Un composant bioactif issu du pendule Aconitum atténue l’inflammation liée à la polyarthrite rhumatoïde chez les rats via la régulation des voies PI3K/Akt

Résumé

Grâce à la pharmacologie en réseau et au docking moléculaire, des composants anti-rhumatoïde (PR) issus de A. pendulum ont été identifiés. Des études in vivo ont montré que les alcaloïdes diterpènes, en particulier la smirnotine A, soulagent les symptômes de PR chez les rats via la voie PI3K/Akt.

Résumé

Dans la médecine traditionnelle chinoise et diverses pratiques médicales ethniques, les racines du pendule Aconitum N. Busch sont couramment utilisées pour leur capacité à creuser des méridiens, dissiper le rhumatisme, favoriser la circulation sanguine et soulager l’arthralgie. En conséquence, cette plante médicinale est devenue un traitement bien reconnu contre les entorses et les maladies rhumatismales dans différents systèmes médicaux ethniques. Cette étude a examiné les mécanismes par lesquels six composés précédemment isolés d’A. pendulum atténuent l’inflammation liée à la polyarthrite rhumatoïde (PR) en utilisant à la fois des approches in vitro et in vivo . Une combinaison de techniques, incluant la pharmacologie en réseau, le docking moléculaire, le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA), la coloration par hématoxyline et éosine (H&E), la réaction en chaîne quantitative en temps réel (q-PCR) et le western blot (WB), a été employée. Les résultats ont montré que la smirnotine A, l’un des six composés, soulage les symptômes de la PR en ciblant la voie de signalisation PI3K/Akt et en supprimant la réponse inflammatoire. Ces résultats fournissent une base scientifique pour comprendre la base matérielle et l’action mécaniste sous-jacentes à l’utilisation traditionnelle de A. pendulum dans le traitement de la PR.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par une inflammation synoviale, une hyperplasie de la muqueuse synoviale, une infiltration des cellules immunitaires, la formation de tissu pannus invasif et la destruction articulaire ^{conséquente 1,2,3}. Avec une prévalence mondiale de 0,5 % à 1 %, la PR représente un fardeau important pour la santé publique et impacte gravement la qualité de vie des^patients 4,5,6,7. Les thérapies conventionnelles — telles que le méthotrexate (MTX), les glucocorticoïdes, les inhibiteurs de la Janus kinase (JAK) et les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) — sont souvent limitées par des effets indésirables et une réponse variable du patient, soulignant la nécessité de nouveaux^{traitements 8}.

Les produits naturels, en particulier les alcaloïdes, ont attiré l’attention pour leurs mécanismes multi-cibles et leurs profils de sécurité favorables dans la gestion de la PR. Des alcaloïdes tels que la berbérine, la siménonine et la matrine modulent des voies inflammatoires clés, notamment la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK), le facteur nucléaire kappa B (NF-κB), la phosphatidylinositol 3-kinase/kinase protéine B (PI3K/Akt), ainsi que la kinase Janus/transducteur de signal et activateur de la transcription (JAK/STAT), et régulent à la baisse des cytokines telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), l’interleucine (IL)-1β et l’IL-6, démontrant un potentiel^{thérapeutique 9, 10}.

En médecine tibétaine, la PR est classée comme brum bu (arthralgie humide), attribuée à un déséquilibre des trois humeurs et à l’accumulation d’eau jaune immature dans les^{articulations 11,12} (Figure 1). L’Aconitum pendulum N. Busch est une herbe traditionnellement utilisée pour expulser l’humidité, favoriser la circulation et soulager la douleur^13,14. Plus de 50 formulations classiques tibétaines contenant cette herbe ont été documentées, avec un historique d’utilisation clinique s’étendant sur plus de 300 ans^15,16. Cependant, ses composants bioactifs et ses mécanismes restent peu caractérisés.

Ici, nous combinons la pharmacologie en réseau et le docking moléculaire pour prédire les constituants anti-AR de l’Aconitum pendulum N. Busch ainsi que leurs cibles et voies potentielles. Ces prédictions sont ensuite validées expérimentalement (Figure 2). Cette approche intégrée vise à élucider la base matérielle et les fondements mécanistiques du pendule Aconitum N. Busch dans le traitement de la PR, fournissant une base pour le développement futur de médicaments.

