Utilisation de la RMN en solution pour caractériser les condensats biomoléculaires dans des conditions biphasiques

Résumé

Nous présentons ici des protocoles pour les méthodologies RMN, la DIFfusion REstricte des spécimens INvisibles (REDIFINE) et le DEtectioN CONDENSATE par transfert de magnétisation SEmi-solide (CONDENSE-MT), qui permettent une caractérisation quantitative sans marqueur des condensats biomoléculaires en conditions biphasiques, révélant la partition moléculaire, la dynamique d’échange, l’hydratation des condensats et la structure des gouttelettes sans sédimentation ni marquage.

Résumé

Les condensats biomoléculaires formés par séparation en phase liquide-liquide (LLPS) organisent l’environnement intracellulaire et régulent divers processus biochimiques. Malgré leur importance, sonder la composition du condensat, la dynamique d’échange et l’organisation interne reste un défi, en particulier sans balises externes. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) peut offrir une fenêtre unique sans marqueur sur ces assemblages mésoéchelles, capturant à la fois le mouvement moléculaire et l’hétérogénéité environnementale. Deux méthodologies complémentaires de RMN permettent une caractérisation complète des condensats directement dans leur état biphasique. Pour les condensats suffisamment dynamiques pour être observables par RMN, l’approche d’échange de diffusion, la DIffusion REstricte des spécimens INvisibles, abrégée en REDIFINE, utilise le contraste de diffusion avec l’échange chimique pour quantifier la fraction de molécules réparties entre les phases condensée et diluée, déterminer la taille des gouttelettes et la perméabilité à l’interface, et extraire les taux d’échange moléculaire à travers la frontière de phase. Pour les condensats plus rigides invisibles par RMN, la méthode de transfert de magnétisation semi-solide détectée par l’eau, CONdensate DEtectioN par transfert de magnétisation SEmi-solide, ou en abrégé CONDENSE-MT, exploite le contraste de relaxation et l’échange de protons entre biomolécules condensées et solvant en phase diluée pour surveiller les condensats sur les protons d’eau en vrac, offrant un accès à la partition relative, aux taux de rotation moléculaire, à la dynamique d’hydratation et à la teneur en eau liée. Ensemble, ces approches offrent une vue multidimensionnelle et quantitative de la structure et de la dynamique du condensat dans des conditions biphasiques quasi natives, sans balises fluorescentes ni de détection. Leur intégration élargit la boîte à outils RMN pour étudier la séparation des phases biomoléculaires et établit une base pour relier les propriétés physicochimiques du condensat à leur fonction biologique et à leur mauvaise régulation pathologique.

Introduction

Les cellules atteignent leur extraordinaire organisation spatiale et temporelle en compartimentant les réactions biochimiques ^1,2,3. En plus des organites liés à la membrane, de nombreux processus cellulaires cruciaux se produisent dans des compartiments sans membrane formés par la séparation en phase liquide-liquide (LLPS) des protéines et acides^{nucléiques 4}. Ces assemblages dynamiques, souvent appelés condensats biomoléculaires, comprennent le nucléole, les granules de contrainte, les particules nucléaires et les corps de traitement, qui jouent des rôles essentiels, par exemple, dans le métabolisme de l’ARN, la régulation de la transcription ou la transduction^{du signal 5,6}. Leur capacité à former, dissoudre et échanger des composants en réponse aux signaux environnementaux offre aux cellules un mécanisme polyvalent pour organiser des activités biochimiques sans dépendre des membranes lipidiques.

Un grand sous-ensemble de condensats biomoléculaires provient de protéines liant l’ARN (RBP) qui contiennent des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) et des domaines de liaison à l’ARN (RBD)^7,8. Ces protéines peuvent se séparer seules ou en complexe avec l’ARN, donnant naissance à des condensats aux propriétés matérielles et fonctions biologiques diverses. Par exemple, la protéine nucléocapside (N) du SARS-CoV-2 forme des condensats biomoléculaires^{dépendants de l’ARN 9}, impliqués dans l’emballage et l’assemblage du génome viral, tandis que la protéine liant le tract polypyrimididine 1 (PTBP1) forme des condensats nucléaires qui contribuent au silence^{génique 10}. De plus, des protéines telles que FUS et DDX4 subissent LLPS sous l’effet de leurs régions désordonnées, influençant le métabolisme de l’ARN et la formation des granules^{de stress 11,12}. La dysrégulation de ces processus est liée à des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale, où des transitions de phase aberrantes peuvent entraîner une agrégation et une perte de^{fonction 13}.

