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Article de méthode

Cytologie bronchoscopique et séquençage métagénomique pour différencier les lésions pulmonaires liées au traitement du cancer et infectieuses

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DOI :

10.3791/70725

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26 mai 2026

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1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) par collecte intégrée guidée par bronchoscopie, analyse cytologique et séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS). Ce flux de travail complet distingue avec précision les lésions pulmonaires liées au traitement du cancer des infections pulmonaires, facilitant ainsi des décisions cliniques précises et rapides.

Résumé

Les patients atteints de lésions pulmonaires liées au traitement du cancer (CTLI) présentent fréquemment des symptômes respiratoires non spécifiques et des modifications radiologiques qui imitent étroitement une pneumonie infectieuse ou une progression tumorale, ce qui représente un défi important pour un diagnostic définitif. Les processus diagnostiques traditionnels, principalement évalués à l’aide de biomarqueurs sanguins et de cultures microbiennes standard, ne permettent généralement pas de poser un diagnostic clair et prennent trop de temps. Nous présentons ici un protocole complet pour diagnostiquer le LCT en combinant l’analyse cytologique par liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) avec le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS). Le flux de travail procédural se compose de trois étapes principales. Tout d’abord, une bronchoscopie standardisée est réalisée pour obtenir des échantillons de BALF de haute qualité. Deuxièmement, l’analyse cytologique des échantillons de BALF obtenus fournit un instantané du microenvironnement pulmonaire. Cela permet d’identifier les caractéristiques inflammatoires et de dépister les cellules malignes afin d’exclure la progression tumorale. Enfin, le mNGS est utilisé pour identifier ou exclure les étiologies infectieuses actives. Cette technique génomique avancée permet une détection rapide, très sensible et impartiale des agents pathogènes, surmontant avec succès les limites des cultures traditionnelles. Les résultats représentatifs utilisant cette méthode démontrent que cette approche peut distinguer efficacement la pneumonite immunitaire des infections pulmonaires actives ou de la progression tumorale. Comparé aux méthodes diagnostiques traditionnelles, ce protocole a l’avantage de distinguer rapidement et précisément les CTL des étiologies infectieuses et des malignités occultes. En fin de compte, ce flux de travail standardisé clarifie les diagnostics cliniques, guide les décisions de traitement critiques et améliore les résultats pour les patients.

Introduction

Les avancées dans les traitements antitumoraux, telles que les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires et les thérapies ciblées, ont significativement amélioré la survie des patients mais ont également augmenté l’incidence des toxicités pulmonaires non infectieuses, collectivement appelées lésions pulmonaires liées au traitement du cancer (CTLI)1,2,3,4,5,6,7 . Notamment, la pneumonite inhibitrice des points de contrôle (CIP) s’est révélée un événement indésirable immunitaire fatal, avec des taux d’incidence globaux de 2 à 19 % et des taux de mortalité atteignant jusqu’à 35 %. Le diagnostic de l’ICC présente un défi clinique majeur car ses symptômes respiratoires non spécifiques et ses manifestations radiologiques — telles que les opacités du verre poli, la consolidation ou les opacités réticulaires — ressemblent étroitement à ceux de la pneumonie infectieuse ou de la progressiontumorale 11,12,13,14.

Actuellement, un diagnostic de LCT doit être déterminé en excluant soigneusement d’autresétiologies 15. Les flux de travail diagnostiques traditionnels reposent fortement sur des biomarqueurs sanguins et des cultures microbiennes standard, qui sont longs et ne donnent souvent pas de diagnostic définitif 16,17,18,19,20,21,22,23. Bien que la biopsie pulmonaire chirurgicale fournisse des preuves histopathologiques claires, son caractère invasif la rend inadaptée aux patients atteints de cancer en gravesse. Par conséquent, il est crucial de mettre en place une approche diagnostique efficace et peu invasive. En pratique clinique, le protocole décrit ici doit être appliqué aux patients atteints de cancer qui ont déjà reçu ou reçoivent actuellement des traitements antitumoraux (par exemple, immunothérapie ou thérapie ciblée) et présentent de nouveaux symptômes respiratoires ainsi que des modifications à l’imagerie pulmonaire. Il est particulièrement recommandé lorsque le CTLI est suspecté cliniquement, les tests non invasifs standards ne fournissent pas un diagnostic clair, et que le patient ne tolère pas les examens chirurgicaux invasifs.

