le jeûne aide à minimiser la teneur intestinale et assure une mesure précise de l’absorption intestinale lors des expériences ex vivo .
  2. Vérifiez la santé des animaux avant le jeûne et assurez-vous qu’ils sont en bon état. Excluez les animaux présentant des signes de détresse ou de maladie de l’étude.
  3. Administrez du pentobarbital sodique (200 mg/kg, intraperitonéalement) pour induire une anesthésie profonde. Vérifiez que l’animal est complètement anesthésié en vérifiant l’absence de réflexes et de respiration régulière.
    ATTENTION : Le Pentobarbital est une substance contrôlée dangereuse ; manipulez avec des gants et des EPI dans une hotte à fumée pour éviter le contact cutané/inhalation et suivez les directives institutionnelles pour une élimination sûre et une intervention d’urgence.
  4. Effectuer l’euthanasie par luxation cervicale une fois l’anesthésie profonde confirmée.
  5. Prélèvez un échantillon d’éthanol à 75 % sur les zones abdominales et thoraciques afin de désinfecter la peau et de réduire la contamination microbienne lors de la chirurgie.
  6. Réalisez une incision médiane le long de la région abdominale à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles pour exposer la cavité péritonéale.
  7. Séparez doucement et exposez l’estomac et les intestins. Utilisez un drapeau stérile pour protéger les tissus et organes environnants pendant la procédure.
  8. Transectez soigneusement le sphincter pylorique pour séparer l’estomac du duodénum proximal. Assurez-vous que le duodénum reste intact pour les interventions ultérieures.
  9. Disséquez le côlon distal à la jonction recto-anale tout en évitant tout dommage aux tissus environnants.
  10. Libérez doucement les attaches mésentériques de l’intestin grêle à l’aide de pinces fines ou de ciseaux. Veillez à ne pas étirer ni déchirer le mésentère.
  11. Transférez immédiatement l’intestin grêle intact dans une solution glacée de tampon de Krebs-Ringer oxygéné (solution de Tyrode, 4 °C).

3. Préparation ex vivo du sac digestif énervé

  1. Sélectionnez les segments intestinaux suivants : un segment de 8 cm situé à 10 cm distal du pylore était désigné segment duodénal.
  2. Prélever un segment jéjunal de 8 cm commençant par 16 cm distal jusqu’au segment duodénal.
  3. Obtenir un segment iléal de 8 cm commençant par 16 cm de plus distal jusqu’au segment jéjunal.
  4. Pour le côlon, prélever un segment de 8 cm situé à 5 cm proximal de l’extrémité aveugle cécal.
    REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est élastique et intact, adapté à l’inversion pendant la préparation.
  5. Rincez la lumière intestinale à l’aide d’une seringue de 2 mL remplie d’une solution de Tyrode oxygénée et glacée.
  6. Éliminer l’effluent selon les protocoles institutionnels de déchets biologiques afin de maintenir la stérilité et prévenir la contamination.
    ATTENTION : Manipuler les déchets biologiques à l’aide de gants et d’équipements de protection appropriés afin d’éviter toute exposition à des matières potentiellement infectieuses. Éliminer tous les déchets biologiques et effluents conformément aux directives institutionnelles de sécurité contre les biohazards afin de prévenir la contamination environnementale.
  7. Insérez l’extrémité proximale du segment intestinal sur une tige de verre polie de 4 mm. Assurez-vous que la surface de la tige est lisse pour éviter la déchirure muqueuse.
  8. Attachez l’extrémité distale du segment avec une suture en soie 2-0 pour fixer le tissu sur la tige. Confirmez que le tissu reste stable pendant l’inversion.
  9. Évervez doucement le segment intestinal en faisant glisser le tissu le long de la tige jusqu’à ce que la muqueuse soit complètement exposée. Évitez les étirements ou torsions excessifs pour préserver l’intégrité des tissus.
  10. Injectez 2 mL de solution de Tyrode glacée dans la lumière pour vérifier toute fuite. La fuite acceptable doit être de <5 % en 1 minute. Si une fuite est détectée, ajustez les points de suture et vérifiez l’inversion complète de la surface muqueuse.
    REMARQUE : Effectuer l’éversion dans un environnement froid afin de minimiser la dégradation enzymatique et de préserver la viabilité des tissus.
  11. Insérez un capillaire en verre de 3 mm de 5 cm à l’extrémité ouverte du segment éversé pour servir d’entrée de perfusion. Avancez doucement la canule pour éviter les déchirures muqueuses.
  12. Fixez la canule à l’aide de sutures en soie 2-0. Assurez-vous que la canule reste fixe en place sans s’effondrer ni obstruer l’écoulement du liquide.
  13. Appliquez une légère tension sur les points de suture pour maintenir la forme correcte du sac digestif. Évitez les pliés ou les torsades, car cela peut perturber la perfusion et modifier les résultats d’absorption.
  14. Évitez un serrement excessif, car cela pourrait endommager le tissu ou déformer le sac. Maintenir une tension uniforme tout au long de l’expérience. Examinez régulièrement le sac intestinal éversé pour détecter des fuites ou des dommages structurels. Si la fuite dépasse 5 %, réparez ou remplacez le segment avant de continuer.