La condensation ne se limite pas aux protéines et aux complexes protéine–ARN. L’ARN seul peut subir LLPS, en particulier dans le contexte de séquences d’expansion répétée associées à plusieurs troubles neurodégénératifs^14,15. Les expansions répétées des trinucléotides et hexanucléotidiques, telles que la CAG dans la maladie de Huntington ou la CUG dans la dystrophie myotonique, peuvent former des condensats de type gouttelette à la fois in vitro et dans les^{cellules 14}. Comprendre la base physique de la condensation de l’ARN, ainsi que la manière dont elle diffère des condensats alimentés par les protéines et les protéines-ARN, est crucial pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies à expansion répétée.

Malgré leur importance biologique, la caractérisation quantitative et sans marqueur des condensats biomoléculaires reste un défi de taille¹⁶. Les techniques conventionnelles de microscopie et de spectroscopie à fluorescence reposent sur des marquants externes, qui peuvent perturber la structure, la dynamique ou le comportement des^{biomolécules 17,18}. De plus, certains condensats sont invisibles à la RMN en raison de mouvements moléculaires restreints et de formes de raies larges, ce qui limite l’accès aux informations des approches RMN traditionnelles. Par conséquent, il est urgent de disposer de stratégies expérimentales capables d’explorer directement les condensés dans leur état biphasique, semblable à un natif natif, sans marquer. Étant donné le rôle important de la frontière de phase des gouttelettes dans les processus d’échange et la maturation du condensat, il est tout aussi important de stabiliser les gouttelettes biomoléculaires dans un volume d’échantillon donné, empêchant ainsi la sédimentation de la phase dense. Cela peut être facilement réalisé en utilisant les hydrogels d’agarose imitant le cytosquelette.

Les développements récents dans les méthodologies basées sur la RMN offrent une telle solution. L’approche REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)¹⁹ combine la RMN par diffusion avec l’analyse d’échange chimique pour quantifier la partition moléculaire, la cinétique d’échange et la taille des gouttelettes dans les condensats protéine et protéine–ARN. De manière complémentaire, la technique CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer)²⁰ détecte les condensats invisibles à la RMN via un transfert de magnétisation de l’eau, permettant de quantifier la quantité de matière condensée dans des conditions données et révélant en outre la dynamique d’hydratation et les taux de rotation moléculaire au sein du condensat. Ensemble, ces méthodes permettent des études sans marqueur et non invasives sur divers types de condensats, uniquement protéiques, protéine-ARN et condensats uniquement ARN sous des conditions biphasiques d’équilibre. En élargissant la boîte à outils de la RMN, ils ouvrent la porte à une exploration systématique et quantitative de la structure des condensats, de leur dynamique et de leurs liens avec la fonction biologique et la maladie.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Choix du tampon : Utilisez des tampons testés où les biomolécules sont les plus stables.
   REMARQUE : Les signaux RMN sont généralement plus forts à un pH plus bas. En tant que condition technique, ajoutez 5 % de D₂O comme verrouillage de champ à tous les échantillons RMN (v/v final).
2. Stabiliser l’échantillon biphasique en utilisant un hydrogel d’agarose imitant le cytosquelette comme substrat. Pesez de la poudre d’agarose pour préparer un fond d’agarose à 1,5 % (p/v) dans le même tampon. Utilisez l’agarose ordinaire comme alternative moins coûteuse aux condensats biomoléculaires formés par des protéines intrinsèquement désordonnées (IDP) et des ARN capables de résister à des températures plus élevées. Utilisez de l’agarose à faible fusion lors de la préparation de condensats délicats impliquant des protéines contenant des domaines repliés¹⁹.
3. Préparation du stock d’agarose : Chauffez la suspension à environ 80 °C pendant 10 minutes et dissoudez complètement l’agarose en mélangeant ou en vortexant.
   ATTENTION : L’agarose en fusion est chaude et peut brûler ; Manipulation avec des gants résistants à la chaleur.
   REMARQUE : Gardez l’agarose fondu chaud (par exemple, 55 °C pour l’agarose ordinaire et 37 °C pour l’agarose à faible fond) dans un bain-marie pour qu’il reste liquide avant de le mélanger avec l’échantillon biologique.
   L’agarose en fusion peut être maintenue chaude pendant plusieurs dizaines de minutes^19,21.
4. Préparez l’échantillon biphasique final :
   1. Pour préparer un échantillon biphasique stabilisé par de l’hydrogel d’agarose, mélangez des stocks de protéines (et/ou d’ARN) avec un tampon d’agarose chaud correspondant dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
      REMARQUE : La concentration finale de protéines/ARN est généralement de 50-500 μM pour être adaptée à la détection RMN.
   2. Transférez immédiatement le mélange dans un tube RMN de 3 mm à l’aide d’une longue pipette en verre. Laissez l’agarose se solidifier peu après le transfert.
      REMARQUE : Sans agarose, l’échantillon biphasique se sédimente au fil du temps, compliquant l’acquisition et l’analyse des données RMN car l’échantillon change physiquement à l’échelle temporelle de l’expérience.
5. Effectuer une inspection visuelle : Inspecter l’échantillon visuellement. Si une séparation de phase se produit, l’échantillon apparaît immédiatement trouble et reste ainsi. Cela indique que l’échantillon biphasique a été stabilisé avec succès dans l’agarose.
6. Lorsque vous envisagez d’exécuter CONDENSE-MT, préparez un échantillon de référence d’agarose supplémentaire en suivant les mêmes étapes, en omettant simplement l’ajout de la biomolécule. Ajoutez le tampon à la place pour obtenir le même volume d’échantillon. Préparez cet échantillon seulement après avoir préparé l’échantillon de condensat et mesuré toutes les données qu’il contient afin de garantir que l’échantillon de référence d’agarose ne soit pas incubé plus longtemps.

