Un protocole simplifié et robuste pour l’isolement et l’expansion à long terme des cellules épithéliales primaires de l’endomètre humain

Résumé

La culture primaire des cellules épithéliales endométriales humaines (HEEC) est techniquement complexe. Ce protocole combine la digestion enzymatique mixte avec l’inhibiteur de ROCK (Y-27632) pour améliorer la survie et l’expansion cellulaire tout en maintenant l’identité épithéliale, offrant une base solide pour la recherche sur l’endomètre et les applications régénératives.

Résumé

La recherche sur les troubles endométrials, y compris l’hyperplasie endométriale associée au tamoxifène, a été limitée par l’absence de modèles épithéliaux in vitro robustes. Les méthodes conventionnelles d’isolement des cellules épithéliales endométriales humaines (HEEC) sont souvent inefficaces, techniquement exigeantes et peu évolutives. Ici, un protocole simplifié, sans alimentateur, est décrit qui intègre la digestion enzymatique mixte, la lyse des érythrocytes et un traitement soutenu par inhibiteur ROCK (Y-27632) afin de permettre une isolation et une expansion efficaces des HEEC primaires. L’inclusion de Y-27632 est essentielle pour atténuer l’apoptose induite par la dissociation et renforcer l’adhésion cellulaire à un stade précoce. Cette approche supporte le passage en série tout en maintenant l’identité épithéliale pour au moins 3 passages, avec la morphologie préservée au-delà de 10 passages. La caractérisation par Western blot et immunofluorescence confirme une forte expression de cytokératine 18 et d’E-cadherine, avec une réduction progressive des contaminants stromales positifs à la vimentine sous conditions de culture sélective. En répondant aux principales limites techniques, cette méthode fournit une source fiable et évolutive de cellules épithéliales pour les études mécanistiques, la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et les applications régénératives dans la recherche sur l’endomètre. Le flux de travail standardisé offre une alternative aux systèmes complexes de coculture, facilitant un accès plus large à des modèles cellulaires primaires de haute qualité.

Introduction

Des modèles in vitro fiables sont essentiels pour faire progresser l’étude des troubles endométrials, en particulier ceux associés au tamoxifène (TAM⁾¹. Bien que la TAM soit largement utilisée comme thérapie endocrinienne pour le cancer du sein, son activité partielle d’agoniste œstrogénique dans l’endomètre augmente nettement l’incidence de l’hyperplasie endométriale, des polypes et, dans certains cas, de la transformation^{maligne 2}. La prise en charge clinique actuelle de la pathologie endométriale associée au tamoxifène repose principalement sur la thérapie à la progestérone ou une intervention chirurgicale, qui présentent toutes deux des limites importantes. Le traitement par progestérone est fréquemment associé à des effets indésirables tels que des saignements de rupture et une prise de poids, tandis que les approches chirurgicales peuvent entraîner des lésions endométriales irréversibles et compromettre la^{fertilité 3}. Ces limites soulignent la nécessité de modèles épithéliaux robustes capables de soutenir les études mécanistes et d’aider au développement de stratégies thérapeutiques améliorées. Cependant, les progrès dans ce domaine ont été principalement limités par des défis techniques pour obtenir des cellules épithéliales endométriales humaines (HEEC) de haute pureté et extensibles.

Des travaux fondamentaux dans ce domaine ont été rapportés par Arnold et al. (2001), qui ont isolé des populations cellulaires stromales et épithéliales par digestion de la collagénase et filtration séquentielle au tamis, atteignant une pureté supérieure à 98 % comme confirmé par^{immunocoloration 4}. Malgré son succès, la méthode reposait sur une digestion à enzyme unique, nécessitait un traitement prolongé et reposait sur une filtration progressive pour éliminer les contaminants stromales et érythrocytes, rendant le flux de travail laborieux et difficile à^{standardiser 4}. Plus tard, Yokomizo et al. (2002) ont établi un système de culture HEEC primaire à partir d’échantillons d’hystérectomie à partir d’une co-culture tridimensionnelle avec des cellules nourrisseuses^{stromales 5}. Alors que le microenvironnement alimentateur permettait partiellement la croissance épithéliale, le système ne permettait que des passages limités, généralement pas plus de cinq passages, ce qui limitait son utilité pour les applications nécessitant une expansion épithéliale stable^{à grande échelle 5}.

