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Évaluation de l’activité métabolique des ventricules entiers régénérateurs de poisson-zèbre ex vivo à l’aide d’un test de flux extracellulaire

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DOI :

10.3791/70459

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17 avril 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour quantifier le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire des ventricules de poisson-zèbre adultes ex vivo afin de caractériser leur capacité métabolique oxydative et glycolytique.

Résumé

La capacité des poissons-zèbres à régénérer leur cœur tout au long de l’âge adulte est en partie attribuée à des adaptations métaboliques. Bien qu’il ait été émis l’hypothèse que le cœur du poisson dépend fortement de la glycolyse, des études récentes ont révélé un profil métabolique plus complexe dans lequel le métabolisme oxydatif apparaît comme un élément essentiel de la redifférenciation des cardiomyocytes et de la régénération cardiaque réussie à un stade avancé. En 2025, nous avons adopté une méthode à haut débit pour évaluer le profil métabolique des ventricules entiers du poisson-zèbre ex vivo, en utilisant le test de l’hippocampe (test de flux extracellulaire). Cette méthode permet une évaluation rapide et en temps réel du taux de consommation basal et maximale d’oxygène (OCR) ainsi que du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) à l’aide du test de contrainte XF Mito sur l’analyseur Seahorse XFe24. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour réaliser une analyse du flux extracellulaire sur des ventricules entiers du poisson-zèbre. La capacité à quantifier l’OCR et l’ECAR dans des cœurs entiers vivants ex vivo offrira l’opportunité d’élucider le métabolisme cardiaque à des moments critiques du développement, de la progression de la maladie et de la régénération.

Introduction

Contrairement aux humains, les poissons-zèbres (Danio rerio) conservent la capacité de régénérer les tissus cardiaques perdus tout au long de leur vieadulte 1. En cas de lésion cardiaque, les cardiomyocytes de la zone bordante de la plaie se dédifférencient et réentrent dans le cyclecellulaire 2,3 afin de rétablir le nombre de cardiomyocytes4 et de repeupler la plaie. Récemment, l’importance de la différenciation des cardiomyocytes dans le processus régénératif a étéreconnue 5. Ces deux processus sont étroitement régulés par des changements métaboliques dans le cœur du poisson-zèbre, la glycolyse favorisant la prolifération 6,7 et la phosphorylation oxydative (OXPHOS) favorisantla redifférenciation 8. Bien que les méthodes pharmacologiques et génétiques pour manipuler le métabolisme soient répandues dans le domaine de la régénération 6,7, la validation des effets métaboliques de ces perturbations reste difficile en raison de la petite taille du cœur du poisson-zèbre, qui nécessite une configuration complexe et personnalisée pour la canulation 9,10,11 ou le regroupement de plusieurs cœurs pour la spectrométriede masse 12 ou la spectroscopie RMN 8, 13.

Afin de contourner ces limites, nous avons récemment décrit l’utilisation de l’analyseur Seahorse XFe24 pour le profilage métabolique à haut débit des ventricules entiers du poisson-zèbre exvivo 8. Le test de flux extracellulaire est conçu pour mesurer le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des cellules, des îlots pancréatiques et des sphéroïdes. Cela est réalisé grâce à des capteurs à semi-conducteurs qui détectent respectivement les variations de concentration en oxygène et en protons (pH) dans les milieux résultant respectivement de l’utilisation de la chaîne de transport d’électrons respiratoires de la production d’oxygène et de lactate dépendante de la glycolyse (Figure 1A)14.

L’analyse de flux extracellulaire peut être réalisée sur un ensemble de plaques à 96 puits (XFe96 et XF Pro), des miniplates à 8 puits, ou diverses versions de plaques à 24 puits (XFe24). Bien que les plaques à 96 puits offrent un débit plus élevé, la distance de travail entre le capteur et le fond du puits n’est pas adaptée pour accueillir un ventricule entier de poisson-zèbre. De plus, sur le format à plaques à 96 puits, il n’est pas prévu de fixer le ventricule au fond du puits afin d’empêcher qu’il ne flotte dans le milieu et n’interfère avec les capteurs. En revanche, la microplaque de capture des îlots XFe24 a été initialement conçue pour la caractérisation métabolique des îlots pancréatiques primaires et, par conséquent, permet le dépôt du tissu au fond du puits, qui est ensuite fixé par un écran (grille). En raison de la petite taille du cœur du poisson-zèbre, nous avons pu adapter la microplaque de capture des îlots pour être utilisée sur les ventricules du poisson-zèbre, qui restent maintenus sous la grille pendant toute la durée du test.

Pour évaluer la capacité respiratoire mitochondriale, nous avons utilisé le test de contrainte de Mito, dans lequel quatre inhibiteurs de la chaîne de transport électronique et la synthase adénosine triphosphate (ATP) ont été utilisés (Figure 1A). Tout d’abord, des mesures de base de l’OCR sont acquises (Figure 1B, magenta). Ensuite, l’oligomycine, un inhibiteur complexe du V, est injectée. L’oligomycine inhibe l’activité de l’ATP synthase et conduit ainsi à une réduction de l’OCR, attribuable à la production d’ATP (Figure 1B, vert). La consommation d’oxygène restante résulte d’une respiration non couplée et d’une consommation d’oxygène non mitochondriale (Figure 1B, orange et gris, respectivement)15. Après l’oligomycine, la FCCP est injectée, dissipant le gradient de protons à travers la membrane mitochondriale (Figure 1A). Dans une tentative de restaurer le gradient de protons, les mitochondries régulent à l’augmentation leur consommation d’oxygène à leur capacité maximale (Figure 1B, bleu). Enfin, un mélange de roténone et d’antimycine A est utilisé pour inhiber respectivement les complexes I et III (Figure 1A). Cette combinaison de médicaments conduit à l’arrêt complet de l’activité de la chaîne de transport d’électrons respiratoires mitochondriaux en raison du manque de flux électronique des complexes I et III vers le complexeIV 15. Cela permet de mesurer la consommation d’oxygène non mitochondriale (Figure 1B, gris).

