In Vitro Analyse fonctionnelle des lymphocytes T régulateurs : accent sur la prolifération et la différenciation

Résumé

Ce protocole fournit une stratégie de co-culture in vitro pour étudier les effets des lymphocytes T régulateurs sur la prolifération et la différenciation des lymphocytes T effecteurs.

Résumé

Les cellules T régulatrices (Treg) jouent un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie immunitaire. Des anomalies dans la fonction des cellules Treg sont associées à diverses maladies, notamment les maladies auto-immunes, le rejet de greffe d’organes, les infections et le cancer. La manipulation des cellules de Treg est considérée comme une stratégie thérapeutique potentielle pour traiter les maladies inflammatoires, notamment les maladies auto-immunes, le rejet de greffe d’organes solides, la maladie greffe contre hôte et les maladies allergiques. Les tests classiques de suppression des cellules Treg in vitro évaluent principalement l’effet inhibiteur des cellules Treg sur la prolifération des cellules effecteurs T (Teff). Cependant, en plus de la prolifération, la différenciation des lymphocytes T est importante pour que les lymphocytes T accomplissent leurs fonctions immunitaires. Par conséquent, ce protocole propose un test de suppression des cellules Treg modifié in vitro pour étudier les effets des cellules Treg sur la prolifération et la différenciation des cellules Teff. Dans ce protocole, la préparation des cellules Treg de souris et des lymphocytes T naïves est d’abord introduite, suivie de la stratégie de co-culture pour étudier les effets régulateurs des cellules Treg sur la prolifération et la différenciation des cellules Teff, y compris les cellules Th1 et Th17, et enfin la stratégie de coloration pour la cytométrie en flux après co-culture. Cette analyse fonctionnelle in vitro des cellules Treg peut être utilisée pour étudier les effets des cellules Treg sur la prolifération et la polarisation des cellules T.

Introduction

^CD4+CD25^+Foxp3+ les cellules régulatrices T (Treg) sont des médiateurs importants de l’homéostasie^{immunitaire 1}. Les cellules Treg suppriment activement les réponses immunitaires excessives et maintiennent une tolérance auto-immune, empêchant ainsi les réactions immunitaires d’endommager les tissus et organes^{normaux 2}. La manipulation des cellules Treg est considérée comme une stratégie thérapeutique potentielle pour traiter des maladies inflammatoires telles que les maladies auto-immunes, le rejet de greffe d’organes solides, la maladie greffe contre hôte, et^{les maladies allergiques 3,4,5}. Par contre, inhiber la fonction des cellules Treg est considéré comme une stratégie efficace pour activer l’immunité^{antitumorale 6,7}. Des études cliniques ont étudié la thérapie adoptive par cellules T régulatrices ou le traitement à faible dose d’IL-2 pour les maladies auto-immunes, la transplantation d’organes solides et la maladie greffe contre hôte ^8,9,10. De plus, des études sur les cellules Treg-Treg modifiées, incluant les cellules Treg réceptrices chimériques (CAR)-Treg et les cellules T-T (TCR)-Treg, attirent également une attention^{croissante 11,12}.

À ce jour, la thérapie par cellules Treg n’a pas été largement établie dans le traitement clinique de routine. Pour soutenir l’application clinique de la thérapie par cellules Treg, la recherche systématique et l’évaluation de ses fonctions sont essentielles. Une stratégie courante pour évaluer les fonctions des lymphocytes T régulateurs in vitro est le test de suppression Treg in ^{vitro 13}, qui peut détecter la fonction suppressive des cellules Treg sur la prolifération des lymphocytes effecteurs T (Teff). Cependant, le test standard de suppression Treg in vitro n’évalue pas la différenciation des cellules Teff. Si la prolifération et la différenciation des lymphocytes T effecteurs peuvent être évaluées simultanément, on peut obtenir plus d’informations sur la fonction des lymphocytes T régulateurs.