La bronchoscopie combinée au lavage bronchoalvéolaire (BAL) sert de « biopsie liquide » mini-invasive des voiesrespiratoires inférieures 24. En intégrant l’analyse cytologique du liquide BAL (BALF) avec le séquençage de nouvelle génération métagénomique (mNGS), cette approche améliore significativement les flux de travail diagnostiques existants. Premièrement, la cytologie BALF fournit un instantané direct du microenvironnement pulmonaire ; il peut identifier des caractéristiques inflammatoirescaractéristiques 25, telles que la lymphocytose et un rapport inversé CD4/CD8 dans la CIP, tout en dépistant simultanément les cellules malignes pour exclure la progressiontumorale 26,27,28,29,30. Deuxièmement, le mNGS permet une détection rapide, très sensible et impartiale des agents pathogènes, surmontant les faibles taux de détection et les délais des cultures traditionnelles, en particulier pour les bactéries méticuleuses ou les agents pathogènesatypiques 31,32,33,34,35. L’utilisation combinée de ces modalités a démontré qu’elle améliore significativement la détection des infections mixtes et guide des traitements précis, réduisant drastiquement la mortalité despatients 4,5.

Malgré ce potentiel clinique, il n’existe actuellement aucun protocole standardisé pour la collecte et l’analyse complètes des BALF dans le contexte des CTLI. Ici, nous introduisons un protocole standardisé pour obtenir et traiter la BALF via bronchoscopie, combinant explicitement l’évaluation cytologique avec la mNGS. La nouveauté méthodologique de ce flux de travail réside dans sa capacité diagnostique à double volets : il utilise la cytologie pour cartographier le microenvironnement immunitaire et exclure les malignités, ainsi que le mNGS pour éliminer de manière définitive ou éliminer les infections actives. Comparé aux méthodes diagnostiques traditionnelles, ce protocole intégré offre l’avantage distinct de différencier rapidement et précisément le CTL des étiologies infectieuses et de la progression tumorale occulte. En fin de compte, ce flux de travail standardisé accélère le calendrier diagnostique et guide des interventions cliniques ciblées et opportunes (Figure 1).

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Protocole

Ce protocole respecte les principes de la Déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le comité d’examen institutionnel de notre hôpital. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants avant la procédure.