4. Transduction et incubation de l’AAV

  1. Placez chaque sac éversé dans un tube conique de 7 mL contenant 4 mL de solution oxygénée de Tyrode à 37 °C.
  2. Ajouter la solution virale comme suit : Contrôle : AAV9-CMV-EGFP seul ; Expérimental : AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. Incuber statiquement à 37 °C pendant 2 heures, période durant laquelle un mélange gazeux de 95 % O2/5 % de CO2 a été continuellement bullé dans la solution.

5. Échantillonnage, traitement des terminaux et analyse

  1. Échantillonnage temporel
    1. Prélever 50 μL de liquide sérosal de chaque sac digestif à 0, 30, 60, 90 et 120 minutes à l’aide d’une microseringue calibrée. Assurez-vous d’un échantillonnage précis sans introduire de bulles d’air.
    2. Remplacer immédiatement le fluide retiré par 50 μL de solution de Tyrode préchauffée (37 °C) pour maintenir l’équilibre osmotique et le volume interne. Minimiser le temps entre le retrait et le remplacement afin de préserver des conditions expérimentales cohérentes.
      REMARQUE : Lorsque vous utilisez une microseringue (par exemple, la seringue Hamilton), maintenez la stérilité et manipulez doucement pour éviter d’endommager la membrane du sac digestif.
    3. Effectuer un échantillonnage rapide à chaque moment afin de minimiser la perturbation de l’environnement d’incubation.
  2. Détermination du titre du virus
    1. Extraire l’ADN total du fluide sérosal à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique animal disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
    2. Effectuer la quantification absolue du nombre de copies du génome du vecteur rAAV par qPCR. Utiliser un kit vert SYBR avec amorces ITR. Effectuer l’amplification qPCR sur une plaque standard à 96 puits à l’aide d’un thermocycleur avec les conditions de cycle suivantes : Dénaturation initiale : 95°C pendant 10 minutes ; Dénaturation : 95°C pendant 15 s ; Recuissage et extension : 60°C pendant 1 minute ; 40 cycles au total
    3. Pour quantifier le nombre de copies du génome, générez une courbe standard en utilisant des dilutions en série de plasmides rAAV-CMVp-gfp (1 ng, 0,1 ng et 0,01 ng). Utilisez ces dilutions pour calculer le nombre de copies du génome viral en fonction de leurs valeurs de seuil de cycle (Ct) correspondantes.
    4. Déterminer le nombre de copies du génome du vecteur dans le fluide séreux collecté en utilisant la courbe standard. Les résultats ont été rapportés sous forme de copies du génome pour 100 ng d’ADN extrait.
      REMARQUE : Assurez-vous que tous les réactifs et équipements sont stériles afin d’éviter la contamination lors de l’extraction de l’ADN et de l’analyse qPCR. Utilisez des contrôles appropriés pour vérifier la précision de la qPCR, y compris les contrôles sans gabarit (NTC) et les normes plasmidiques.
    5. Effectuer la qPCR en triple exemplaire pour chaque échantillon afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats.
  3. Traitement des tissus terminaux
    1. Aspirez tout le liquide luminal résiduel de chaque sac digestif à l’aide d’une pipette stérile. Manipulez doucement pour éviter la rupture du tissu.
    2. Rincez chaque sac trois fois avec une solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) contenant 1 % de pénicilline–streptomycine (P/S) pour éliminer le milieu résiduel, les bactéries et les impuretés. Assurez-vous d’un lavage approfondi pour maintenir la stérilité en vue des applications en aval.
    3. Coupez le tissu intestinal en fragments de 2mm 3 (2 mm * 2 mm * 0,5 mm) à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles ou de lames. Gardez les fragments de taille uniforme pour une incubation constante.
    4. Incubez les fragments de tissu dans 10 mL de DMEM complétés avec 10 % de FBS et 1 % (v/v) de P/S à 37 °C pendant 48 heures dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. Le milieu de culture doit être rafraîchi toutes les 12 heures pendant l’incubation.
      REMARQUE : Cette étape maintient la viabilité des tissus et permet la récupération cellulaire après l’expérience. Assurez-vous que la muqueuse reste intacte lors de la découpe et du lavage. Effectuez trois lavages complets de PBS pour éliminer les débris et les contaminants microbiens. Maintenez une température constante (37 °C) et une humidité élevée pour soutenir l’activité métabolique et la santé des tissus.
      ATTENTION : Manipulez les fragments de tissu avec des outils stériles et évitez le stress mécanique pour préserver l’intégrité épithéliale.
  4. Analyses post-incubation
    1. Aliquote A (analyse histologique) :
      1. Fixez les échantillons de tissu dans du paraformodéhyde (PFA) à 4 % pendant 24 heures à 4 °C afin de préserver l’architecture cellulaire.
      2. Après fixation, insérez les tissus dans un composé OCT et effectuez une coloration par hématoxyline et éosine (H&E) pour évaluer l’intégrité et la morphologie des tissus.
        ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un fixateur dangereux ; manipulez-le dans une hotte à fumée en utilisant un équipement de protection individuelle approprié
    2. Aliquote B (Analyse de fluorescence et quantification du génome) :
      1. Congelez instantanément le tissu restant dans de l’azote liquide et conservez à -80 °C jusqu’à un traitement supplémentaire.
      2. Utilisez les échantillons congelés pour la microscopie à fluorescence afin de détecter l’expression de l’EGFP, évaluant l’efficacité de la transfection ou l’absorption virale.
      3. Effectuer une extraction d’ADN suivie d’une qPCR pour déterminer le nombre de copies du génome viral ou l’expression du transgène.