Ici, nous présentons un test modifié de suppression des cellules Treg in vitro, appelé « analyse fonctionnelle in vitro des cellules Treg » (Figure 1). Ce protocole propose une stratégie de co-culture in vitro pour étudier les effets des cellules Treg sur la prolifération et la différenciation des cellules Teff.

Protocole

Toutes les expériences sur la souris ont été autorisées par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital de Chine de l’Ouest, Université du Sichuan (Approbation n° 20250814006, 20211212A). Toutes les souris utilisées dans cette expérience portaient un background génétique C57BL/6.

1. Préparation des solutions

1. Préparez un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : 1× de PBS contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA).
2. Préparez un tampon de tri cellulaire activé par magnétique (MACS) : 1× PBS contenant 0,5 % de BSA et 2 mM d’acide éthylénediamine tétraacétique (EDTA).
3. Préparez un milieu de culture cellulaire : milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 10 mM de HEPES, 55 μM de β-mercaptoéthanol, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.

2. Préparation des lymphocytes de souris C57BL/6

1. Prenez la rate et les ganglions lymphatiques périphériques (LN) d’une souris C57BL/6 âgée de 6 à 8 semaines (mâle ou femelle) dans des conditions stériles et placez-les dans un tube centrifuge de 50 mL avec 5 mL de tampon FACS.
   REMARQUE : La dissection de la rate et des LN doit être réalisée selon les procédures standard.
2. Placez une passoire à cellules de 70 μm sur un tube centrifugeuse de 50 mL, puis placez la rate et les LN sur la passoire, et utilisez un piston de seringue de 5 mL pour broyer doucement le tissu pendant 1 minute. Pendant le broyage, rince la passoire 3 fois avec un tampon FACS. Assurez-vous de broyer complètement tous les tissus et de rincer les cellules dans le tube centrifugeuse. Après avoir moutu, retirez la passoire.
3. Centrifugeuse à 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes.
4. Retirez le surnageant, résuspendez la granule cellulaire dans 3 mL de tampon de lyse des globules rouges, puis laissez la suspension à température ambiante pendant 3 à 5 minutes.
5. Ajoutez immédiatement un tampon FACS au tube centrifugeuse à un volume de 15 à 20 mL pour terminer la lyse, puis centrifugez à 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes.
6. Retirez le surnageant, ajoutez 10 mL de tampon FACS, puis resuspendez doucement la pellete cellulaire.
7. Prenez 10 μL de suspension cellulaire et utilisez une coloration au bleu de trypan pour compter le total des lymphocytes vivants.
   REMARQUE : Ces cellules sont des lymphocytes CD45,2⁺ .

3. Préparation des lymphocytes de souris CD45.1

1. Prenez la rate et les LN d’une souris CD45.1 âgée de 6 à 8 semaines (mâle ou femelle) en conditions stériles et placez-les dans un tube centrifuge de 50 mL avec 5 mL de tampon FACS.
2. Préparez les lymphocytes de la souris CD45.1 en suivant les mêmes étapes décrites ci-dessus.
   REMARQUE : Ces cellules sont des lymphocytes CD45,1⁺ .

4. Préparation des lymphocytes T naïfs CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

REMARQUE : L’ensemble du processus utilise le kit d’isolation des cellules T CD4⁺CD62L⁺ pour le MACS. Le tampon MACS est pré-refroidi à 4 °C, et toutes les conditions de centrifugation sont de 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes.