1. Préparation préalable à la procédure

  1. Évaluation du patient (dans la semaine suivant la bronchoscopie)
    1. Obtenir des analyses de laboratoire récentes, incluant une ligne sanguine complète et un profil de coagulation, afin d’assurer la sécurité d’une procédure invasive (Fichier Supplémentaire 1).
    2. Réalisez un électrocardiogramme à 12 dérivations.
    3. Évaluez les signes vitaux et assurez-vous d’assurer la stabilité hémodynamique.
    4. Mesurez la saturation en oxygène au repos du patient dans l’air ambiant pour évaluer la fonction pulmonaire.
      REMARQUE : Si le SpO₂ est faible ou si le patient présente une atteinte respiratoire, envisagez une analyse des gaz artériels pour vérifier le PaO₂/PaCO₂ de base.
    5. Vérifiez toutes les contre-indications.
    6. Demandez au patient de jeûner pendant au moins 6 heures et d’éviter de boire de l’eau pendant 2 heures avant la procédure afin de réduire le risque d’aspiration.
    7. Effectuez une aspiration buccale et nasale ainsi qu’un nettoyage immédiatement avant la procédure afin de minimiser la contamination des voies respiratoires supérieures.
  2. Préparation de l’équipement et du personnel
    1. Préparez tous les appareils de bronchoscopie et le matériel de surveillance nécessaires. Sélectionnez une taille de bronchoscope appropriée en fonction de l’anatomie des voies respiratoires du patient. Vérifiez la fonction d’aspiration du bronchoscope.
      REMARQUE : Veillez à ce que l’équipement de réanimation d’urgence, y compris les dispositifs d’apport d’oxygène supplémentaires et les appareils d’aspiration, soit immédiatement disponible dans la salle de procédure pour gérer d’éventuelles complications des voies respiratoires. Tout bronchoscopiste certifié avec une formation standard peut réaliser cette procédure de manière indépendante, sans certifications spécialisées.
    2. Réchauffez la solution physiologique stérile (0,9 % de NaCl) destinée au lavage à 37 °C.
    3. Extraire 100 à 150 mL de la solution saline stérile chauffée dans plusieurs seringues de 20 mL pour faciliter une installation rapide.
  3. Installation du positionnement et de la surveillance du patient
    1. Placez le patient allongé sur la table de bronchoscopie.
    2. Installez un équipement de surveillance continue pour le patient avant de commencer la procédure.
      1. Appliquer un électrocardiogramme (ECG) directement sur la poitrine du patient pour un suivi continu de l’activité cardiaque.
      2. Connectez une sonde d’oxymètre de pouls au doigt du patient pour surveiller en continu la saturation en oxygène sanguin et le pouls.
      3. Fixez un brassard non invasif sur le haut du bras du patient pour détecter en continu la tension veineuse.
  4. Installation du dispositif de soutien à l’oxygène et sevrage post-procédure
    1. Préparez et configurez le dispositif de soutien à l’oxygène approprié en fonction de l’état respiratoire de base du patient. Complétez cette configuration avant d’initier la bronchoscopie.
    2. Installation de canules nasales à haut débit (HFNC)
      1. Sélectionnez un système HFNC pour les patients avec unSpO2 ≥ 90 % de l’air ambiant et sans hypercapnie. Connectez la canule au patient et réglez le débit initial de gaz à ≥60 L/min avec unFiO 2 de 1,0. Titrez leFiO 2 en continu pendant la procédure pour maintenir unSpO 2 ≥ 90 %.
    3. Stratégie de transition pour les patients en ventilation non invasive (NIV)
      1. Retirez le masque NIV et transférez le patient vers un système HFNC immédiatement avant l’insertion du bronchoscope. Réglez le débit de gaz HFNC à ≥60 L/min avec unFiO 2 de 1,0. Effectuez une aspiration active des voies respiratoires pendant la période de démasque pour éliminer les sécrétions et optimiser la perpétuité des voies respiratoires.