Protocole

Cinquante rats mâles Sprague-Dawley sans agents pathogènes spécifiques (FPS) (pesant entre 180 et 200 g) ont été fournis par le Centre provincial de contrôle et de prévention des maladies du Hubei (Académie provinciale de médecine préventive du Hubei) (Wuhan, Chine ; Certificat de licence animale n° SCXK(JB) 2023-0005). Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées en stricte conformité avec le Guide des National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals (8e édition, 2011). Le protocole d’étude a été examiné et approuvé par le Comité d’éthique des animaux expérimentaux de Tianjin Genink Biological Technology Co., Ltd. (Approbation n° GENINK-20250074). Les principaux réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux ci-joint.

Culture cellulaire
La lignée cellulaire MH7A de la polyarthrite rhumatoïde humaine (AR) a été cultivée dans le milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complétée avec un sérum fœtal bovin (FBS) à 10 % (v/v) et maintenue à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂¹⁷.

Animaux et traitements
Les animaux étaient maintenus dans une installation standard sans agents pathogènes spécifiques (SPF) avec un système de cage ventilée individuellement (IVC) dans des conditions environnementales strictement contrôlées : température climatisée de 21,0 à 25,0 °C, humidité relative de 40 à 70 %, photopériode de 12 heures et renouvellement complet de l’air 15 fois par heure. Après une période d’acclimatation de 7 jours, les rats ont été divisés au hasard en six groupes expérimentaux, avec des rats supplémentaires réservés en réserve pour des circonstances imprévues. Un modèle d’arthrite inflammatoire aiguë adjuvante (AA) a été induit par injection sous-cutanée de 100 μL d’adjuvant complet de Freund (CFA ; 10 mg·^mL-1) dans la patte postérieure^{droite 18}. Les groupes expérimentaux ont été conçus comme suit : un groupe témoin blanc, un groupe modèle AA, un groupe témoin positif (méthotrexate, 0,9 mg·^kg-1)¹⁹, et trois groupes de traitement smirnotine A administrés à des niveaux faibles (0,962 mg·^kg-1), moyens (1,923 mg·^kg-1) et à haute dose (3,846 mg·^kg-1) basés sur la valeur IC₅₀.

Prédiction des cibles de maladies et composés
Sur la base d’un criblage préliminaire d’activité mené par notre groupe de recherche, six composés démontrant une bioactivité favorable ont été sélectionnés pour l’étude : cinq alcaloïdes diterpénoïdes (Figure 3), benzoylaconine (1), 14-benzoyl-8-O-méthylaconine (2), (−)-(A-b)-14α-benzoyloxy-N-éthyl-13β, 15α-dihydroxy-1α,6α,8β,16β,18-pentaméthoxyaconitane (3), smirnotine A (4) et aconitine (5), ainsi qu’un dérivé de coumarine, la scopolétine (6)²⁰. Les notations simplifiées du système d’entrée moléculaire en entrée de lignes (SMILES) de ces composés ont été récupérées dans la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/) ou générées à l’aide de ChemDraw 18.0. Ces notations ont ensuite été importées dans la base de données SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), avec l’espèce spécifiée comme « Homo sapiens ». Les cibles potentielles ont été identifiées en sélectionnant des gènes avec une valeur de probabilité > 0, et les noms de cibles et identifiants UniProt correspondants ont été^{collectés 21,22.}

Réseaux PPI
Les gènes cibles qui se chevauchent ont été analysés par un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) à l’aide de la base de données STRING (https://string-db.org/)²³. Les données résultantes, formatées en TSV, ont ensuite été importées dans Cytoscape 3.9.1 pour une visualisation et une analyse complémentaires. Les paramètres topologiques du réseau étaient calculés à l’aide du plugin Network Analyzer intégré. Dans le réseau visualisé, la taille du nœud et l’intensité de couleur étaient mappées à la valeur de degré, tandis que l’épaisseur des arêtes reflétait la force d’interaction entre les cibles. Les cibles principales ont été identifiées et classées en fonction de leur degré^{d’association 24}.

Analyse d’enrichissement des voies de l’Ontologie des gènes (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG)
Les cibles communes ont été soumises à la base de données Metascape (https://metascape.org) pour les analyses d’enrichissement des voies GO^{et KEGG 25}. Les résultats fonctionnels ont été visualisés à l’aide de la plateforme bioinformatique WeiShengXin (https://www.bioinformatics.com.cn).