1. Prélever la suspension cellulaire de souris C57BL/6, centrifuger et éliminer le surnageant, ajouter 400 μL de tampon MACS et 100 μL de cocktail biotine-anticorps CD4⁺ T dans le tube centrifugeuse pour 1 ×^{10 8} cellules initiales. Mélangez doucement et faites couver à 4 °C pendant 5 minutes dans le noir.
2. Ajoutez 300 μL de tampon MACS et 200 μL de microbilles d’antibiotine au tube centrifugeuse à partir de l’étape 4.1 par 1 ×^{10 8} cellules initiales au total. Mélangez doucement et faites couver à 4 °C pendant 10 minutes dans le noir.
3. Ajoutez 10 mL de tampon MACS, centrifugez, et jetez le surnageant. Resuspendez la pellete cellulaire dans 2 mL de tampon MACS.
4. Placez la colonne LS sur le séparateur magnétique MACS approprié. Utilisez 3 mL de tampon MACS pour rincer la colonne. Attendez que le tampon dans la colonne se vide complètement avant de passer à l’étape suivante.
   REMARQUE : La capacité maximale de charge des cellules de la colonne LS est de 2 × 10⁹ cellules, incluant les cellules positives et négatives, et le nombre maximal de cellules positives qu’elle peut capturer est de 1 × 10⁸. En général, une seule souris ne nécessite qu’une seule colonne LS ici.
5. Chargez la suspension à cellules de l’étape 4.3 sur la colonne LS. Lorsque la suspension de la cellule s’écoule complètement dans la colonne, utilisez 3 mL de tampon MACS pour laver la colonne. Collectez tout le liquide de passage dans un nouveau tube centrifugeuse de 15 mL.
   REMARQUE : Voici le total des cellules CD4⁺CD25^– T.
6. Centrifugez le total des cellules CD4⁺CD25^– T obtenues à l’étape 4.5, écartez le surnageant et obtenez la pellete cellulaire.
7. Ajoutez 800 μL de tampon MACS et 200 μL de microperles CD62L à la pelote cellulaire pour 1 ×^{10 8} cellules initiales au total. Mélangez doucement et faites couver à 4 °C pendant 10 minutes dans le noir.
8. Ajoutez 10 mL de tampon MACS au tube centrifugeuse, centrifugez et jetez le surnageant, puis remettez la pelote de cellule en suspension dans 500 μL de tampon MACS.
9. Placez la colonne MS sur le séparateur magnétique MACS approprié et utilisez un tampon MACS de 1 mL pour rincer la colonne.
10. Chargez la suspension à cellules sur la colonne MS. Lorsque la suspension s’enfonce complètement dans la colonne, utilisez 1 mL de tampon MACS pour laver la colonne 2x.
11. Retirez la colonne MS du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube centrifugeuse de 15 mL. Ajoutez 1 mL de tampon MACS à la colonne et appuyez immédiatement fermement sur le piston pour éluer les cellules marquées par des billes magnétiques.
12. Comptez les cellules, centrifugez et jetez le surnageant, resuspendez les cellules dans un volume approprié de milieu de culture, et gardez le tube sur la glace.
    REMARQUE : Ces cellules sont des cellules T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ . En général, environ 8 × 10⁶ à 1 × 10⁷ cellules T naïves CD4⁺CD25^–CD62L⁺ peuvent être purifiées à partir d’une seule souris ; L’inclusion de ganglions lymphatiques périphériques peut augmenter le rendement.
13. Déterminer la pureté des cellules isolées : Prendre 5 ×^{10 4} cellules T CD4⁺CD62L⁺ isolées et les resuspendre dans 50 μL de solution d’anticorps dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
    REMARQUE : Préparez la solution d’anticorps en ajoutant l’anticorps anti-souris CD4 PerCP-Cy5.5, l’anticorps anti-souris CD62L FITC et l’anticorps anti-souris CD25 PE dans le tampon FACS à un ratio 1:100.
14. Après l’incubation de 20 minutes à 4 °C dans le noir, ajoutez 1 mL de tampon FACS pour laver les cellules. Centrifugez les cellules, retirez le surnageant et resuspendez la pelote dans 200 μL de tampon FACS.
15. Détecter la pureté des échantillons par cytométrie en flux.
    REMARQUE : Pour les détails de l’analyse du cytomètre à débit, consultez le manuel d’utilisation de l’instrument ou le^{protocole 14} précédemment signalé. La pureté des lymphocytes T naïfs CD4⁺CD25^–CD62L⁺ devrait être supérieure à 95 % dans l’échantillon isolé de cellules T (Figure 2).