Dans l’ensemble, grâce à la microplaque de capture des îlots avec le test de stress de Mito, nous avons pu évaluer rapidement et de manière reproductible la capacité métabolique oxydative et glycolytique des ventricules entiers du poisson-zèbre ex vivo. Nous décrivons ci-dessous le protocole détaillé de cette procédure. Enfin, nous montrons la survie de ventricules isolés de type sauvage non blessés ex vivo dans l’analyseur de flux extracellulaire, et nous validons le test de stress de Mito 14 jours après la cryolésion (dpci) ventricules transgéniques de poisson-zèbre8.

Protocole

Toutes les procédures décrites ci-dessous impliquant des animaux ont été réalisées conformément à la loi révisée sur les Animaux (Procédures Scientifiques) de 1986 au Royaume-Uni et à la directive 2010/63/UE en Europe, et ont été approuvées par le Comité central sur les soins et l’éthique des animaux de l’Université d’Oxford.

REMARQUE : Ce protocole a été réalisé à l’aide d’un analyseur Seahorse XFe24 et du milieu DMEM Seahorse sans phénol rouge ni bicarbonate.

1. Cryolésie cardiaque du poisson-zèbre (optionnelle)

  1. Obtenez l’approbation éthique appropriée de l’institution locale et des autorités nationales avant de commencer l’expérience.
  2. Effectuer une cryolésie sur les cœurs de poisson-zèbre comme décritprécédemment 16, 17, 18.

2. Hydratation de la cartouche captrice

  1. Ouvrez le kit de test de flux extracellulaire et chargez la plaque utilitaire à 24 puits (Figure 2A) en pipettant 500 μL de la solution calibrante par puits.
  2. Fermez la plaque utilitaire à l’aide de la cartouche capteur et du surappoint hydroélectrique (Figure 2A).
  3. Incubez la cartouche et la plaque utilitaire dans un incubateur humidifié à 37 °C toute la nuit (18–72 h). Gardez le couvercle sur la cartouche capteur pendant toute l’incubation.

3. Préparation des solutions médicamenteuses et des médias

  1. Préparez des solutions d’origine des médicaments : dissoudre l’oligomycine dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 10 mM, le cyanure de carbonyle 4-(trifluoromethoxy)phénylhydrazone (FCCP) dans le DMSO à une concentration de 5 mM, la roténone dans le DMSO à une concentration de 10 mM et l’antimycine A dans l’éthanol à une concentration de 10 mM, puis conserver à -20 °C si elle n’est pas utilisée immédiatement.
    REMARQUE : Il est recommandé de préparer des solutions fraîches d’oligomycine, de roténone et d’antimycine tous les 2 à 3 mois, ainsi que des solutions FCCP à chaque fois avant de réaliser le test.
  2. Préparez la concentration de travail des médicaments (500 μM d’oligomycine, 300 μM de FCCP, 450 μM de chaque mélange roténone/antimycine A) en diluant la solution d’origine dans un milieu DMEM. Assurez-vous que le volume final pour les concentrations de travail soit de 1,5 mL pour l’oligomycine, 1,65 mL pour la FCCP et 1,8 mL pour la roténone/antimycine A, permettant de charger 30 ports (24 ports par inhibiteur sur la cartouche plus 6 ports supplémentaires par médicament pour corriger les erreurs de pipetage).
    REMARQUE : Une partie de la précipitation apparaîtra dans la roténone/antimycine A, mais après un bon mélange, elle sera minimisée. Notez que les concentrations indiquées dans la 3.2 sont 10 fois supérieures à la concentration finale des médicaments lorsqu’ils seront injectés dans les puits.
  3. Préparez le milieu DMEM (pH 7,4) pour contenir 10 mM de glucose, 1 mM de pyruvate et 2 mM de glutamine, et conservez-le à -20 °C jusqu’à utilisation.