2. Enregistrement des expériences REDIFINE

1. Verrouillez, calez, faites correspondre et réglez le canal ¹H comme d’habitude. Calibrez la longueur d’impulsion de 90° sur ¹H en suivant votre procédure générale.
2. Enregistrez un spectre 1D avec suppression d’eau. Idéalement, un signal biomoléculaire fort est observé (Figure supplémentaire 1A).
   1. Si aucun signal n’est observé ou très peu, supposons que la protéine/ARN condensé n’est pas observable par RMN et que la partition en phase condensée est élevée. Dans ce cas, ne procédez pas à REDIFINE car cette méthodologie repose sur un signal biomoléculaire observable.
   2. Dans cette situation, en principe, les expériences CONDENSE-MT devraient très bien fonctionner, il faut donc passer immédiatement à l’étape 4 (enregistrement des expériences CONDENSE-MT).
3. Chargez l’expérience conventionnelle de spectroscopie ordonnée par diffusion (DOSY) qui repose sur une procédure conventionnelle d’écho stimulé 2D utilisant des gradients bipolaires (séquence d’impulsions de Bruker : stebpgp1s19). Consultez les manuels d’utilisation de Bruker DOSY et Diffusion pour plus de détails.
4. Réglez P0, P1 et P27 à la longueur d’impulsion calibrée de 90°. Réglez comme règle générale NS à 32 scans, DS à 16, TD1 à 16, et ajustez TD2 et SW2 pour obtenir un temps d’acquisition AQ de 80-100 ms. Réglez d1 à 1,5 s.
   REMARQUE : Les gradients doivent être correctement calibrés.
5. Optimisez le délai d19 du Watergate comme d’habitude selon votre champ magnétique, afin d’obtenir une excitation maximale aux aromatiques (environ 7 ppm) ou aux aliphatiques (environ 1 ppm). Réglez d20 à 75 ms. Le choix du p30 dépendra de la taille de la protéine ou de l’ARN. Pour les protéines >20 kDa, utilisez 5 ms ; Pour les protéines plus petites, utilisez 3,5 ms comme règle générale.
6. Enregistrez une expérience DOSY par la commande : 'xau dosy 2 95 16 l y y' qui calcule la intensité du gradient de diffusion de 2 à 95 % en 16 étapes, de manière linéaire.
   1. Idéalement, il faut observer la décroissance initiale du signal provenant de la phase diluée, tandis que la décroissance du signal de phase condensée devrait stagner (Figure 1A et Figure supplémentaire 1B).
7. Pour continuer à acquérir des données pour l’ensemble complet de REDIFINE, créez 9 nouveaux stebpgp1s19 en copiant les paramètres de l’ancien que vous venez d’exécuter. Dans chaque expérience consécutive, ne changez que le délai de diffusion d20 par étapes variables pour couvrir la plage de 100 à 1000 ms (c’est-à-dire 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1 000 ms).
8. Exécutez chacune de ces expériences par la commande 'xau dosy 2 95 16 l y n'. Le dernier « n » garantit que le gain du récepteur est préservé tout au long des 10 expériences.