5. Préparation des cellules enrichies en Treg CD45.1^+CD4+CD25^{+ et des cellules} non CD4+ enrichies en cellules présentatrices d’antigènes

REMARQUE : L’ensemble du processus utilise le kit d’isolation des cellules T régulatrices CD4^+CD25+ pour le MACS, et les instructions du kit ont été optimisées pour obtenir simultanément des cellules présentatrices d’antigènes (APC) enrichies par des cellules non CD4⁺ et des cellules enrichies en Treg ^CD4+CD25⁺. Le tampon MACS est prérefroidi à 4 °C, et toutes les conditions de centrifugation sont à 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes.

1. Prélever la suspension cellulaire de souris CD45.1, centrifuger et éliminer le surnageant, ajouter 400 μL de tampon MACS prérefroidi et 100 μL de cocktail biotine-anticorps régulateur CD4⁺CD25⁺ dans le tube centrifugeuse pour 1 ×^{10 8} cellules initiales. Mélangez doucement et faites couver à 4 °C pendant 10 minutes dans le noir.
2. Sans lavage, ajoutez directement 380 μL de tampon MACS pré-refroidi, 200 μL de microbilles d’antibiotine et 20 μL d’anticorps CD25-PE par 1 ×^{10 8} cellules initiales au total au tube centrifugeuse de l’étape 5.1. Mélangez doucement et éclovez à 4 °C pendant 15 minutes dans le noir.
3. Ajoutez 10 mL de tampon MACS au tube centrifugeuse, centrifugez, puis jetez le surnageant, puis remettez la pelote de cellules en suspension dans 500 μL de tampon MACS par 1 ×^{10 8} cellules initiales au total.
4. Placez la colonne LD sur le séparateur magnétique MACS approprié et rincez la colonne avec 2 mL de tampon MACS. Attendez que le tampon dans la colonne se vide complètement avant de passer à l’étape suivante.
5. Chargez lentement la suspension à cellules de l’étape 5.3 sur la colonne LD. Lorsque la suspension de la cellule s’enfonce complètement dans la colonne, lavez la colonne deux fois avec un tampon MACS de 2 mL. Collectez tout le liquide de passage dans un nouveau tube centrifugeuse de 15 mL.
6. Retirez la colonne LD du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube centrifugeuse de 15 mL. Ajoutez 3 mL de tampon MACS à la colonne LD, poussez immédiatement fermement le plunger pour expulser ^{les cellules non} CD4+ marquées par les microperles. Compter les cellules, centrifuger, les resuspendre dans un volume approprié de milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration cellulaire de 1 × 10⁷ cellules/mL, et maintenir le tube sur glace.
   REMARQUE : Ces cellules non CD4⁺ sont principalement composées de CPA telles que les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules B. Dans ce protocole, ces cellules sont utilisées ^{comme une fraction} non CD4+ enrichie en APC.
7. Centrifugez le total des cellules T CD4⁺ collectées à l’étape 5.5, jetez le surnageant et obtenez la pastille cellulaire.
8. Ajoutez 900 μL de tampon MACS et 100 μL de microperles anti-PE au granule cellulaire pour 1 ×^{10 8} cellules initiales au total. Mélangez doucement et éclovez à 4 °C pendant 15 minutes dans le noir.
9. Placez la colonne MS sur le séparateur magnétique MACS approprié et rincez la colonne avec 500 μL de tampon MACS pré-refroidi. Attendez que le tampon dans la colonne se vide complètement avant de passer à l’étape suivante.
10. Chargez lentement la suspension de la cellule de l’étape 5.8 sur la colonne MS. Lorsque la suspension de la cellule s’enfonce complètement dans la colonne, lavez la colonne deux fois avec un tampon MACS de 1 mL. Collectez le liquide de passage dans un nouveau tube centrifugeuse de 15 mL.
    REMARQUE : Les cellules du liquide à flux à ce moment sont ^CD4+CD25^– T.
11. Détachez la colonne MS du séparateur magnétique et positionnez-la sur un tube centrifugeuse neuf de 15 mL. Ajoutez 1 mL de tampon MACS à la colonne, puis appuyez rapidement sur le plongeur pour récupérer les cellules enrichies en Treg au CD4^+CD25+ marquées par des billes magnétiques.
12. Après avoir compté les cellules, centrifugez la suspension et retirez le surnageant. Resuspendez la pellete dans un milieu de culture suffisant pour obtenir une concentration finale de 2 × 10⁶ cellules/mL, puis maintenez la sonde sur la glace.
    REMARQUE : Ces cellules sont des cellules enrichies en Treg CD45,1⁺CD4^+CD25+. En général, environ 8 × 10^{cellules 5} à 1 × 10⁶ cellules CD4⁺CD25⁺ peuvent être purifiées à partir d’une seule souris ; L’inclusion de ganglions lymphatiques périphériques peut augmenter le rendement.
13. Déterminer la pureté des cellules CD4^+CD25+ isolées enrichies en Treg : Prendre respectivement 5 × 10⁴ cellules CD4⁺CD25⁺ isolées et 5 ×^{10 4} cellules non CD4⁺ enrichies en APC isolées, puis les resuspendre dans 50 μL de solution d’anticorps.
    REMARQUE : Préparez la solution d’anticorps en ajoutant l’anticorps anti-souris CD4 PerCP-Cy5.5 et l’anticorps anti-souris CD25 PE dans le tampon FACS à un ratio de 1:100. Utilisez ici le même anticorps anti-souris CD25 PE pour confirmer que les cellules CD4⁺CD25⁺ sont correctement marquées et qu’il n’y a pas de cellules T CD4⁺CD25⁺ dans la fraction non-CD4⁺ . Pour une identification plus précise des cellules Treg, une coloration intracellulaire avec un anticorps anti-souris Foxp3 PB peut également être réalisée.
14. Après l’incubation de 20 minutes à 4 °C dans le noir, ajoutez 2 mL de tampon FACS pour laver les cellules. Centrifugez les cellules, retirez le surnageant et resuspendez la pelote dans 200 μL de tampon FACS.
15. Détecter la pureté des échantillons par cytométrie en flux.
    REMARQUE : La fréquence des cellules CD4⁺CD25⁺ doit être ≥ 95 % afin de garantir que la pureté de la population cellulaire enrichie en Treg réponde aux exigences expérimentales (Figure 2). Les cellules non CD4⁺ utilisées comme fraction enrichie par APC ne doivent pas contenir plus de 5 % de cellules T CD4⁺ (Figure 2).