Pour surmonter ces limites, un protocole simplifié et hautement reproductible pour l’isolement du HEEC et la culture à long terme a été développé. Guidés par des travaux antérieurs démontrant que l’inhibiteur ROCK Y-27632 améliore nettement l’efficacité de la culture primaire pour les kératinocytes humains, les cellules épithéliales gingivales et les cellules épithéliales mammaires, le même principe a été appliqué aux tissus^{endométrials 6,7,8}. Cette approche intègre trois caractéristiques clés : une digestion enzymatique mixte pour favoriser une dissociation tissulaire efficace, une étape essentielle de lyse des érythrocytes pour réduire la contamination précoce et faciliter l’attache épithéliale, ainsi qu’une supplémentation continue en Y-27632 pour supprimer l’apoptose, soutenir l’adhésion et renforcer la capacité proliférative. Grâce à cette stratégie, les HEECs peuvent être étendus sur plusieurs passages tout en maintenant la morphologie épithéliale et une forte expression de CK18 et d’E-cadherine ^9,10. Notamment, le passage en série pendant au moins 3 générations n’a pas entraîné de dérive phénotypique détectable, démontrant la stabilité et la scalabilité du système de culture.

Cette méthode répond directement aux défis techniques de longue date dans la culture HEEC primaire, notamment des besoins élevés en entrée tissulaire, des flux de travail complexes, une faible reproductibilité et un potentiel d’expansion limité. En préservant l’identité épithéliale et les caractéristiques fonctionnelles tout au long du passage, le protocole offre une plateforme fiable pour la recherche sur la régénération endométriale, la physiopathologie, le dépistage à haut débit des médicaments et les interactions cellule–biomatériau. En intégrant le traitement tissulaire à l’expansion en série, ce flux de travail standardisé traite un goulot d’étranglement ancien en biologie reproductive et soutient les applications futures en ingénierie tissulaire, médecine régénérative et thérapie personnalisée.

Ce protocole nécessite des échantillons de tissus frais, de préférence traités dans les 24 heures suivant la collecte. Les caractéristiques de rendement et de croissance cellulaire peuvent varier selon la source tissulaire, comme les polypes endométrials par rapport à l’endomètre normal. Les sources courantes d’échec incluent une digestion tissulaire incomplète, une contamination excessive par des érythrocytes ou une supplémentation insuffisante en Y-27632. Bien que le système supporte l’expansion à travers plusieurs passages, une optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour maintenir la stabilité phénotypique lors d’une culture prolongée.

Protocole

Des échantillons frais de tissu endométrial ont été prélevés à partir d’échantillons de polypes utérins réséqués chirurgicalement sur des patientes du Premier Hôpital affilié de l’Université médicale chinoise du Zhejiang. Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le Comité d’éthique médicale du Premier Hôpital affilié de l’Université médicale chinoise du Zhejiang (Protocole n° 2025-KLS-569-01 ; approuvé le 14 septembre 2025). La manipulation des échantillons humains primaires a été effectuée dans une armoire de sécurité biologique de classe II à l’aide d’équipements de protection individuelle appropriés, comprenant des blouses de laboratoire, des gants et des protections oculaires. Tous les réactifs enzymatiques ont été manipulés conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité et aux directives des fiches de données de sécurité des matériaux (MSDS).

1. Acquisition des tissus

1. Prélèvez du tissu endométrial frais à partir d’échantillons chirurgicaux prélevés sur des femmes adultes. Transférer le tissu dans des tubes stériles contenant 10 mL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) complétée avec 3 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
   REMARQUE : Tous les tissus doivent être traités dans les 24 heures suivant la collecte chirurgicale.

2. Prétraitement des tissus

1. Agitez le tissu dans une solution de lavage (Tableau 1) pendant deux lavages consécutifs de 2 minutes chacun pour éliminer le mucus et les caillots sanguins.
2. Rincez brièvement le tissu dans 5 mL d’éthanol à 75 % pendant 5 secondes pour désinfecter la surface.
3. Transférez immédiatement le tissu dans 20 mL de solution de lavage et lavez pendant deux lavages, chacun de 5 minutes, pour éliminer l’éthanol résiduel.
   REMARQUE : Comme l’éthanol est inflammable, effectuez cette étape pour éviter les flammes ouvertes et éliminez les déchets contenant de l’éthanol conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.