      2. Surveillez de près le patient pour détecter une désaturation lors de la transition temporaire de la VNI vers l’HFNC. Si le SpO₂ descend en dessous de 90 % et reste réfractaire à l’aspiration et aux réglages maximaux de HFNC, interrompez immédiatement la bronchoscopie. Remettre rapidement le masque NIV pour rétablir la pression positive ou passer à une intubation endotrachéale invasive si l’état respiratoire du patient se détériore.
    4. Installation de ventilation mécanique invasive (IMV)
      1. Réglez le volume de marée à 6–8 mL/kg de poids corporel prévu, FiO₂ à 1,0, pression expiratoire positive (PEEP) à 5–8 cmH₂O, et fréquence respiratoire à 12–16 respirations/min. Insérez le bronchoscope directement à travers le tube endotrachéal établi.
    5. Maintenir une surveillance continue des signes vitaux après la fin du lavage bronchoalvéolaire (BAL). Titrez l’oxygène supplémentaire pour maintenirSpO 2 entre 92 % et 96 % (ou 88 % à 92 % pour les patients atteints d’hypercapnie chronique).
    6. Vérifiez que le patient remplit tous les critères suivants avant de réduire le soutien en oxygène : sortie complète de la sédation, restauration des réflexes protecteurs des voies respiratoires, stabilité hémodynamique, absence de saignement actif ou de bronchospasme sévère.
    7. Pour le sevrage HFNC, il faut d’abord désamorcer la concentration, puis le débit. Diminuez le FiO₂ par incréments de 5 % à 10 % jusqu’à atteindre ≤40 %. Ensuite, diminuez le débit par incréments de 5 % à 10 %. Arrêtez complètement le traitement HFNC lorsque le patient maintient la SpO₂ cible avec un FiO₂ ≤ 35 % et un débit ≤ 20 L/min.
    8. Pour le sevrage du VNI, assurez-vous que l’hypoxémie est améliorée et que les signes vitaux sont stables, puis procédez à l’une des deux méthodes suivantes :
      1. Diminuez l’IPAP de 2–3 cmH₂O par ajustement, réduisez la PEEP à 4–5 cmH₂O, et diminuez la FiO₂ à ≤40 %.
      2. Pour le sevrage intermittent, il faut faire passer le patient à la HFNC afin de faciliter et prolonger progressivement la durée de la respiration spontanée. Reprenez immédiatement un soutien complet de la VNI si le patient présente une tachypnée (>30 respirations/min), une tachycardie (>140 battements/minute), une fatigue des muscles respiratoires, un état mental altéré ou SpO₂ < 90 %.
    9. Pour le sevrage IMV, effectuez un essai respiratoire spontané ou un test de fuite du brassard. Procéder à l’extubation seulement après que le patient ait réussi l’essai, démontré une force de toux spontanée adéquate et des sécrétions minimes des voies respiratoires.
  5. Sédation et anesthésie
    1. Injectez 15 mL de lidocaïne à 2 % dans la muqueuse nasale et l’oropharynx, divisés en 2 à 5 doses.
    2. Injectez 10 mL de lidocaïne à 2 % en doses fractionnées par le canal de travail du bronchoscope. Appliquez ces doses étape par étape tout en avançant le bronchoscope dans les voies respiratoires pour couvrir la muqueuse trachéale, la carine et l’arbre bronchique.
      REMARQUE : La dose maximale absolue de lidocaïne topique est incertaine. La toxicité survient généralement lorsque la concentration sérique dépasse 5 μg/mL, mais des effets secondaires subjectifs peuvent apparaître à des concentrations plus faibles. Suivez attentivement le volume total d’anesthésiant administré.
    3. Administrez une sédation systémique selon les préférences du patient, son degré d’anxiété et la tolérance attendue à la procédure afin d’assurer une anesthésie adéquate, maximiser le confort du patient et réduire la toux. Administrez du midazolam 2–2,5 mg par injection intraveineuse progressive, ou réduisez la dose à 0,5–1 mg pour les patients fragiles ou âgés36.
    4. Le Monitor SpO₂, l’ECG et la pression artérielle non invasive (NIBP) sont adoptés encontinu 37.
      REMARQUE : La sédation systémique augmente significativement les risques d’hypoxémie réfractaire, d’effondrement des voies respiratoires et d’intubation trachéale d’urgence. Surveillez de près le patient tout au long de la procédure.