3. Traitement des ensembles de données REDIFINE et visualisation des résultats

1. Traiter chaque expérience (10 au total) de la manière suivante :
   1. Définir qsine de SSB 2 comme fonction fenêtre, extraire la^5e tranche en utilisant qsin ; fp, phasez l'1D et enregistrez les paramètres de phasage dans le jeu de données 2D.
   2. Ensuite, traitez 2D avec xf2, faites la correction de base abs2, et extrayez ces 16 tranches avec split2D (entrées supplémentaires dans la fenêtre pop-up : r – 16 – 11). Cela extrait 16 spectres acquis en utilisant différentes intensités de gradient et les sauvegardera sous forme d’expériences traitées en 1D de 11 à 26 dans le même ensemble de données.
   3. Répétez la même chose pour les 9 expériences restantes. Parfois, il est crucial de vérifier au moins les 4 à 5 premières tranches pour s’assurer que le phasage et la correction de base sont corrects. Si nécessaire, corrigez manuellement – un bon phasage et une bonne base sont des prérequis pour une quantification correcte (Figure 1B).
2. Utilisez le code Matlab LLPS_REDIFINE_fit fourni pour l’analyse (Figure supplémentaire 2A). Dans le code, ajustez selon vos expériences les éléments suivants : 'Delta' (diffusion multipliée par d20), 'P.d'(durée totale du gradient 2*p30), exp(1,:) à exp(10,:) basé sur le # des expériences que vous avez réalisées. Ensuite, réglez P.G selon la intensité du gradient de votre sonde (accessible dans le dossier expérimental TopSpin sous le fichier « difflist »).
3. Ajustez le « dossier » et le « chemin » en fonction de la localisation de vos données. Faites tourner le code jusqu’à la ligne 40. Cela vous donnera la tranche 1D – à partir de là, choisissez les régions d’intégration ; Celles-ci doivent englober les aromatiques ou les aliphatiques, et choisir la région la plus étroite possible, sans prendre en compte les différents groupes moléculaires comme les amides.
4. Entrez les frontières d’intégration dans les points des variables « gauche » et « droite » en conséquence (Figure supplémentaire 2A). Cela permet d’intégrer les données pour l’analyse quantitative (Figure 1C). Choisissez le nom de la matrice selon votre échantillon, la date d’exécution et quelques détails expérimentaux.
5. Exécutez tout le code. Dans « fit0 », vous pouvez choisir les paramètres de départ que la fonction d’optimisation utilisera pour initier la minimisation. Commencez par les valeurs par défaut, puis si la convergence n’est pas atteinte, changez la deuxième valeur de fit0 (population en phase condensée) par étapes de 0,1 de 0,1 à 1.
   REMARQUE : Parfois, l’ensemble de données comporte plusieurs minima locaux, et il faut varier largement les paramètres de départ pour commencer à converger vers le minimum plus global.
6. Lorsqu’un ajustement satisfaisant a été obtenu, les valeurs d’ajustement sont écrites dans la figure (Figure 1D et Figure Supplémentaire 2B) et peuvent être consultées dans la variable « ajustement ». En outre, représentez ces paramètres sous forme de graphique statistique pour une meilleure visualisation.

4. Enregistrement des expériences CONDENSE-MT

REMARQUE : L’objectif de l’expérience est de détecter indirectement les condensats par leur observation du signal d’eau du solvant via l’échange de^{protons 20}. Dans l’expérience CONDENSE-MT, un profil MT d’empreinte digitale est acquis et analysé (Figure 2A)²⁰.

1. Enregistrez votre spectre 1D préféré avec suppression d’eau. Si très peu de signal est observé, il est très probable que l’expérience CONDENSE-MT fonctionne très bien.
2. L’analyse quantitative CONDENSE-MT nécessite une détermination préalable du taux R1 de l’eau. Déterminer le taux de_R1 via la récupération par inversion de_T1 . Copiez la séquence d’impulsions fournie, le paramètre Bruker et la liste vd dans les dossiers correspondants. Chargez le paramètre « T1_inversion_recovery » et ajustez les puissances et fréquences de votre spectromètre RMN (selon « edprosol »).
   1. Calibrez l’impulsion à 90° sur 1 heure (p1), réglez NS à 2, DS à 0, d1 à 20 s, SW à 10 ppm, TD2 à 16k, et TD1 à 24 (de la longueur de votre liste de vd ajustée). Activez un gradient faible le long de Z (GPZ0 = 0,1 %) pour éviter les effets d’amortissement des radiations.
3. Pour l’expérience CONDENSE-MT,
   1. Copiez l’ensemble de paramètres Bruker fournis, la séquence et la liste de fréquences dans les dossiers spécifiques à Bruker, chargez le paramètre « CONDENSE-MT », et ajustez les fréquences et puissances selon votre spectromètre.
   2. Réglez P1 à la longueur d’impulsion calibrée de 90° et P4 à 1 μs pour l’impulsion d’excitation afin d’éviter l’amortissement des radiations. Réglez NS à 2, DS à 16, d1 à 4 s, SW2 à 20 ppm, TD2 à 8k, TD1 à la longueur de la liste de fréquences (généralement 46). Réglez SPNAM10 à Squa100.1000 et sa durée de p10 à 5 s.
   3. Trouvez la puissance SP10 pour fournir une irradiation à 100 Hz (la commande « pulse 100 Hz » calculera votre puissance en watts et en dB). Ajustez la puissance SP10 de l’impulsion d’irradiation en conséquence et exécutez cette expérience pseudo-2D en utilisant la commande 'zg'.
      REMARQUE : L’expérience utilisera la liste de fréquences fournie qui couvre les décalages d’irradiation allant de la résonance sur l’eau à la résonance très éloignée (100000 Hz) pour détecter le signal de l’eau à différents décalages d’irradiation (Figure 2B). Un graphique des intégrales d’eau (assurer un phasement correct des spectres ; Figure 2C) par rapport au décalage d’irradiation, on obtient le profil CONDENSE-MT montré à la Figure 2A.
4. Créer 7 nouvelles expériences et, à chaque consécutivité, n’augmenter que la puissance d’irradiation pour couvrir la plage de 170 Hz à 1000 Hz (c’est-à-dire 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1 000 Hz). Dans chaque expérience, utilisez la commande du point précédent. Pour chaque puissance de saturation, toute la liste de décalage sera acquise (Figure 2D).
   NOTE : L’AJUSTEMENT CONDENSE-MT nécessite les données de référence acquises sur l’échantillon uniquement agarose (milieu sans condensats biomoléculaires). Assurez-vous d’avoir le même intervalle de temps entre la préparation de l’échantillon et l’acquisition des données, et acquérez le même ensemble de données de 8 expériences sur un échantillon de référence agarose. Cela vise à garantir que la référence agarose et l’échantillon biphasique aient été incubés pendant la même durée.