4. Activation de l’analyseur de flux extracellulaire

  1. Allumez l’analyseur depuis le bouton latéral toute la nuit avant le test pour permettre l’équilibre de la température avec l’environnement.
  2. Allume l’ordinateur et ouvre le logiciel Wave.
  3. Sélectionnez le test de stress Mito sur le logiciel.
  4. Éteignez le chauffage dans le coin inférieur gauche du logiciel afin que la température dans l’analyseur descende en dessous de 37 °C et atteigne 28–29 °C pour approcher la température standard de l’élevage de poissons-zèbres19.
  5. Définissez la stratégie d’injection sur la page des définitions du groupe (sous l’onglet stratégies d’injection ) en ajoutant les composés qui seront déposés dans chaque port depuis le catalogue des composés. Pour le test de stress Mito, ajoutez de l’oligomycine dans le port A, FCCP dans le port B, et la roténone/antimycine dans le port C. Il y a une capacité pour l’ajout d’un médicament supplémentaire dans le port D, qui n’est pas utilisé dans ce protocole.
  6. Supprimez toutes les autres stratégies préconçues présentes sous l’onglet stratégies d’injection une fois la stratégie expérimentale définie. Spécifiez les groupes expérimentaux (par exemple, wild-type et mutant) du côté Groupes de la page, et précisez la stratégie d’injection qu’ils recevront (celle définie à l’étape 4.5). Assurez-vous que les stratégies d’injection correspondent aux groupes et correspondent également à la stratégie d’injection conçue.
  7. Sur la page de la carte des plaques , spécifiez la position de chaque échantillon sur la plaque à 24 puits en cliquant sur chaque groupe puis sur les puits qui contiendront les échantillons.
    1. Notez que quatre des puits ne sont pas adaptés au dépôt d’échantillons (Figure 2B) et servent de blancs destinés à la correction de fond. Assurez-vous que les échantillons de chaque groupe sont répartis uniformément sur la plaque afin d’équilibrer les biais de position potentiels dans les mesures ou les conditions environnementales.
  8. Sur la page du protocole , retirez l’onglet Contrôle ou Expérimental si aucun inhibiteur supplémentaire autre que ceux mentionnés ci-dessus n’est utilisé, et assurez-vous que les ports logiciels correspondent à la position des médicaments sur la cartouche.
  9. Le logiciel définit automatiquement 3 cycles de mélange, d’attente et de mesure par condition. Modifier le nombre de cycles à 10 mesures de base (non traitées), 3 d’oligomycine, 7 de FCCP et 9 de roténone/antimycine A afin de permettre des traces stables et que les inhibiteurs agissent sur le tissu 3D. Assurez-vous que chaque cycle comprend 3 minutes de mélange, 2 minutes d’attente et 3 minutes de mesure.

5. Étalonnage des analyseurs

  1. Retirez la cartouche et la plaque utilitaire de l’incubateur humidifié (voir les étapes 2.1–2.3).
  2. Retirez le surappoint hydroélectrique et le couvercle (Figure 2A) de la cartouche et placez la cartouche capteur sur la plaque utilitaire contenant le calibrant.
  3. Pipettez doucement les inhibiteurs dans leurs ports respectifs tout en touchant la paroi latérale du port avec la pointe de la pipette, assurant un flux fluide du liquide : 50 μL d’oligomycine dans le port A, 55 μL de FCCP dans le port B, et 60 μL de roténone/antimycine A dans le port C (Figure 2C).
    1. Notez que le liquide n’est maintenu en place que par la tension superficielle au niveau du trou du port, il faut donc éviter de pipetter ou de scotcher brusquement la cartouche à partir de cette étape. Assurez-vous qu’aucun liquide ne pénètre dans le port du capteur (Figure 2C) car cela endommagerait l’analyseur.
  4. Cliquez sur démarrer sur le logiciel, nommer l’exécution, puis enregistrez-la sur l’ordinateur. À ce moment-là, le plateau de l’analyseur s’ouvre pour placer la cartouche et la plaque utilitaire.
  5. Placez la cartouche chargée avec les médicaments et la plaque utilitaire contenant le calibrant sur le plateau de l’analyseur selon la carte de la plaque sur le plateau (puits A1 en haut à gauche) et assurez-vous qu’elle est bien ajustée. Retirez le survoltage de la borne d’incendie et le couvercle (Figure 2A) de la plaque avant de la charger sur le plateau. Ne pas le faire endommagera l’analyseur.
  6. Une fois prêt, demandez au logiciel de commencer l’essai en appuyant sur exécuter l’essai. À ce moment-là, l’analyseur reçoit le plateau chargé et lance l’étalonnage.
  7. Commencez l’isolement cardiaque (voir les étapes 6.1–6.12). L’étalonnage durera environ 40 minutes, mais la plaque peut être conservée dans l’analyseur aussi longtemps qu’il le faut pour isoler les cœurs et les placer dans la microplaque de capture des îlots (Figure 2B,D).