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Résultats

Ce protocole a été utilisé pour évaluer l’efficacité de la délivrance génique médiée par AAV9 sur différents segments de l’intestin grêle, ainsi que l’impact du traitement GZNG sur l’amélioration du transfert et de l’expression génique. Plusieurs résultats clés ont été observés, démontrant à la fois la réussite de l’application du protocole et une certaine variabilité pouvant survenir dans certaines conditions.

L’évaluation de l’expression d’EGFP médiée par AA...

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Discussion

Dans cette étude, une nouvelle approche in vitro pour évaluer l’absorption intestinale du rAAV en adaptant le modèle classique du sac intestin éversé a été établie. Cette méthode permet une analyse segmentaire spécifique de l’efficacité de la transduction de l’AAV à travers l’intestin grêle dans des conditions contrôlées et l’évaluation des effets synergiques entre la MTC et le rAAV. Ici, les étapes critiques, le dépannage et les modifications, les limitations, ainsi que leurs a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier tous les collègues et collaborateurs qui ont apporté des discussions précieuses et une assistance technique tout au long de cette étude. Nous apprécions également le soutien institutionnel qui a rendu ce travail possible. Ce travail a été financé par la subvention #82474349 de la National Natural Science Foundation of China (à CL).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMWISENT319-005-CLLiquide, avec 4,5 g/L de D-glucose, avec de la L-glutamine, du phénol rouge et du pyruvate de sodium
Amorces qPCR de la région CDS EGFPTSINGKEF : 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3' ; R : 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Sérum fœtal bovinWISENT086-550Qualité supérieure, qualité primaire en culture cellulaire
Pénicilline-Streptomycine (P/S)WISENT450-201-ELCette solution contient 10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 micro ; g/mL de streptomycine.
PrimeScript RT Master Mix (Temps Réel Parfait)TaKaRaRR036A
Kit universel d’extraction d’ARN TaKaRa MiniBESTTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Ce produit convient aux expériences quantitatives de fluorescence utilisant la méthode SYBR Green dye et est compatible avec divers instruments de PCR quantitative à fluorescence en temps réel.
TSINGKE TSP202-200 Trelief & nbsp ; Kit d’ADN génomique animal Hi-PureTSINGKETSP202-200
La solution de TyrodeYuan YeR20268-500mlIl se compose principalement de chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de magnésium, phosphates, chlorure de calcium, glucose et HEPES.

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Mots-clés

Absorption intestinalesac intestinal versadministration orale d rAAVtransduction g niquepith lium intestinalcaptation du vecteurexpression du transg neagents facilitateurs de l administration

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