6. Marquage des lymphocytes T CD4⁺ naïfs avec un colorant de prolifération cellulaire

REMARQUE : Toutes les conditions de centrifugation sont à 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes. Le tampon PBS est pré-équilibré à température ambiante avant utilisation. Le processus d’étiquetage est effectué sous protection légère afin d’éviter la trempe des colorants.

1. Prenez la naïve suspension de cellules T CD4⁺ , centrifugez-vous, jetez le surnageant et obtenez la pellete cellulaire.
2. Diluez le colorant de prolifération cellulaire eFluor 450 dans PBS pour obtenir une concentration de 20 μM à température ambiante.
3. Ajoutez 0,5 mL de PBS par 1 × 10⁷ cellules. Gardez le tube incliné à environ 45° et resuspendez doucement les cellules en pipettant vers le haut et vers le bas 50 fois.
4. Ajoutez rapidement un volume égal de solution de colorant de prolifération cellulaire dans la suspension cellulaire, afin que la concentration finale du colorant de prolifération soit de 10 μM. Maintenez le tube incliné à environ 45° et mélangez les cellules en pipettant vers le haut et vers le bas 50 fois pour assurer un contact complet entre les cellules et le colorant de prolifération cellulaire.
5. Enroulez immédiatement le tube de centrifugeuse dans du papier aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Faites doucement un vortex des cellules toutes les 5 minutes pour éviter l’agrégation cellulaire.
6. Ajoutez 10 mL de milieu de culture cellulaire prérefroidi au tube centrifugeuse, faites un vortex délicat pour terminer la coloration, puis centrifugez, et jetez le surnageant.
7. Ajoutez 5 mL de milieu de culture cellulaire prérefroidi au pellet cellulaire, centrifugez, puis jetez le surnageant pour laver les cellules.
8. Ajoutez 5 mL de milieu de culture cellulaire prérefroidi à nouveau au pellet cellulaire et remettez les cellules en suspension.
9. Compter les cellules, centrifuger et éliminer le surnageant, resuspendre les cellules dans un volume approprié de milieu de culture pour atteindre une concentration cellulaire de 2 × 10⁶ cellules/mL, et maintenir le tube sur glace.

7. Mise en place de l’analyse fonctionnelle in vitro des cellules Treg

1. Calculer le nombre d’échantillons nécessaires à la culture cellulaire, préparer une quantité appropriée de milieu de culture cellulaire contenant 2,5 μg/mL anticorps anti-souris CD3 ou les cytokines d’induction indiquées, et vortexer doucement les cellules T naïves CD45,2⁺CD4⁺CD62L⁺ préparées, les cellules T CD45,1^+CD4+CD25⁺ enrichies en Treg, et les cellules non-CD4⁺ enrichies en APC.
   REMARQUE : Utilisez les cellules T naïves CD45.2⁺CD4⁺CD62L+ comme cellules T répondantes (Tresp). Cette expérience d’exemple étudie l’effet des cellules Treg sur la différenciation et la prolifération des cellules Th1 et Th17. Par conséquent, il existe un total de quatre échantillons pour la culture cellulaire : les cellules Tresp cultivées sous des conditions d’induction Th1 ou Th17, en l’absence ou en présence de cellules enrichies en Treg.