3. Digestion des tissus et prélèvement cellulaire

1. Hachage de tissus
   1. Réduisez le tissu endométrial avec deux lames stériles jusqu’à ce que des fragments (~2^{mm 3}) puissent être aspirés à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL (environ 10 minutes).
   2. Transférez le tissu haché dans un tube centrifugeuse de 50 mL.
2. Digestion enzymatique
   1. Ajoutez 10 mL de solution digestive (Tableau 1) au tube contenant les fragments de tissu.
   2. Faites couver le tube dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 minutes. Secouez doucement le tube toutes les 15 minutes pour faciliter la digestion.
   3. Poursuivre l’incubation jusqu’à ce que les fragments de tissu soient visiblement dissociés et que la solution paraisse trouble à cause des cellules libérées.
3. Arrêt de la digestion
   1. Ajoutez 10 mL de solution neutralisante pour arrêter la digestion enzymatique.
   2. Mélangez soigneusement en pipettant environ 15 fois avec une pipette P1000 réglée à 800 μL.
4. Filtration et centrifugation
   1. Filtrez la suspension digérée à travers un filtre à maille de 100 μm.
   2. Centrifugez à 156 × g pendant 5 minutes à 25 °C.
5. Lyse des globules rouges (globules rouges)
   1. Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille.
   2. Resuspendez la pellete cellulaire dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges pré-refroidi.
   3. Incubez sur la glace (environ 4 °C) pendant 3 à 5 minutes avec une légère agitation.
6. Arrêt de la lyse
   1. Ajoutez ≥10 mL de PBS ou de médium complet pour arrêter la réaction de lyse.
   2. Centrifugez à 156 × g pendant 5 minutes à 25 °C.

4. Initiation de la culture primaire

1. Lavage et centrifugation
   1. Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille.
   2. Resuspendez le pellet dans 20 mL de solution neutralisante.
   3. Mélangez en pipettant environ 15 fois.
   4. Centrifugez à 156 × g pendant 5 minutes à 25 °C.
2. Resuspension et ensemencement
   1. Aspirez le surnageant.
   2. Resuspendez doucement la granule cellulaire dans 10 mL de milieu de culture initial contenant 10 μM Y-27632 en pipettant lentement de haut en bas 8 à 10 fois à l’aide d’une pipette de 1 mL.
   3. Placez la suspension de la cellule dans une boîte de culture de 100 mm.
      REMARQUE : Pour une densité initiale d’ensemencement optimale, sélectionnez le récipient de culture selon le rendement estimé de la cellule. Si le rendement attendu est >1 × 10⁶ cellules, utilisez un plat de 100 mm, et pour des rendements plus faibles, un plat de 60 mm. Ajustez le volume moyen en conséquence (par exemple, 10 mL pour une antenne de 100 mm ; 4 mL pour une antenne de 60 mm).
3. Conditions culturelles
   1. Incubez le plat à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   2. Remplacer le milieu par un nouveau substrat de culture épithéliale sans Y-27632 tous les 3 jours.
      REMARQUE : Surveillez l’attachement cellulaire et la morphologie ; Un milieu de renouvellement tous les deux jours une fois que les cellules commencent à proliférer.

5. Passage cellulaire

1. Préparation à la trypsinisation
   1. Lorsque les cultures atteignent une confluence de 80 % à 90 %, retirez la plaque de 100 mm de l’incubateur.
   2. Jetez le médium usé.
   3. Rincez les cellules deux fois avec 2 mL de PBS.
   4. Aspirez soigneusement et retirez tout PBS restant.
2. Trypsinisation
   1. Ajoutez 2 mL de trypsine à 0,05 % dans le plat.
   2. Faites doucement tourner pour assurer une couverture uniforme de la couche cellulaire.
   3. Incubez à 37 °C pendant 7 minutes.
   4. Examinez les cellules au microscope (objectif 40x) pour confirmer le décollement.
3. Neutralisation et collecte
   1. Ajoutez 8 mL de solution neutralisante pour arrêter la digestion de la trypsine (trypsin).
   2. Transférez la suspension de la cellule sur un tube centrifugeuse de 15 mL.
   3. Pipette environ 15 fois pour obtenir une suspension à cellule unique.
   4. Centrifugez à 156 × g pendant 5 minutes à 25 °C.
4. Resuspension et re-ensemencement
   1. Aspirez le surnageant sans déranger la pastille.
   2. Reposez doucement le pellet cellulaire dans 10 mL de milieu cellulaire épithélial en pipettant environ 10 fois à l’aide d’une pipette de 1 mL.
   3. Semez 1 × 10⁶ cellules dans 10 mL de milieu cellulaire épithélial dans un nouveau plat de 100 mm.
   4. Ajustez la densité de semis pour favoriser des cellules isolées et bien dispersées ou de petits grappes le lendemain, évitant ainsi la surpopulation.
5. Entretien après passage
   1. Incuber dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % CO₂).
   2. Observez régulièrement la culture et remplacez le milieu cellulaire épithélial tous les deux jours.
      REMARQUE : Les cellules sont généralement prêtes pour des applications en aval après le premier ou le deuxième passage, une fois qu’une monocouche saine et adhérente avec une confluence de ≥80 % est obtenue.
      ATTENTION : Tous les matériaux entrés en contact avec des cellules humaines primaires ont été traités comme des risques biologiques potentiels. Avant leur élimination ou leur traitement supplémentaire, ces matériaux étaient désinfectés à l’aide d’eau de Javel à 10 %, conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.