6. Isolement des cœurs de poisson et chargement sur la plaque de l’îlot à 24 puits

  1. Ouvrez la microplaque de capture des îlots et chargez la plaque d’îlot à 24 puits avec 500 μL de DMEM (10 mM de glucose, 1 mM de pyruvate, 2 mM de glutamine) à température ambiante.
  2. Placez toutes les grilles dans une boîte de Petri de 35 mm contenant un milieu DMEM à température ambiante, afin de s’assurer qu’elles sont complètement immergées et exemptes de grosses bulles.
  3. Préparez une boîte de Petri supplémentaire de 35 mm contenant du DMEM (10 mM de glucose, 1 mM de pyruvate, 2 mM de glutamine) à température ambiante. Cela servira à rincer les cœurs lors de la collecte et à disséquer le ventricule des oreilles et de l’artérieux bulbeux.
  4. Éliminez un poisson dans un MS-222 de 5 g/L et vérifiez l’absence de réflexes.
  5. Placez le poisson sur une éponge fixée sur une boîte de Petri de 92 mm, ouvrez sa cavité cardiaque, puis disséquez le cœur comme décritprécédemment 16,20.
  6. Rincez les cœurs dans la boîte de Petri de 35 mm contenant du DMEM (10 mM de glucose, 1 mM de pyruvate, 2 mM de glutamine) à température ambiante.
  7. Retirez l’oreillette et le bulbus artérieux à l’aide des pinces dans la boîte de Petri de 35 mm.
  8. Secouez doucement et pressez le ventricule pour que le sang s’écoule de sa lumière. Ne pas endommager la paroi ventriculaire lors du lavage du cœur.
  9. Transférez le cœur vers son puits désigné sur la microplaque de capture de l’îlot et laissez-le s’enfoncer au centre du puits approprié selon la carte des plaques. Maintenez la plaque à température ambiante. Incluez tous les ventricules dans le test, même s’ils cessent de battre visiblement.
  10. Répétez le processus pour tous les poissons disponibles. Si vous comparez l’activité métabolique de différents groupes expérimentaux, nous suggérons d’isoler un cœur par groupe plutôt que tous les cœurs d’un groupe avant de passer au suivant. Bien que les cœurs puissent survivre au moins 180 minutes dans l’analyseur (Figure 3A), nous proposons que l’isolement se fasse un cœur par groupe à la fois, comme bonne pratique pour garantir une répartition égale du temps dans le milieu des groupes à la fois.
  11. Une fois tous les cœurs isolés (environ 60 minutes pour une plaque de 20 cœurs), posez-les au fond des puits de microplaques de capture des îlots (Figure 2B), et placez-les au centre du puits à l’aide de pinces fines (Figure 2D, E).
  12. Utilisez une pince pour les couvrir avec la grille (environ 20 minutes) (Figure 2D). Assurez-vous que la grille est dans la bonne orientation (maille orientée vers le bas vers le cœur) et ne contient pas de grosses bulles, car cela pourrait interférer avec les mesures (Figure 2E).
    1. Une fois la grille en place, utilisez la pince pour la pousser en place depuis les bords jusqu’à ce qu’un léger clic se fasse entendre. Veillez à ne pas faire crasher le cœur avec la pince à travers la grille.

7. Chargement des échantillons sur l’analyseur et acquisition des mesures

  1. Une fois les cœurs enfermés dans la microplaque de capture de l’îlot, vérifiez sur le logiciel que tous les puits ont été calibrés avec succès, comme indiqué par des marques de coche vertes sur l’écran de l’ordinateur. Éjectez maintenant la plaque utilitaire en appuyant sur la plaque ouverte.
    REMARQUE : La cartouche ne sera pas éjectée à ce stade, et seule la plaque utilitaire contenant le calibrant apparaîtra.
  2. Échangez la plaque utilitaire contre la microplaque d’îlot contenant les échantillons sur le plateau analyseur. Assurez-vous que la microplaque de l’îlot est correctement positionnée (A1 dans le coin supérieur gauche) et que le couvercle a été retiré. Ne pas retirer le couvercle endommagera l’analyseur.
  3. Une fois la plaque de l’îlot positionnée, demandez au logiciel d’initier l’expérience en appuyant sur la plaque à cellule de charge. Pendant environ les dix premières minutes, les capteurs effectuent une étape d’équilibre, puis les mesures commencent.
  4. Une fois l’expérience terminée (environ 4 heures), on presse la cartouche d’éjection pour ouvrir le plateau et éjecter la microplaque et la cartouche de l’îlot.
  5. Retirez la microplaque et la cartouche de l’îlot, puis appuyez sur la fin pour que le plateau se referme. À ce stade, appuyez sur voir les résultats pour voir les données collectées.
  6. Sauvegardez les mesures, exportez-les depuis l’ordinateur analyseur, puis téléchargez-les sur l’interface analytique pour une analyse et un traitement ultérieurs. Cela déclenchera l’excision de la plaque et de la cartouche de l’îlot de l’analyseur.
  7. Retirez la plaque et la cartouche de l’analyseur et fermez la cartouche avec le couvercle.
  8. Congelez la plaque d’îlot sur de la glace sèche ou retirez les cœurs des puits (voir étape 8.2) et stockez à -20 °C si l’isolement protéique pour normalisation (étape 8) n’est pas effectué immédiatement.
  9. Une fois les données sauvegardées, éteignez le logiciel, l’analyseur et l’ordinateur.
  10. Téléchargez les données sur l’interface analytique et visualisez-les en sélectionnant le graphique OCR dans l’option de vues standard . Sur l’interface, voyez les données au niveau ou à la vitesse OCR et CAR, corrigez l’arrière-plan en fonction des puits vides, et sélectionnez les puits à visualiser en cliquant sur la carte des plaques pour les faire apparaître ou disparaître.