La construction du réseau des « composants actifs médicamenteux-cibles-pathologies »
Les composants actifs et leurs cibles correspondantes ont été systématiquement examinés, suivis d’une analyse d’enrichissement fonctionnel pour identifier les principales voies de signalisation et leurs cibles associées. Ces éléments ont ensuite été intégrés à l’aide de Cytoscape 3.9.1 pour construire un réseau complet « médicaments–composants actifs–maladie–cibles–voies. L’analyse topologique a ensuite été réalisée avec l’outil Network Analyzer , dans lequel les nœuds étaient classés selon des paramètres clés, y compris le degré et l’intermédiaire, afin d’identifier les éléments centraux du réseau.

Amarrage moléculaire de composés clés à des cibles centrales
Les structures tridimensionnelles des protéines cibles centrales, incluant ESR1 (9BQE), PTGS2 (5F19), EGFR (2XKN), GSK3B (5HLN), SRC (5MTJ) et ERBB2 (8U8X), ont été extraites de la base de données des protéines RCSB (http://www.rcsb.org/ ; consultée le 7 mai 2025). Les structures composées ont été construites dans ChemDraw (version 18.0) puis converties en format SDF tridimensionnel à l’aide du module intégré Chem3D. Les résultats du docking moléculaire ont été visualisés avec PyMOL, et les affinités de liaison évaluées selon l’énergie d’interaction (kcal·^mol-1)²⁶.

Essai de viabilité cellulaire
Les cellules MH7A en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées en plaques de 96 puits à une densité de 5 × 10^{cellules 3} par puits. À 80 % de confluence, les cellules ont d’abord été traitées avec un lipopolysaccharide (LPS) (1 μg·^mL-1) pendant 6 heures, puis exposées à des concentrations variables de smirnotine A (5, 25, 50, 75 et 100 μg·^mL-1). Chaque groupe de traitement a été mis en quadruplicate et incubé pendant 24 heures à 37 °C sous 5 % de CO₂. Après l’incubation, 100 μL de solution à 10 % de CCK8 ont été ajoutés à chaque puits, suivis d’une incubation supplémentaire à 37 °C pendant 2 heures. L’absorbance à 450 nm était mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Test ELISA dans les cellules MH7A
Le surnageant a été collecté par centrifugation à 2000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Les niveaux de cytokines inflammatoires, dont IL-6, IL-1β, TNF-α et IL-10, ont été quantifiés dans le surnageant à l’aide de kits ELISA correspondants, strictement selon les instructions du fabricant.

Mesure du degré de gonflement des orteils
Le degré de gonflement de la patte arrière droite a été évalué en mesurant le volume de la patte tous les 3 jours après le modélisation. Les mesures ont été prises deux fois par rat et en moyenne. La réponse inflammatoire a été quantifiée par le pourcentage d’augmentation du volume des pattes par rapport à la ligne de base.

Mesure de l’indice d’orgue
Tous les rats ont été anesthésés et euthanasiés 24 heures après l’administration finale. La méthode humaine reconnue par la communauté vétérinaire internationale est adoptée. Premièrement, une forte concentration (5 %) d’isoflurane est utilisée pour anesthésier profondément l’animal. Une fois qu’il perd connaissance et tous ses réflexes, la poitrine est ouverte et le cœur est découpé, garantissant que l’animal meurt sans douleur et sans aucune sensation. La rate et le thymus ont été rapidement excisés et pesés. Après rinçage avec du sérum physiologique normal, l’excès d’humidité sur les surfaces tissulaires a été éliminé en applaudissant avec du papier filtre, et les poids humides des organes ont été^{enregistrés 27,28}.