2. Procédure BAL

REMARQUE : Effectuez la procédure de collecte du BALF strictement conformément aux protocoles standards et aux directives de pratique clinique.

  1. Sélection du segment pulmonaire cible (Figure 2)
    1. Examinez la dernière tomographie thoracique à haute résolution (HRCT) du patient avant la procédure afin de déterminer la répartition anatomique précise de la maladie pulmonaire.
    2. Sélectionnez le segment pulmonaire cible pour le BAL en fonction de la répartition spécifique de la maladie identifiée sur l’échographie HRCT.
    3. Dirigez le bronchoscope pour effectuer le lavage dans le segment le plus affecté radiographiquement ou dans le segment démontrant la progression la plus rapide pour une maladie localisée ou fortement asymétrique.
    4. Dirigez le bronchoscope pour laver soit le lobe moyen droit, soit la lingule du lobe supérieur gauche pour détecter une maladie diffuse ou symétrique, car ces sites anatomiques offrent généralement un retour de liquide adéquat.
  2. Prélavage et rejet d’échantillons
    1. Injectez 20 à 30 mL de solution saline chauffée à travers le bronchoscope dans le segment coincé. Attendez 20 à 30 s.
    2. Appliquez une succion douce (pression négative 50–100 mmHg) pour aspirer le liquide à nouveau. Collectez cette première aliquote dans un piège et jetez-la sans l’envoyer pour analyse, car elle peut contenir du mucus et des débris bronchiques.
  3. Procédure principale de lavage
    1. Fixez fermement une seringue stérile contenant 0,9 % de solution physiologique normale au port du canal de travail du bronchoscope.
    2. Injectez 20 mL de solution saline par le canal de travail sur 3 à 5 s. Faites une pause immédiate de 5 à 10 secondes après l’injection, permettant au liquide de se disperser complètement et de se déposer dans les espaces alvéolaires distaux par gravité.
    3. Appliquez une succion douce pour récupérer le liquide injecté dans un piège stérile de collecte. Maintenez une pression d’aspiration inférieure à 100 mmHg pour éviter un effondrement important des voies respiratoires ou des dommages à la muqueuse des voies respiratoires.
    4. Répétez strictement la séquence d’instillation, de pause et d’aspiration jusqu’à ce que le volume total infusé soit compris entre 100 et 150 mL afin de garantir que l’échantillon des voies respiratoires inférieures soit adéquat et représentatif.
      REMARQUE : Surveillez en permanence les signes vitaux, la saturation en oxygène et le confort du patient tout au long de la procédure. Interrompez immédiatement la procédure en cas de toux ou de désaturation sévère et ne reprenez qu’après la stabilisation du patient.
  4. Technique de récupération des fluides
    1. Utilisez une basse pression d’aspiration (≤100 mmHg) pour éviter l’effondrement des voies respiratoires.
    2. Utilisez une technique de « succion pulsée » au lieu d’une aspiration continue : occlus intermittent et relâchez le tube d’aspiration pour permettre à l’air de se mélanger, mobilisant le liquide et empêchant la bronche de s’effondrer contre le scope.
    3. Ciblez une récupération d’au moins 40 à 60 mL de BALF.
      REMARQUE : Arrêtez le lavage si le patient développe des complications (par exemple, bronchospasme, hypoxémie intolérable), même si le volume complet n’est pas récupéré. Limitez le temps total de l’intervention pour l’instillation et l’aspiration de la BAL en dessous de 2 à 3 minutes afin de minimiser le risque d’hypoxie.
  5. Soins post-lavage
    1. Retirez le bronchoscope avec précaution après avoir terminé le BAL.
    2. Aspirez les sécrétions restantes des voies aériennes centrales.
      REMARQUE : Poursuivre le soutien HFNC ou NIV si utilisé jusqu’à ce que le patient soit stable pendant la récupération. Surveillez le patient pour détecter des complications post-procédurales, telles que des saignements ou un pneumothorax.