2. Ajouter 100 μL de cellules T naïves CD45,2⁺CD4⁺ (2 × 10^{cellules de 5} par puits) à la plaque de 48 puits.
3. Ajoutez 100 μL ^{de cellules} CD44+ enrichies ^en APC (1 × 10^{cellules 6} par puits) à la plaque de 48 puits.
4. Ajouter 100 μL de cellules enrichies en Treg CD45,1⁺CD4⁺CD25⁺ (2 × 10 cellules^{de 5} par puits) aux puits expérimentaux, et ajouter 100 μL de milieu de culture cellulaire aux puits témoins. Le rapport cellule :Tresp enrichi en Treg dans les échantillons expérimentaux est de 1:1.
   REMARQUE : Le rapport entre les cellules Treg et les cellules Tresp peut être réglé selon les besoins, ou un panneau à plusieurs rapports peut être conçu. Le nombre de cellules Tresp est fixé dans la coculture, tandis que le nombre de cellules Treg peut être modifié selon les besoins. Typiquement, les rapports Treg/Tresp dans les échantillons expérimentaux incluent 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 et 0:1. De plus, chaque condition expérimentale peut être préparée en triple exemplaire pour minimiser l’erreur expérimentale aléatoire. Ici, pour plus de clarté, sur la base de l’expérience de recherche^{antérieure 15,16}, un ratio 1:1 est utilisé comme exemple.
5. Ajoutez 100 μL de milieu de culture cellulaire contenant 2,5 μg/mL d’anticorps anti-souris CD3 dans chaque puits.
   REMARQUE : La concentration finale d’anticorps anti-souris CD3 est de 0,5 μg/mL. En plus des échantillons expérimentaux, posez un échantillon témoin vierge sans anticorps anti-souris CD3. Dans cet échantillon, ajoutez 100 μL de milieu de culture des lymphocytes T sans anticorps anti-souris CD3 pour déterminer l’intensité de fluorescence des lymphocytes T non proliférés, ou l’intensité du pic 0. Cela permet un étalonnage précis de la distribution de prolifération.
6. Ajouter 100 μL de milieu de culture cellulaire contenant les cytokines indiquées à chaque puits pour atteindre le volume final de chaque puits à 500 μL.
   REMARQUE : Dans cette expérience, l’IL-12 recombinant de la souris p70 à une concentration finale de 10 ng/mL est utilisée pour induire les cellules Th1, et le TGF-β1 humain recombinant à une concentration finale de 2 ng/mL ainsi que l’IL-6 recombinant de souris à 50 ng/mL sont utilisés pour induire les cellules Th17.
7. Ajoutez du PBS dans les puits vides restants (500 μL/puits) pour maintenir l’humidité de la plaque et réduire les effets de bord.
8. Incubez la plaque de 48 puits dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 3 jours.
   REMARQUE : Dans ce système de co-culture, l’anticorps soluble anti-souris CD3 fournit le signal principal du récepteur des cellules T (TCR) pour l’activation des cellules T, et les cellules non CD4⁺ enrichies en APC fournissent des signaux costimulateurs pour activer pleinement les cellules T. Les signaux TCR et costimulateurs peuvent également être déclenchés par l’anticorps anti-souris recouvert de plaque et l’anticorps anti-souris soluble CD28. Les chercheurs peuvent choisir la méthode de stimulation selon les besoins.