5. Traitement des jeux de données CONDENSE-MT et visualisation des résultats

1. Traiter chaque expérience CONDENSE-MT (8 au total, Figure Supplémentaire 3A) de la manière suivante.
   1. Définir qsine de SSB 2 comme fonction fenêtre, extraire la^46e tranche en utilisant qsin ; fp, phasez le pic d’eau en 1D, et enregistrez les paramètres de phasage dans le jeu de données 2D, puis traitez 2D avec xf2, et extrayez ces 46 tranches avec split2D (entrées supplémentaires dans la fenêtre pop-up : r – 46 – 11).
      REMARQUE : Cela extraira 46 spectres 1D acquis à l’aide de différents décalages d’irradiation et les conservera comme expériences 1D traitées de 11 à 56 au sein du même ensemble de données (Figure supplémentaire 3A, montrée pour l’expérience CONDENSE-MT à 1000 Hz).
   2. Répétez la même chose pour les 7 expériences restantes. Vérifiez plusieurs tranches de chaque expérience pour vous assurer que le phasage et la base sont corrects (Figure 2C). Si besoin, corrigez-le manuellement – un bon phasage et une bonne base sont des prérequis pour une quantification correcte !
2. Répétez les mêmes étapes sur les données acquises à partir d’un échantillon de référence agarose et pour les expériences de récupération par inversion, en extrayant la 24e tranche pour le phasage et en utilisant split2D (r – 24 – 11).
3. Ajustez les données acquises en utilisant le code Matlab fourni. Suivez les instructions spécifiques du script.
4. Effectuer d’abord l’analyse d’ajustement pour l’échantillon de référence agarose afin d’obtenir les paramètres de fond en l’absence de condensats. Le code read_CONDENSE_MT_data lit d’abord les données RMN traitées et intègre le signal de résonance d’eau dans les tranches 1D générées par la commande split2D (Figure supplémentaire 3B).
5. Fixer les limites d’intégration individuellement ; un spectre de référence 1D sera tracé dans Matlab pour évaluer les frontières d’intégration (Figure supplémentaire 3C). Le code normalisera davantage les données et ajustera les intégrales normalisées de l’eau en fonction du décalage d’irradiation et de la puissance au modèle^{CONDENSE-MT 20}. Le read_CONDENSE_MT_data stockera les intégrales normalisées dans la variable integral_water_real_all, qui sera ensuite utilisée pour l’ajustement ultérieur.
6. Déterminez le taux de relaxation R₁ de l’eau en présence d’agarose ou de condensats avant d’ajuster les données CONDENSE-MT.
   REMARQUE : L’ajustement de l’expérience de récupération par inversion d’eau peut se faire dans la première section du script CONDENSE-MT_full Matlab (ou le script CONDENSE_MT_referenceMTpool dans le cas des données de référence agarose). Le nom et le chemin du fichier de l’expérience, ainsi que l’identifiant de l’expérience, peuvent être saisis pour exécuter le script Inversion_Recovery Matlab (Figure supplémentaire 4A, section 1). Si nécessaire, le nombre de tranches 1D et les frontières d’intégration peuvent être ajustés dans ce script ; ce dernier dépend des paramètres de traitement utilisés dans TopSpin. Cette section déterminera le débit R1 de l’eau et le stockera dans la variable P.R1w , nécessaire pour l’ajustement ultérieur des données CONDENSE-MT.
7. Pour les données agarose, utilisez les intégrales normalisées directement pour l’ajustement, en utilisant le script CONDENSE_MT_referenceMTpool (qui appelle la fonction function_1MT ).
8. Pour la quantification du condensat, utilisez les paramètres ajustés de l’agarose comme entrée pour l’ajustement global des données acquises sur l’échantillon condensé (Figure supplémentaire 4A). Cela fixera les propriétés physiques du maillage d’agarose comme des valeurs constantes à l’ajustement, permettant de quantifier l’effet supplémentaire médié par le condensat d’un condensat intégré dans le maillage d’agarose (Figure 2E).
9. Effectuez la quantification du condensat en utilisant le script CONDENSE-MT_full , qui appelle la fonction function_2MT Matlab. Les paramètres de départ pour l’optimisation computationnelle sont donnés via fit0 (Figure supplémentaire 4B). L’incertitude des paramètres de l’ajustement sera calculée avec la matrice jacobienne à partir de laquelle la matrice variance-covariance sera dérivée (Figure supplémentaire 4B).
10. Évaluer la qualité de l’ajustement par l’écart d’ajustement, ressemblant à l’écart résiduel de la prédiction du modèle par rapport aux données expérimentales. Pour un contrôle qualité plus poussé, tracez l’ajustement avec les données expérimentales (Figure supplémentaire 4C).