3. Manipulation des échantillons et contrôle qualité

  1. Mesure, transport et évaluation initiale du BALF
    1. Notez le volume de liquide retourné par rapport au volume injecté immédiatement pendant la procédure.
    2. Calculez le pourcentage de récupération à l’aide de la formule suivante :
      Pourcentage de récupération = (volume récupéré / volume instillé) × 100 %
      REMARQUE : Une récupération de ≥30 % est généralement considérée comme un bon échantillon de BALF.
    3. Mettez immédiatement le BALF collecté sur la glace. Transportez rapidement le BALF au laboratoire.
      ATTENTION : Les échantillons humains de BALF sont potentiellement infectieux. Manipulez tous les échantillons avec les précautions standard appropriées.
    4. Observez et enregistrez la couleur macroscopique et la turbidité de l’échantillon de BALF avant le traitement.
      REMARQUE : Un liquide clair ou jaune pâle sans turbidité visible est typique des états non infectieux. Une apparence trouble ou lactée est associée à une protéinose alvéolaire pulmonaire (PAP)38. Un liquide purulent indique une infection bactérienne potentielle. Un liquide teinté de sang indique un saignement potentiel ou une hémorragie alvéolairediffuse 39.
  2. Évaluation de la viabilité cellulaire
    1. Diluez le BALF à une concentration d’environ 1 × 106 cellules/mL à l’aide de solution physiologique stérile.
    2. Mélangez le BALF dilué avec du bleu de Trypan à un rapport volumique de 1:1 pour obtenir un mélange réactionnel de 20 μL.
      ATTENTION : Le bleu de trypan est un produit chimique toxique et un cancérogène suspecté.
    3. Incubez le mélange de réaction pendant 3 minutes à température ambiante (environ 25 °C).
    4. Placez le mélange sur un hémocytomètre. Examinez les cellules sous un microscope optique à faible puissance.
    5. Compter au moins 200 cellules pour déterminer systématiquement la viabilité des cellules.
      REMARQUE : Les cellules viables restent non colorées, transparentes et morphologiquement intactes, tandis que les cellules non viables absorbent le colorant bleu. Une viabilité initiale des cellules de >90 % à 95 % est nécessaire pour garantir des décomptes cytologiques en aval fiables.
  3. Distribution aliquote
    1. Divisez le BALF en tubes désignés pour différentes analyses lors de l’opération de lavage.
    2. Désigner le tube 1 comme « rejeté » pour la première aliquote retournée.
    3. Désignez le tube 2 pour la microbiologie et allouez 10 à 20 mL de BALF pour l’analyse des agents pathogènes (par exemple, mNGS).
      REMARQUE : Effectuez simultanément en pratique clinique une coloration/culture bactérienne de Gram, une coloration/culture fongique, un frottis bacille acido-rapide (AFB) et la PCR.
    4. Désigner le tube 3 pour la cytologie et réserver au moins 10 mL pour le nombre total et différentiel de cellules.
    5. Désigner le tube 4 comme réserve optionnelle et stocker tout liquide restant (à 4 °C pour les courtes durées ou -80 °C à long terme) pour des tests supplémentaires.
      REMARQUE : Congelez immédiatement l’échantillon de mNGS à -80 °C si le test ne peut pas commencer immédiatement. Des échantillons de cytologie de procédé frais ; si un délai est anticipé, réfrigérez l’échantillon à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures pour préserver la morphologie cellulaire.