8. Isolement et quantification des protéines pour la normalisation

  1. Préparez un tampon de radioimmunoprécipitation contenant inhibiteur de protéase (RIPA) en dissolvant un comprimé inhibiteur de protéase dans 10 mL de tampon RIPA et en mélangeant bien.
  2. Si ce n’est pas déjà fait (étape 7.8), en utilisant l’outil d’insertion d’écran de capture d’îlots (Figure 2F), retirez les grilles de la plaque de l’îlot pour libérer les cœurs. Retirez soigneusement les cœurs, car ils pourraient rester coincés sur la grille. Si c’est le cas, utilisez les pinces pour les libérer. Si la grille ne peut pas être retirée à l’aide de l’outil d’insertion de l’écran, déplacez la plaque sous le stéréoscope et, à l’aide de ciseaux de microdissection, coupez soigneusement la grille pour libérer le cœur.
  3. Placez chaque ventricule dans un tube de 1,5 mL contenant 200 μL de tampon RIPA enrichi d’inhibiteur de protéase sur glace.
  4. Homogénéisez le cœur à l’aide d’un homogénéiseur avec des pilons jetables sur glace.
  5. Préparez les étalons en diluant l’albumine sérique bovine (BSA) fournie dans le tampon RIPA aux concentrations suivantes : 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Préparez la solution de travail Pierce BCA (50:1, réactif A : réactif B, selon les instructions du fabricant). Calculez le volume de réactif actif nécessaire à l’aide de la formule suivante :
    (nombre d’étalons + nombre d’échantillons) × 2 × 200 μL
    REMARQUE : Ce volume permet l’utilisation de 200 μL de solution de travail par échantillon et par standard, et permet l’acquisition de mesures en double par échantillon et par standard.
  7. Dans une plaque à 96 puits, ajoutez 25 μL de chaque étalon et chaque échantillon par puits en duplicatas.
  8. Ajoutez 200 μL de solution de travail par puits.
  9. Incubez l’assiette à 37 °C pendant 30 minutes.
  10. Laissez la plaque refroidir à température ambiante pendant 10 minutes et scellez-la avec un scellant pour plaques. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans les puits, car cela pourrait obstruer le lecteur de plaques. Si un nombre limité de bulles se forme, utilisez une embout ou une pince fine pour les éclater.
  11. Mesurez l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
  12. Générez une courbe standard basée sur l’absorption des étalons et calculez la concentration en protéines des échantillons.
  13. Notez la concentration en protéines dans l’onglet de normalisation (Figure 2G) de l’interface analytique pour chaque puits.

9. Analyse des données

  1. Après normalisation par rapport à la teneur en protéines, exportez les données depuis l’interface analytique sous forme de fichiers Excel ou Prism pour une analyse plus approfondie en utilisant le bouton cloud en haut à droite du graphique.
  2. En utilisant les données normalisées, calculez l’OCR et l’ECAR de référence comme moyenne des mesures de base, en excluant les trois premières acquisitions, car le signal peut être instable lors des premières mesures.
  3. À partir des données normalisées, pour spécifier le maximum d’OCR et d’ECAR, calculez les mesures moyennes des trois principales acquisitions du traitement FCCP.

Résultats

Ce protocole permet de quantifier l’OCR et l’ECAR des ventricules entiers du poisson-zèbre. Nous avons validé la survivabilité des ventricules en environnement ex vivo en incubant des ventricules de type sauvage non blessé de type KCL dans l’analyseur en l’absence de traitement médicamenteux (Figure 3A). Les données indiquent que les ventricules ont un OCR et un ECAR stables, qui sont significativement élevés par rapport aux mesures de base des puits vides pendant au moins 180 minutes (Figure 3A). Ces données suggèrent que les ventricules présentent une fonction respiratoire normale et une survie dans ce contexte ex vivo .

Nous avons effectué plusieurs mesures OCR en utilisant différentes concentrations de médicaments et formulations de milieux pour identifier la dose optimale pour les ventricules (Figure 3B). Nous avons observé une légère augmentation du changement du pli de l’OCR (FCCP/basal) en utilisant les combinaisons [oligomycine] 10 μM, [FCCP] 8 μM, et [roténone/antimycine] 25 μM, ainsi qu’une augmentation légèrement plus importante de [oligomycine] 50 μM, [FCCP] 30 μM, et [roténone/antimycine] 45 μM (Figure 3B). En conséquence, nous avons poursuivi avec ces dernières concentrations pour nos expériences. Comme le ventricule est une structure 3D, il est possible que les médicaments agissent fortement sur les cellules externes du tissu sans atteindre les cellules du côté luminal du ventricule. Pour y remédier, nous avons effectué une étape de perméabilisation où nous avons traité les cœurs avec de la saponine 0,5 % pendant 30 minutes avant l’incubation dans le DMEM (10 mM de galactose, 1 mM de pyruvate, 4 mM de glutamine). Cela a entraîné une réduction soutenue de la TOC et l’absence de l’augmentation attendue de la POC après l’injection de FCCP (Figure 3C), suggérant que les cœurs étaient métaboliquement défaillants. Par conséquent, nous n’avons pas perméabilisé les ventricules pour nos expériences.

De plus, nous présentons ici les traces normalisées de notre expérienceoriginale 8. En tirant parti de la variation naturelle du potentiel régénératif de sept souches sauvages de poisson-zèbre, nous avons identifié le mdh1ab, la malate déshydrogénase cytosolique 1Ab, comme ayant un effet bénéfique sur la régénération par la redifférenciation cardiomyocytaire. Pour valider cette conclusion, nous avons produit des poissons-zèbres transgéniques surexprimant mdh1ab de manière spécifique au cardiomyocyte (mdh1ab cOE) et des poissons témoins surexprimant la protéine fluorescente verte (GFP c OE). Nous avons cryoiné leurs ventricules, prélevé à 14 dpci, et étudié leur métabolisme à l’aide du test de contrainte Mito (Figure 3D). Le traitement à l’oligomycine n’a pas modifié significativement l’OCR, bien qu’une légère augmentation de la RCE ait été observée. L’injection de FCCP dans le milieu a entraîné l’augmentation attendue de l’OCR et de l’ECAR, les échantillons de mdh1ab c OE maintenant la capacité respiratoire maximale maximale la plus élevée (Figure 3D). Enfin, la roténone/antimycine a conduit à l’arrêt complet du métabolisme dans les deux groupes. Dans l’ensemble, cette méthode nous a permis d’identifier des différences significatives dans la capacité métabolique des ventricules surexprimant mdh1ab et entre sept souches différentes de poisson-zèbresauvages 8.