Résultats

Le protocole LLPS REDIFINE décrit ici a été appliqué au domaine FUS N-terminal (NTD). Le FUS NTD se sépare facilement en conditions ambiantes à des concentrations micromolaires^{de 19,21}. Cet échantillon particulier a été préparé à une concentration de 200 μM dans un tampon HEPES de 30 mM contenant 200 mM KCl au pH 7,5, avec 0,5 % d’agarose régulière. Lors de la séparation de phase, les signaux FUS NTD restent observables dans la phase condensée (Figure 1A,B). Cela en fait un candidat idéal pour l’étude LLPS REDIFINE. En effet, la plupart des protéines sujettes aux LLPS contiennent de longues régions intrinsèquement désordonnées qui restent généralement observables en phase condensée ; cependant, dans les protéines plus structurées, ce n’est pas le cas.

L’ajustement REDIFINE (Figure 1D et Figure 3A,B) a révélé plusieurs paramètres uniques pour cet échantillon FUS NTD. Plus précisément, elle a déterminé les coefficients de diffusion dans les phases diluée et condensée (D_dil et_{D cond}), la population de protéines en phase condensée (ν_cond), la taille moyenne des gouttelettes R et la perméabilité en interphase p. La taille des gouttelettes et la perméabilité définissent le taux d’échange d’interphase de la phase condensée à la phase diluée k_cd=3p/R, nous permettant d’obtenir les informations sur la dynamique de l’échange¹⁹.

Ces résultats peuvent être visualisés de différentes manières (Figure 3B). En utilisant un diagramme d’araignée, on pourrait comparer les résultats entre différentes conditions ou échantillons. D’un autre côté, on peut représenter de façon picturale les paramètres REDIFINE dans le modèle pour les visualiser de la manière la plus efficace. Notez que REDIFINE fournit tous ces résultats sans étiquette en seulement quelques heures en utilisant un seul échantillon.

Comme le signal RMN de FUS NTD reste détectable en phase condensée (Figure 3C), le CONDENSE-MT ne sera probablement pas applicable en raison du manque de contraste de relaxation. Nous avons enregistré le jeu de données CONDENSE-MT sur FUS NTD, et en effet, aucune différence n’est observée dans le profil MT entre la référence agarose et l’échantillon biphasique FUS NTD (Figure 3C). Cela rend la méthodologie CONDENSE-MT inapplicable à cet échantillon particulier de FUS NTD.

Cependant, le CONDENSE-MT fournit une caractérisation dynamique des condensats d’ARN à expansion répétée (Figure 3C,D)²⁰. Notez que CONDENSE-MT pourrait fournir plusieurs paramètres caractérisant de manière unique l’ARN en phase condensée (Figure 3D), malgré le fait que son signal soit inobservable dans la RMN conventionnelle (Figure 3C). Les paramètres obtenus sont la cinétique d’échange de protons entre le condensat et l’eau en vrac (_{condensat de k, H2O} et k_{H2O, condensat}), le taux de relaxation de T₂ pour le condensat (T_{2, condensat}), reflétant l’étendue de l’arrêt dynamique des biomolécules lors de la condensation, et le taux apparent de R₂ de l’eau en vrac (R_{2, eau}). Ce dernier paramètre est une combinaison linéaire du taux de rotation de l’eau diluée et de l’eau condensée à roulement lent. Des valeurs_d’eau plus élevées de R 2 indiquent une population d’eau plus élevée dans le condensat, ce qui élève le taux apparent global de R₂ d’eau^{à 20} (Figure 2E et Figure 3D).