4. Traitement en laboratoire du BALF

  1. Nombre total de cellules
    1. Inversez le tube pour mélanger doucement le BALF et resuspendez les cellules.
    2. Diluez le BALF avec un volume approprié de solution physiologique stérile si l’échantillon contient des bouchons de mucus macroscopiques et des débris.
    3. Humidifier soigneusement une gaze médicale stérile avec un sérum stérile avant la filtration. Filtrez l’échantillon dilué à travers deux couches de gaze médicale stérile pré-humidifiée.
    4. Collectez le filtrat dans un tube de collecte stérile. Comptez le nombre total de cellules nucléées à l’aide d’un analyseur d’hématologie.
      REMARQUE : Une faible contamination par les cellules épithéliales (<5 % des cellules) et une proportion minimale de globules rouges (<10 %) indiquent un échantillon alvéolaire de haute qualité.
  2. Nombre différentiel de cellules
    1. Transférez 1 mL de l’échantillon de BALF bien mélangé dans un microtube de 1,5 mL. Centrifugez le microtube à 211 × g pendant 5 minutes pour concentrer les cellules.
    2. Retirez le surnageant, laissant exactement 50 à 100 μL de liquide dans le microtube. Resuspendez soigneusement la pastille cellulaire dans le surnageant restant.
    3. Pipette 10–20 μL de la suspension à cellules resuspendues sur la surface d’une lame en verre propre, près du bord dépoli.
    4. Tenez une seconde culasse en verre propre à un angle de 30 à 45° par rapport à la première. Poussez la seconde lame vers l’avant en utilisant une technique de coin en forme de coin pour créer une fine couche cellulaire uniforme.
    5. Répétez les étapes 4.2.3 à 4.2.4 pour préparer 2 à 3 diapositives identiques.
    6. Laissez les lames étalées sécher complètement à température ambiante.
    7. Teindre les lames selon la méthode Wright-Giemsa.
    8. Observez les lames colorées au microscope optique à l’aide d’un objectif d’immersion à haute puissance (grossissement de 1 000×).
    9. Identifier et catégoriser au moins 400 cellules pour déterminer le nombre différentiel de cellules.
      REMARQUE : Conservez tout échantillon de BALF présentant un fort soupçon clinique de malignité à 4 °C et soumettez-le au laboratoire central de pathologie pour cytocentrifugation standardisée dans les 2 heures suivant la collecte de l’échantillon.
  3. Pipeline mNGS
    1. Inactivez l’échantillon de liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) en l’incubant à 65 °C pendant 30 minutes.
    2. Transférer 0,5 mL de l’échantillon de BALF inactivé dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 1 g de billes de verre de 0,5 mm.
    3. Fixez le tube de la microcentrifuge sur une plateforme horizontale sur un mélangeur vortex. Agitez le mélange à 2 800–3 200 tr/min pendant 30 minutes pour faciliter la perturbation mécanique de la paroi cellulaire microbienne et la libération ultérieure de l’ADN.
    4. Centrifugez brièvement le tube pour stabiliser les billes, puis transférez soigneusement 0,3 mL du surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    5. Extraire les acides nucléiques totaux du surnageant à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN en microvolume, en suivant strictement les instructions du fabricant.
    6. Mesurez la concentration de l’ADN extrait à l’aide d’un fluoromètre.
    7. [POINT DE PAUSE] Stockez l’ADN extrait à -20 °C pour une utilisation à court terme ou à -80 °C pour un stockage à long terme si la préparation de la bibliothèque n’est pas effectuée immédiatement.
    8. Construisez les bibliothèques métagénomiques à partir de l’ADN extrait en utilisant un kit de préparation de bibliothèque à très faible intensité.
    9. Inspectez les bibliothèques construites pour garantir la taille appropriée des fragments et la concentration suffisante.
    10. Séquencez les bibliothèques qualifiées sur une plateforme de séquençage à haut débit.
  4. Analyse des données de séquençage
    1. Éliminer les lectures de faible qualité et les séquences adaptatrices des données brutes de séquençage à l’aide d’un logiciel de traitement de séquence.
    2. Les lectures de défausse longueur inférieures à 35 paires de bases (pb), les lectures présentant une faible complexité, et celles avec un score de qualité Phred (score Q) inférieur à 20.
    3. Alignez les lectures de haute qualité au génome de référence humain (version hg38) en utilisant un algorithme d’alignement de Burrows-Wheeler pour identifier les séquences d’ADN humain.
    4. Écartez les séquences d’hôte humain alignées pour isoler les données de séquençage non hôte.
    5. Analysez les lectures restantes de séquençage non hôte dans une base de données de référence de classification afin d’obtenir des informations microbiennes au niveau de l’espèce. Construisez la base de données à partir de bases de données de génomes microbiens publiées, telles que la base de données de séquences de référence du National Center for Biotechnology Information (NCBI). Assurez-vous qu’elle contient des données complètes sur les agents pathogènes (par exemple, 25 863 agents pathogènes comprenant 12 142 bactéries, 2 680 champignons, 10 061 virus, 654 parasites, 206 mycobactéries et 120 mycoplasme/chlamydia).
    6. Établir des contrôles négatifs (« sans modèle », NTC) et positifs en les traitant selon les mêmes procédures d’extraction, de préparation de bibliothèque et d’analyse bioinformatique.
    7. Examinez le nombre de lecture strictement cartographié (SMRN) et la couverture génomique pour l’évaluation diagnostique.
      REMARQUE : Le SMRN désigne la quantité de séquences précisément alignées avec le micro-organisme au niveau de l’espèce.
    8. Classez un résultat bactérien, fongique, mycoplasma ou chlamydia mNGS comme positif si le micro-organisme n’est pas détecté dans la NTC ET que sa couverture génomique figure parmi les 10 premiers microbes du même genre, OU si le ratio de SMRN_sample à SMRN_NTC est > 10 (lorsque SMRN_NTC ≠ 0).
    9. Confirmez que le SMRN_sample atteint les seuils minimums suivants pour un résultat positif : ≥3 pour les bactéries, champignons, mycoplasmes et chlamydies ; ≥100 pour les parasites ; et ≥1 pour Mycobacterium tuberculosis.
    10. Classez un résultat viral de mNGS comme positif si le virus n’est pas détecté dans le NTC, OU si le ratio de SMRN_sample à SMRN_NTC est >5 (lorsque SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Confirmez que le SMRN_sample pour les virus est ≥1.
    12. Dressez une liste des agents pathogènes candidats avec leurs décomptes de lectures ou leurs abondances relatives.
    13. Consignez tous les gènes de résistance aux antibiotiques ou facteurs de virulence identifiés par le pipeline de bioinformatique.
    14. Définir un impact significatif en combinant le nombre de lectures, la comparaison statistique avec les groupes témoins et la pertinence clinique.
    15. Évaluez si chaque agent pathogène identifié peut expliquer la situation clinique.