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Figure 1 : Métabolisme du glucose lors d’un test d’effort de Mito. (A) Représentation schématique du métabolisme du glucose. Le glucose entre dans la cellule par les transporteurs GLUT et est converti en pyruvate par glycolyse. La lactate déshydrogénase (LDH) convertit le pyruvate en lactate, et les protons résultants sont sécrétés par la cellule. Le pyruvate est converti en acétyl-CoA et entre dans le cycle mitochondrial et TCA pour alimenter la chaîne de transport d’électrons respiratoires dans la membrane mitochondriale interne. Les inhibiteurs des complexes I, III et V, ainsi que le découpleur FCCP, sont indiqués en rouge. Les électrons transférés à travers la chaîne de transport d’électrons respiratoires sont indiqués par des flèches bleues, ce qui conduit finalement à la conversion de l’oxygène et des protons en eau. (B) Schéma des résultats du test de stress de Mito. La respiration basale est notée dans le magenta. Lors de l’injection d’oligomycine, l’OCR diminue, permettant de calculer la respiration liée à l’ATP (verte) ainsi que la fuite de protons (orange). La FCCP augmente l’OCR jusqu’à la capacité respiratoire maximale des cellules (bleu). Les injections de roténone et d’antimycine A entraînent l’arrêt de la respiration mitochondriale et ne permettent que la respiration non mitochondriale (gris). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Disposition des microplaques de capture de cartouches et d’îlots capteurs de capteurs. (A) Image du complexe cartouche-amplificateur hydro-plaque utilitaire (en haut) et de la cartouche capteur inversée (en bas). Barre-écailles : 1 cm. (B) Image d’une microplaque de capture d’îlots chargée de ventricules de poisson-zèbre. Les cercles rouges indiquent les puits vides qui ne contiennent pas de ventricules et servent de correction de fond pendant l’analyse. Barre d’échelle : 1 cm. (C) Représentation schématique de la disposition des ports dans la cartouche de capteur XFe24. Le port A contient de l’oligomycine, B contient le FCCP, et C contient le mélange de roténone/antimycine. Le port D peut être laissé vide, ou un médicament supplémentaire peut être ajouté. S désigne le port capteur, qui ne doit contenir aucun liquide afin de ne pas endommager l’analyseur. (D) Image représentative d’un ventricule de poisson-zèbre au fond du puits, entouré de la grille (à gauche) et sans grille (à droite). Barre d’échelle : 5 mm. (E) Coupe transversale schématique de la microplaque de capture de l’îlot contenant un ventricule, la grille (jaune) et la cartouche capteur (verte). P désigne les ports et S le capteur. La ligne ondulée représente le médium. (F) L’outil d’insertion d’écran de capture d’îlot. Bare d’échelle : 1 cm. (G) Icône de l’onglet de normalisation sur l’interface analytique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-3
Figure 3 : Mesures représentatives de l’OCR et de l’ECAR des ventricules du poisson-zèbre. (A) Traces représentatives d’OCR et ECAR de ventricules sauvages de poisson-zèbre non blessés (souche KCL) qui n’ont pas été traités avec les inhibiteurs utilisés dans le test (n = 2, ligne rouge). Les traces résultant des puits vides qui ne contiennent aucun matériau biologique sont présentées en gris (n = 4) ; OCR, mesures répétées à double sens ANOVA, facteur temps P = 0,0200, interaction temps × puits P = 0,0196, facteur puits P < 0,0001, facteur de groupe P < 0,0001 ; ECAR mesures répétées bidirectionnelles ANOVA, facteur temps P = 0,1323, temps × interaction de puits P = 0,0216, facteur de puits P = 0,0009, facteur de groupe P<0,0001 ; données présentées comme moyenne ± SEM. (B) variation du pliage de l’OCR selon diverses concentrations de médicaments et milieux utilisés. ANOVA unidirectionnelle (P = 0,0032) avec le test de comparaisons multiples de Tukey. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6 ; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8 ; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8 ; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8 ; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomycine ; F, FCCP ; PR, roténone/antimycine. (C) Trace de ventricules perméabilisés par la saponine (rouge, n = 4) comparé aux ventricules non traités (gris, n = 4) ; mesures répétées bidirectionnelles ANOVA, facteur temps P < 0,0001, interaction × temps P < 0,0001, facteur de traitement P < 0,0001, facteur d’échantillon P = 0,824 ; les données présentées comme moyenne ± SEM.OCR max des ventricules traités par saponine comparés aux ventricules non traités ; test t de l’élève non apparié (P = 0,0850). (D) Traces représentatives de l’OCR et de l’ECAR à partir de mdh1ab cOE (rouge, n = 8) et GFP cOE (gris, n = 8) 14dpci. OCR, mesures répétées bidirectionnelles ANOVA, facteur temps P < 0,0001, interaction × temps P < 0,0001, facteur génotype P < 0,0001, facteur d’échantillon P = 0,1098 ; ECAR, mesures répétées bidirectionnelles ANOVA facteur temps P < 0,0001, temps × interaction de l’échantillon P = 0,7507, facteur d’échantillon P = 0,2154, facteur génotype P < 0,0001. Données adaptées de Lekkos et al., 20258 et présentées en moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous décrivons en détail le protocole d’analyse de l’OCR et de l’ECAR des ventricules de poisson-zèbre ex vivo à l’aide de l’analyseur Seahorse XFe24 et du test de stress de Mito. Le métabolisme des cardiomyocytes joue un rôle essentiel dans la régénération cardiaque 21,22,23,24. Cependant, la validation du phénotype métabolique du cœur régénérateur du poisson-zèbre a été difficile et fait souvent défaut dans les publications 6,7. En raison de la petite taille du cœur du poisson-zèbre, des techniques telles que la spectroscopie RMN ou la spectrométrie de masse nécessitent la concentration de plusieurs ventricules afin d’acquérir un signaladéquat 8,12,13. En revanche, la méthode que nous décrivons ici permet d’acquérir des mesures OCR et ECAR à partir de plusieurs ventricules individuels, augmentant ainsi la puissance statistique.