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES ET DU CODE

Les données brutes LLPS REDIFINE et les codes de traitement sont disponibles dans le dépôt Zenodo : https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . Les données brutes et les codes de traitement de CONDENSE-MT ont été déposés dans le dépôt Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. MATLAB est nécessaire pour le traitement. Ils sont également fournis dans cet article (Fichiers de codage complémentaires).

Figure 1 : Flux de travail REDIFINE. (A) Les mesures de diffusion produisent des courbes de désintégration biphasiques complexes dans des échantillons condensés. La désintégration résultante contient des paramètres déconvoluts décrivant les coefficients de diffusion des espèces en phase condensée et diluée, leurs populations, la taille des gouttelettes et le taux d’échange d’interphase. (B) Pour décoder ces paramètres isolés, il faut enregistrer un jeu de données pseudo-3D en variant non seulement la force du gradient mais aussi les délais de diffusion. Il est absolument essentiel pour la quantification que chaque tranche de ces mesures soit correctement phasée et corrigée à la base de base. (C) Après vérification de la qualité des données mesurées et traitées, ces tranches 1D sont introduites dans le code MATLAB pour analyse et tracé final. (D) Les données sont ensuite ajustées par un solveur de programmation non linéaire. Les paramètres d’ajustement et résultants sont illustrés pour l’échantillon biphasique FUS NTD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Flux de travail CONDENSE-MT (A) Un profil CONDENSE-MT unique observé sur la résonance d’eau, illustrant l’élargissement dû à la présence de biomolécules condensées et d’eau. (B) L’eau est observée pour chaque décalage d’irradiation. (C) Pour la quantification, il est essentiel que tous les spectres soient correctement phasés. (D) Après avoir acquis la résonance d’eau à différents décalages d’irradiation, l’expérience est répétée à différentes puissances d’irradiation. Cela donnera un ensemble de données du signal d’eau relatif en fonction à la fois du décalage d’irradiation et de la puissance d’irradiation (E). Les données sont ensuite ajustées par un solveur de programmation non linéaire. L’ajustement et les paramètres résultants sont illustrés pour l’échantillon d’ARN biphasique 31xCAG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Présentation des résultats de la MT REDIFINE et CONDENSE. (A) Représentation en diagramme d’araignée des paramètres REDIFINE pour une analyse comparative entre échantillons ou conditions. (B) Modèle schématique illustrant les paramètres dérivés de REDIFINE, y compris les coefficients de diffusion, le rayon des gouttelettes, le partitionnement et le taux d’échange interphase. (C) Comparaison des profils CONDENSE-MT acquis pour la référence agarose et la FUS NTD biphasique dans l’agarose à 500 Hz.
(D) Analyse CONDENSE-MT de condensats d’ARN à expansion répétée 31xCAG montrant l’extraction des paramètres et la visualisation des effets de transfert de magnétisation associés au condensat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Installation de REDIFINE. (A) Le domaine N-terminal FUS reste observable lors de la préparation de l’échantillon condensé biphasique. Un signal fort d’amide/amino et de protons aromatiques est observé. (B) La désintégration du signal observée dans l’expérience de diffusion DOSY illustre une désintégration plus rapide de la population protéique en phase diluée et une désintégration plus lente de la protéine en phase condensée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Traitement REDIFINE. (A) Code Matlab utilisé pour l’ajustement REDIFINE, avec des paramètres surlignés là où l’entrée spécifique est nécessaire. L’enclos illustre comment on choisit la zone d’intégration. (B) Minimisation de la fonction d’ajustement et des résultats qui en découlent. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : configuration CONDENSE-MT. (A) Aperçu des expériences RMN requises pour l’analyse CONDENSE-MT, y compris l’expérience d’inversion de l’eau et de récupération (expno 5) et les expériences CONDENSE-MT à différentes puissances d’irradiation (expno 11-18). (B), (C) Aperçu du script Matlab pour la lecture et l’intégration des spectres 1D de l’eau pour les ensembles de données CONDENSE-MT. Les expériences CONDENSE-MT sont données comme main8. Les frontières d’intégration sont saisies en water_left et water_right. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Traitement CONDENSE-MT. (A) Première section du script d’ajustement CONDENSE-MT, qui inclut le raccord de récupération par inversion d’eau (section 1) et l’entrée des paramètres de fond agarose précédemment déterminés. (B) Ajustement et détermination de l’incertitude des paramètres des ensembles de données CONDENSE-MT. Les paramètres de départ de l’ajustement peuvent être définis dans le fit0. (C) Tracé la section du résultat de l’ajustement CONDENSE-MT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage complémentaires : scripts MATLAB pour l’analyse REDIFINE et CONDENSE-MT. Bruker Topspin code pour configurer l’expérience CONDENSE-MT et les scripts MATLAB utilisés pour traiter et ajuster les ensembles de données de diffusion REDIFINE et CONDENSE-MT de transfert de magnétisation, incluant l’intégration des données, l’analyse de relaxation et les routines globales d’ajustement de modèles. MATLAB est nécessaire pour exécuter les scripts. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous avons présenté ici des protocoles détaillés pour la caractérisation sans marqueur, par RMN, des condensats biomoléculaires biphasiques. Cela implique les deux méthodologies émergentes, LLPS REDIFINE et une expérience complémentaire, mais orthogonale, nommée CONDENSE-MT. Bien que généralement applicable, LLPS REDIFINE repose sur la détection biomoléculaire et nécessite un signal observable lors de la séparation de phase pour une analyse correcte. Bien que cela puisse limiter l’applicabilité de la REDIFINE, la majorité des condensats contiennent des protéines aux régions intrinsèquement désordonnées qui sont généralement observables par RMN. En particulier, pour les condensats protéine :ARN et ARN uniquement, le signal des biomolécules en phase condensée s’élargit au-delà des limites de détection lors de la séparation de phase. Si le coefficient de partition dans la phase condensée est élevé, presque aucun signal n’est observé par la RMN conventionnelle. CONDENSE-MT contourne cette limitation de détection en étant une technique observée à l’eau, s’appuyant sur une différence significative de relaxation entre espèces moléculaires en phase diluée et condensée.