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Résultats

En suivant le protocole standardisé ci-dessus, les cliniciens peuvent obtenir de manière reproductible des échantillons de BALF de haute qualité et utiliser à la fois des analyses cellulaires et génomiques pour distinguer le CTLI de ses imitateurs. Ci-dessous, nous présentons un résultat représentatif de notre cas pour illustrer les résultats typiques. Une femme de 68 ans avec un cancer du poumon de stade IV peu différencié (tumeur primaire de la région pleurale droite) sous immunothérap...

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Discussion

À l’ère actuelle de la thérapie contre le cancer, les lésions organiques liées au traitement, telles que celles induites par des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI), restent une préoccupation clinique majeure pouvant limiter la progression du traitement voire êtremortelle 3,4. Parmi les événements indésirables immunitaires (IRAE) induits par l’ICI, la pneumonite a suscité une attention significative en tant que c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Déclaration d’assistance à l’IA :
Les auteurs déclarent l’utilisation de technologies assistées par IA lors de la préparation de ce manuscrit. Plus précisément, Gemini by Google a été utilisé exclusivement pour peaufiner la langue anglaise, corriger les fautes grammaticales et garantir que la mise en forme structurelle respecte les directives de la revue. L’outil d’IA n’a pas été utilisé pour la génération de données, l’analyse ou l’interprétation des résultats scientifiques. Tous les auteurs ont examiné minutieusement le texte généré, effectué les modifications nécessaires et assumé l’entière responsabilité de l’exactitude scientifique et de l’intégrité du manuscrit final.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet d’amélioration des capacités des technologies de santé de la Commission provinciale de la santé du Jilin (Subvention n° 2023JC007).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 % de lidocaïneHunan KelunN/AAnesthésie locale pour la muqueuse des voies respiratoires.
Des perles en verre de 0,5 mmSigmaN/AUtilisé pour la perturbation mécanique de la paroi cellulaire des microbes.
Bronchoscope électronique BF-260OlympeN/ALe bronchoscope est utilisé pour obtenir le liquide de lavage alvéolaire.
Alignement Burrows-WheelerOpen Source0.7.17(RRID :SCR_010910)Algorithme pour la cartographie des séquences vers le génome humain.
Instrument d’oxygénothérapie humidificée à haut débitBMC MedicalN/AFournir un certain débit, un gaz respiratoire chauffé et humidifié pour les patients ayant une respiration spontanée.
Mélangeur vortexScientifique & nbsp ; IndustriesN/AIndustries scientifiques
MidazolamJiangsu EnhuaN/ASédatif systémique pour le confort du patient.
Plateforme Nextseq 550IlluminaN/ALa séquence génique nécessaire pour séquencer le génome dans BALF
Kit de bibliothèque d’entrée ultrabasse QIAseqTiangenN/AKit pour construire une bibliothèque métagénomique
Qubit 4.0Thermo Fisher ScientificN/AInstrument pour détecter la teneur en acides nucléiques BALF
Kit micro-ADN TIANamp DP316TiangenN/ALe kit d’extraction d’ADN pour extraire les acides nucléiques totaux de BALF
Bleu de trypanBiosharpN/AColorant utilisé pour l’évaluation de la viabilité cellulaire.
  ; Bain marieJoanN/AUtilisé pour l’inactivation de l’échantillon BALF à 65 °C.
Teinture de Wright-GiemsaYuanmuN/AUtilisé pour la coloration cellulaire différentielle.
Analyseur d’hématologie XN-9000SysmexSN-13699Analyseur d’hématologie pour compter le total des cellules nucléées à partir d’un échantillon de BALF

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