Les méthodes classiques de profilage métabolique, telles que la métabolomique, offrent un instantané du profil métabolique du tissu au moment de sa collecte. Grâce au test d’effort de Mito, nous avons pu collecter des données en temps réel et en temps réel sur l’adaptation des ventricules à divers défis métaboliques, y compris leur capacité respiratoire maximale, ce qui n’est pas évident avec d’autres méthodologies. Afin d’obtenir un phénotypage vivant des ventricules du poisson-zèbre, une perfusion du cœur du poisson-zèbre a ététentée 9,10,11. Cela nécessite un équipement complexe et personnalisé et des techniciens hautement qualifiés pour obtenir la canulation tout en restant une méthode à faible débit. L’analyseur propose une alternative plus simple utilisant un équipement commercialement disponible pour le phénotypage à haut débit (20 ventricules à la fois). À notre connaissance, il n’y a pas eu de comparaison directe entre la méthode décrite dans cet article et d’autres techniques d’oxymétrie vivante, telles qu’une électrode de type Clark.

Il est important de noter que la méthode que nous décrivons est adaptable selon la question de recherche. Le test a déjà été utilisé pour caractériser des embryons entiersde poisson-zèbre 25,26. En plus du test de contrainte Mito décrit ici, le test Mito Fuel Flex a été optimisé pour évaluer l’utilisation métabolique du carburant des coupes cardiaqueshumaines 27. De plus, le test du phénotype d’énergie cellulaire a été adapté pour caractériser la capacité glycolytique des cœurs régénérants d’Astyanax mexicanus 28. Nous prévoyons que ce protocole sera utilisé pour d’autres structures 3D telles que les organoïdes cardiaques, et sera utile pour valider la perturbation génétique des voies métaboliques dans les cœurs de poisson-zèbre non blessés.

Nous reconnaissons que cette technique présente certaines limites. En ce qui concerne les défis techniques, lors de l’isolement, les cœurs ont été manipulés dans un milieu DMEM à température ambiante et non maintenu à 28 °C, qui est la température optimale pour le poisson-zèbre19. Réduire la température de l’eau à 18 °C peut avoir des effets significatifs sur le fonctionnement du cœur in situ du poisson-zèbre 29,30. Cependant, nous ne nous attendons pas à ce qu’une exposition à court terme à température ambiante ait un effet significatif sur la physiologie des ventricules isolés, car ceux-ci reviennent rapidement à l’analyseur à 28 °C. Dans nos mains, la majorité des ventricules ont cessé de battre visiblement lors de la dissection de l’atrium, ce qui indiquait l’absence de stimulus du stimulateur cardiaque comme une étiologie de la non-contraction. De plus, pendant la période d’isolement, le milieu n’était pas oxygéné, ce qui pouvait entraîner une hypoxie légère, qui revient à des niveaux normaux d’oxygène après le mélange dans l’analyseur avant la première mesure.

Une autre considération pratique concernant la température des cœurs concerne également l’éteint du chauffage dans l’analyseur, ce qui entraîne une réduction de la température de 37 °C à 28–29 °C. L’analyseur ne permet pas de réduire la puissance du chauffage à la température souhaitée. Néanmoins, lorsque l’analyseur fonctionne, la température à l’intérieur du plateau est 6 à 7 °C plus élevée que la température ambiante. Cette plage de température coïncide avec la température optimale pour l’élevage despoissons-zèbres 19.

Ce test est réalisé sur des ventricules de poisson-zèbre en vrac. Par conséquent, il est impossible de distinguer les contributions des types cellulaires individuels aux changements observés dans l’OCR et l’ECAR. Cela pourrait s’avérer d’une importance significative lors de l’étude des taux métaboliques des premiers moments de régénération, lorsque l’afflux élevé de cellulesimmunitaires 31 pourrait masquer les changements de la POC des cardiomyocytes. De plus, le sang résiduel restant dans la lumière ventriculaire pourrait influencer les relevés métaboliques. Permettre au cœur de saigner en présence d’héparine7 pourrait encore réduire l’influence de la coagulation des cellules sanguines dans le cœur. De plus, afin d’améliorer la diffusion des inhibiteurs utilisés vers les cellules internes du ventricule, nous avons tenté une étape de perméabilisation utilisant la saponine. La perméabilisation de la saponine a entraîné une baisse soutenue de la POC tout au long du test, conduisant les ventricules à une insuffisance respiratoire. Ces limitations pourraient être évitées par l’isolement, la culture et l’analyse de cardiomyocytes isolés, bien que cette approche nécessite une culture prolongée des cellules32 , ce qui pourrait ne pas être optimal pour un contexte régénératif.