Une préparation adéquate de l’échantillon est essentielle pour l’application réussie de REDIFINE et CONDENSE-MT. Il est donc important de s’assurer que l’agarose est entièrement en fusion avant de la transférer dans le mélange, d’éviter la formation massive de bulles d’air lors du transfert et de fournir suffisamment de matière pour remplir de manière fiable un tube RMN avec des mélanges biphasiques qui ont tendance à coller initialement à la paroi vitrée. Pour CONDENSE-MT, il est crucial de transférer de manière reproductible un volume donné d’agarose, car le fond d’agarose sera quantifié séparément. Si la partition des biomolécules entre les phases condensée et diluée est fortement déséquilibrée, ou si l’échange entre phases est très lent ou rapide, les effets REDIFINE ou CONDENSE-MT pourraient être absents ou trop faibles pour une quantification fiable. Cela peut représenter une limitation clé de ces techniques. Dans ce cas, cependant, augmenter ou diminuer la température peut être utile, car la température est un puissant modulateur du partitionnement moléculaire et des taux d’échange chimiques. Une fois les ensembles de données acquis, les résultats d’ajustement optimaux sont souvent obtenus de manière itérative en répétant l’optimisation computationnelle en utilisant les paramètres de meilleur ajustement de l’ajustement initial ou précédent comme valeurs d’entrée.

Pour les systèmes qui produisent de forts effets REDIFINE et CONDENSE-MT, ces expériences peuvent fournir des informations sans étiquetage sur la partition moléculaire, les taux de change et la dynamique moléculaire, difficiles à obtenir avec d’autres méthodes sans marqueur. De plus, les méthodes basées sur la RMN sont généralement non invasives, permettant d’analyser plusieurs fois les échantillons ou de les stocker pendant de longues périodes, permettant ainsi de surveiller les propriétés du condensat au fil du temps. Cela suscite un intérêt particulier dans le contexte de la maturation pathologique du condensat de la fibrilisation, qui est difficile à étudier avec des méthodes complémentaires sur de très longues périodes.

Étant donné que les organites cellulaires sans membrane sont généralement des assemblages multicomposantes avec une architecture complexe, les applications futures de cette technique incluront la détection et la caractérisation de systèmes modèles de condensats multicomposantes de plus en plus sophistiqués, ainsi que des analyses de condensats dans un contexte cellulaire via RMN intégrée. Cela nécessite cependant l’adaptation de REDIFINE ou CONDENSE-MT à de tels systèmes complexes, et des efforts sont en cours pour y parvenir.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Spectromètre RMN Avance NEO 700 MHz	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Les données sont acquises sur un spectromètre RMN à 700 MHz.
Effet de dessus	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Les données sont traitées à l’aide de ce logiciel.
Protéine FUS NTD		N/A	Cette protéine est exprimée et purifiée dans notre laboratoire
ARN 31xCAG		N/A	L’ARN est produit et purifié dans notre laboratoire
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Les données sont traitées et visualisées à l’aide de ce logiciel.