Hématoxyline et éosine (HE)
Pour préserver l’intégrité des échantillons de tissu de patte, toute la portion distale de l’articulation de la cheville droite de chaque rat a été prélevée et stockée. Pour la section, on utilisait le tissu gonflé de la patte. La procédure de prélèvement était la suivante : le tissu situé environ 1 cm au-dessus de l’articulation de la cheville droite a été complètement disséqué, la fourrure a été retirée, et la tige osseuse a été découpée à l’extrémité proximale. L’échantillon a été immédiatement fixé dans une solution de paraformoldéhyde à 10 %. Après fixation, le tissu a été placé dans une solution décalcifiante à 15 % d’EDTA. La décalcification était surveillée tous les 3 jours, et la solution était rafraîchie selon les besoins jusqu’à ce que le tissu s’assouple, indiquant la fin de la décalcification. Le tissu a ensuite été déshydraté par une série d’éthanol graduée (75 % pendant 4 heures, 85 % pendant 2 heures, 90 % pendant 1,5 heure, 95 % pendant 1 heure, et deux changements de 100 % d’éthanol pendant 0,5 heure). Les coupes ont été déparaffinées, réhydratées à l’éthanol, colorées à l’hématoxyline pendant 10 minutes, rincées à l’eau du robinet, différenciées en acide chlorhydrique–éthanol pendant 10 secondes, rincées à l’eau du robinet, bleues, rincées à nouveau, immergées dans 85 % d’éthanol pendant 5 minutes, contre-colorées à l’éosine pendant 5 minutes, rincées à l’eau du robinet pendant 3 secondes, déshydratées, nettoyées, et montées pour observation²⁹.

Dosage ELISA du sérum de rat
Des échantillons sanguins ont été centrifugés à 2000 × g pendant 20 minutes à 4 °C, et le surnageant obtenu a été prélevé pour une analyse des cytokines. Les concentrations d’IL-1β, IL-6 et TNF-α ont été déterminées à l’aide de kits ELISA commerciaux, strictement conformément aux protocoles du fabricant. Une courbe standard a été générée et ajustée à l’aide du logiciel cvxpt32, et les niveaux d’expression de chaque cytokine ont été calculés en interpolant les valeurs d’absorbance dans l’équation correspondante de la courbe standard. Les concentrations finales de protéines ont été calculées à partir des mesures expérimentales réelles.

Analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase (qPCR)
L’ARN total a été isolé à partir de cellules synoviales à l’aide du réactif TRIzol, la séparation de phase étant obtenue par ajout^{de chloroforme 30}. Un kit commercial de transcription inversée a alors été utilisé pour synthétiser l’ADNc à partir de l’ARN isolé, en suivant strictement les instructions du fabricant. qRT-PCR a été réalisée à l’aide d’un réactif SYBR Premix. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisée comme gène de référence endogène, et les niveaux d’expression génique relatifs ont été calculés à l’aide de la méthode ^2-ΔΔCt . Les séquences d’amorce suivantes ont été utilisées : GAPDH Forward : ACAGCACAGGGTGTGGAC, et GAPDH Reverse : TTTGAGGGTGCAGCGAACTT ; IL-17A Avant : CTGATGCTGTTGCTGCTACTGA, et IL-17A Marche arrière : TGGAACGGTTGAGGTAGTCTGA ; TRAF6 Avant : ACATTTCCCTCTTTGTCCACACAC, et TRAF6 Retour : TTAGCATCCATGACCTCTTGT ; IL-10 Avant : CTGCAGGACTTTAAGGGTTACTT, et IL-10 Marche arrière : CTTGCTTTTTTCTCACAGGGA ; IL-1β Avant : CCTGTGTGATGAAAGACGGC, et IL-1β Arrière : TATGTCCCGACCATTGCTGT ; IL-6 Avant : GTTGCCTTCTTGGACTGATG, et IL-6 Marche arrière : TACTGGTCTGTTGTGTGGT.

Extraction des protéines et western blotting
Le tissu synovial a été lysé dans un tampon de radioimmunoprécipitation (RIPA) complété par phosphatase/inhibiteurs de protéases, et les concentrations de protéines ont été mesurées à l’aide d’un kit de test à l’acide bicinchoninique (BCA). Pour le Western bloting, les lysats contenant des quantités égales de protéines ont été soumis à l’électrophorèse du gel de sulfate de dodécyle de sodium (polyacrylamide sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) puis transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Après un blocage avec 5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée à 0,1 % Tween (TBST) pendant 2 heures à 25 °C, les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires (GAPDH 1:50000 ; P-PI3K 1:1000 ; PI3K 1:1000 ; P-AKT 1:3000 ; AKT 1:6000). Après un lavage intensif avec TBST, les membranes ont été réagies avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (Anti-IgG Mouse 1:10000 ; Anti-lapin IgG 1:1000) pendant 2 heures à température ambiante. Après une nouvelle série de lavages TBST, les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat à chimiluminescence améliorée (ECL). Les intensités de bande ont été quantifiées avec le logiciel ImageJ et normalisées en GAPDH comme contrôle de chargement.

Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées à l’aide du logiciel Graphpad Prism 9.5 et sont présentées comme la moyenne ±± l’écart-type. Des comparaisons statistiques ont été réalisées en utilisant une ANOVA unidirectionnelle lorsque cela était approprié. Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Comparé au groupe témoin : ^*p < 0,05, ^**p < 0,01, p < 0,001 et p < 0,0001 ; Comparé au groupe Modèle/LPS : ^#p < 0,05, ^##p < 0,01, ^###p < 0,001, et ^####p < 0,0001.

Résultats

Effets des dérivés d’A. pendulum sur la cible anti-AR
Les structures 3D des six composés ont été récupérées au format SDF, et les numéros SMILES ont été téléchargés dans la base de données SwissTargetPrediction pour la prédiction des cibles. Les cibles ayant une probabilité supérieure à 0 étaient conservées, et les résultats exportés sous forme de fichier CSV. Après suppression des doublons, un total de 97 cibles potentielles liées aux composés ont été identi...

Discussion

Cette étude intégrée offre de nouvelles perspectives mécanistes sur l’activité anti-rhumatoïde de la smirnotine A, un alcaloïde C19-diterpénoïde provenant du pendule Aconitum N. Busch. Nos résultats démontrent que la smirnotine A atténue l’inflammation de la PR grâce à une inhibition ciblée de la voie de signalisation PI3K/Akt, représentant un mécanisme distinct des alcaloïdes diterpénoïdes précédemment rapportés.

La combinaison de la prédiction de la...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q111
Anticorps monoclonal de souris AKT (60 kDa)	Biotechnologie Wuhan Sanying	60203-2-IG
Kit de test protéique BCA	Biotechnologie Guangzhou Jiebeisi	G3522
Norme BSA	Biotechnologie Guangzhou Jiebeisi	G8532
Milieu complet pour cellules MH7A	Shanghai Fuheng Biotechnologie	FH-MH7A
Kit ELISA pour IL-10	Biotechnologie Lunchangshuo	ED-13626
Kit ELISA pour IL-17A	Biotechnologie Lunchangshuo	ED-10344
Kit ELISA pour IL-1 et bêta ;	Biotechnologie Lunchangshuo	ED-10351
Kit ELISA pour IL-6	Biotechnologie Lunchangshuo	ED-10377
Kit ELISA pour TNF-& alpha ;	Biotechnologie Lunchangshuo	ED-11776
Système de PCR quantitative à fluorescence	Biosystèmes appliqués	VIIA-7
Anticorps monoclonal de souris GAPDH	Biotechnologie Wuhan Sanying	60004-1-IG
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse	Équipement d’instruments Kecheng du Hunan	HI-16KR
HiScript II Q Select RT SuperMix pour qPCR	Vazyme	R223
Anticorps secondaire anti-souris marqué par HRP	Biotechnologie Wuhan Sanying	SA00001-1
Anticorps secondaire anti-lapin, marqué par HRP,	Beyotime Biotechnology	A0208
Lignée synoviocytaire MH7A de type fibroblaste de polyarthrite rhumatoïde humaine	Biotechnologie Qisai	QS-H075
Lecteur de microplaques	BioTek	MQX200
Microscope	Leica	FLEXACAM C1
Lecteur de microplaques multimode	Dispositifs moléculaires	FlexStation 3
Anticorps polyclonal de lapin P-AKT (60 kDa)	Biotechnologie Wuhan Sanying	28731-1-AP
Microtome de paraffine	Leica	RM 2016
Amplificateur PCR	Biosystèmes appliqués	proFlex
Solution physiologique tamponnée au phosphate (1 et fois ; PBS)	Biotechnologie Qisai	QS-S001
Anticorps polyclonal de lapin PI3K (85 kDa)	Affinité	AF6241
Anticorps polyclonal du lapin P-PI3K (85 kDa)	Affinité	AF3242
Smirnotine A	isolé et identifié par notre laboratoire	C39H49NO11
Déshydrateur tissulaire	Wuhan Junjie Electronic	JT-12J
Machine d’Incorporation de Tissus	Wuhan Junjie Electronic	JB-L6
Machine à étaler les tissus et à cuire	Wuhan Junjie Electronic	JK-6
Trizol	Ambion	15596-026
Solution de digestion cellulaire à la trypsine (0,25 % de trypsine, et nbsp avec EDTA, sans rouge de phénol)	Biotechnologie Qisai	QS-S401