Le tissu blessé peut influencer la méthode de normalisation utilisée. Dans cette étude, nous normalisons le POC en μg protéine/mL à l’aide du test BCA. Bien que le test BCA ne réagisse pas fortement avec les protéines de collagène en raison de leur composition riche en hydroxyproline et proline, qui est peu détectée avec le coper, la présence d’autres composants de la plaie dépourvus de cellules pourrait influencer la normalisation. De futures études pourraient envisager l’utilisation de l’ADNtotal 33 comme reflet précis des cellules vivantes dans le ventricule.

De plus, nous n’avons pas pu reproduire la réduction anticipée de la POC causée par l’inhibition dépendante de l’oligomycine du complexeV 15. Bien que certaines études montrent une réduction de la POC par traitement à l’oligomycine sur des cardiomyocytesisolés 32,34,35, les données ici ressemblent au manque de réponse rapporté dans une étude récente sur des cardiomyocytes adultesisolés de souris 36. Puisque la concentration d’oligomycine que nous utilisons est significativement plus élevée que celle rapportée dans les études mentionnées, il n’est pas clair si augmenter la concentration finale à plus de 50 μM aurait un effet.

Enfin, bien que la consommation d’oxygène dépende principalement de la respiration, l’acidification extracellulaire n’est pas exclusivement causée par le lactate produit par la glycolyse, mais aussi par la conversion du dioxyde de carbone en acide carbonique. Il a été rapporté que chez les myoblastes nourris au glucose, un tiers de l’acidification extracellulaire résulte du dioxyde de carbone dans les conditions de base37. Par conséquent, nous recommandons de faire preuve de prudence quant à l’interprétation des mesures ECAR résultant de l’analyseur Seahorse si aucune correction de la proportion d’acidification due à la respiration n’a étéeffectuée 38.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Nick Howe (Agilent Technologies) et Thomas Nicol (Université d’Oxford) pour leur soutien et leur discussion critique lors du développement de cette méthode. Nous souhaitons remercier le personnel de notre établissement vétérinaire au niveau 1 (Université d’Oxford, Unité des services biomédicaux) et de l’Institut de médecine du développement et régénératrice (Université d’Oxford) pour l’entretien et le transfert du poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council (MR/W006731/1 à KL), le King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (bourse postdoctorale à la RA), le Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z à JSOM), la British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 à LCH), le Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG à MTMM), subventions de projet de la British Heart Foundation (PG/15/111/31939 et PG/23/11189 à MTMM), MTMM reconnaît le soutien du Centre d’excellence en recherche BHF d’Oxford, Université d’Oxford (RE/24/130024) et du Centre de médecine régénérative BHF (RM/13/3/30159).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,5 ml de tubes Eppendorf   ;StarlabS1615-5550
Plaques à 96 puits   ;ThermoFisherAB-0800
Antimycine AChemCruz & nbsp ;SC-202467A
Médium DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich & nbsp ;D2650-100 mL
Glace sèche   ;
ÉthanolSupelco1.00983.2500
Kit de test de flux extracellulaire   ;Agilent103518-100Le pack contient une plaque utilitaire, un hydrobooster, une cartouche de capteur, un couvercle (fourni avec les plaques d’îlot)
FCCPSigma-Aldrich & nbsp ;C2920
GlucoseAgilent103577-100
GlutamineAgilent103579-100
Incubateur
Microplaque de capture d’îlotsAgilent101122-10025 grilles incluses dans le pack
Outil d’intégration d’écran de capture d’îlotsAgilent101135-100
Pinces de microdissectionideal-tek3131760Taille 5-S (2x seront nécessaires pour isoler le ventricule du bulbus artérieux et de l’oreillette)
ciseaux de microdissectionFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich & nbsp ;E10521
OligomycineMP  ;151786
Homogénéiseur mottor pilon  ;VWR431-0100
PilonsVWR431-0094
Boîte de Pétri 35mmGreiner Bio-One627102
Boîte de Pétri 92mmStarstedt82.1473
Kit d’analyse BCA PierceThermo Scientific23227
Comprimés Mini comprimés de protéase et inhibiteur de phosphatase Pierce, sans EDTAThermo ScientificA32961
PyruvateAgilent103578-100
Tampon de lyse RIPASanta CrusSC-364162
RoténoneMP  ;02150154-CF
Interphase Agilent de Seahorse AnalyticsAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Analyseur Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
ScellantThermo ScientificAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
SpongeFais une incision assez longue et profonde pour que le côté ventral du poisson se relève
Wave (version 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrant   ;Agilent100840-000

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

R g n ration du c ur du poisson z breessai Seahorsem tabolisme oxydatifglycolysetaux de consommation d oxyg netaux d acidification extracellulairerediff renciation des cardiomyocytesm tabolisme cardiaque
Évaluation de l’activité métabolique des ventricules entiers régénérateurs de poisson-zèbre ex vivo à l’aide d’un test de flux extracellulaire
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