Résultats

L’établissement réussi du système primaire de culture HEEC a été confirmé par des évaluations morphologiques, prolifératives et moléculaires, comme indiqué à la Figure 1. En combinant la digestion enzymatique mixte, la lyse des érythrocytes et un inhibiteur de ROCK, ce protocole permettait une isolation efficace et une expansion stable des cellules épithéliales à partir du tissu endométrial humain.

Des observations morphologiques ...

Discussion

Établir un modèle in vitro fiable des cellules épithéliales endométriales humaines (HEEC) est essentiel pour étudier la biologie et la pathologie de^{l’endomètre 11}. Bien que plusieurs méthodes aient été développées pour l’isolation HEEC, la plupart restent limitées par leur complexité technique, leur faible efficacité et leur potentiel d’expansion^{restreint 4,5}. De nombreux protocoles reposent égale...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dispase  ;	Solarbio	CAS : 42613-33-2	Pour l’isolement des HEEC
Collagénase de type I	Merck	SKU : SCR103	Pour l’isolement des HEEC
100 & micro ; Filtre en maillage m	Solarbio	431752	Pour la filtration HEEC
Rabbit Anti CK18	Abcam	ab133263	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HEEC
Rabbit anti-CDH1	Abcam	ab40772	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HEEC
Rabbit anti VIM	Abcam	ab16700	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HEEC
4 % de paraformoldéhyde	Solarbio	P0099	Pour la coloration par immunofluorescence afin de vérifier le marqueur de différenciation des HEEC
Incubateur à CO2	Thermo Scientific	42820906	Pour l’incubation cellulaire
Centrifugeuse	Eppendorf	5404HN133048	Centrifugeuse à cellules
Antenne de culture cellulaire de 100 mm	Corning	430167	Pour la culture cellulaire
Tube centrifugeuse de 50 ml	Corning	430829	Pour la centrifugation à cellules
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 ml	NEST	081722CK01	Pour la digestion cellulaire
Filtre cellulaire	Solarbio	431752	Filtration cellulaire
Solution tamponnée au phosphate	Tecono	20201033	Solution de lavage
DMEM	Gibco	8122622	Composant du milieu de neutralisation
Pénicilline/Streptomycine	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotiques
Sérum fœtal bovin	Gibco	2556132P	Composant du milieu de neutralisation
0,05 % de trypsine	Base des bandes	K431010	Pour les HEECs et nbsp ; Dissociation
Y-27632	Solarbio	IY0040	Inhibiteur de ROCHE
Tampon de lyse des globules rouges	Solarbio	R1010	Lyse des globules rouges
1 % Triton X-100 & nbsp ;	Thermo Scientific	HFH10	Perméabilisation membranaire
IgG anti-Lapin de l’âne	Thermo Scientific	A32790TR	Anticorps secondaire
DAPI	Thermo Scientific	62248	Coloration de l’ADN
1 x PBST	Solarbio	P1031	Tampon de lavage
Médium dédié pour les HEEC primaires	iCell	iCell-f004-002h	Pour la culture HEEC
Microscope confocal inversé	Zeiss  ;	LSM880	Utilisé pour acquérir des images d’immunofluorescence ; équipé de 40x
Lignée cellulaire MRC-5	iCell	iCell-h146  ;	lignée cellulaire adénocarcinome endométrial humain ; STR profilé.
Lignée cellulaire d’Ishikawa	iCell	iCell-h113  ;	lignée cellulaire adénocarcinome endométrial humain ; STR profilé.