8. Analyse fonctionnelle in vitro des cellules Treg

REMARQUE : Toutes les conditions de centrifugation sont à 4 °C, 350 × g pendant 7 minutes.

1. Pipettez doucement les cellules cultivées pour les resuspendre et transférez la suspension dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Centrifugez les cellules et retirez le surnageant.
2. Ajoutez 500 μL de milieu de culture cellulaire contenant 5 ng/mL de PMA, 1 μg/mL d’ionomycine et un inhibiteur de transport protéique GolgiPlug dilué 1:1 000 dans chaque tube, faites un vortex délicat pour resuspendre les cellules, puis incubez-les dans un incubateur à 5 % de_CO-2 à 37 °C pendant 3 heures.
3. Centrifugeuse, jetez le surnageant, ajoutez 50 μL de PBS contenant un test de colorant jaune zombie et un anticorps anti-souris dilué 1:100 à chaque échantillon, vortex, et incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 minutes pour marquer les cellules mortes et bloquer les récepteurs Fc.
4. Centrifugeuse, jetez le surnageant, ajoutez 50 μL de cocktail d’anticorps de surface, vortex, et incubez à 4 °C dans l’obscurité pendant 20 minutes.
   REMARQUE : Ajouter l’anticorps anti-CD4 PerCP-Cy5.5, l’anticorps anti-CD45.1 FITC et l’anti-CD45.2 APC-eFluor 780 dans le tampon FACS à un ratio 1:200 pour préparer le cocktail d’anticorps de surface.
5. Ajoutez 1 mL de tampon FACS à chaque tube centrifugeuse, centrifugeuse, puis jetez le surnageant.
6. Ajoutez 300 μL de solution de fixation et de perméabilisation à chaque tube centrifugeuse, vortex, et incubez à 4 °C dans l’obscurité pendant 20 minutes.
7. Ajouter 1 mL de tampon 1× de perméabilisation/lavage (Perm/Wash) à chaque tube centrifugeuse, centrifugeuse, et jeter le surnageant ; Puis répétez cette étape de lavage une fois pour garantir l’élimination complète du fixateur résiduel.
8. Ajoutez 50 μL de cocktail d’anticorps cytokines, vortex, et incubez à 4 °C dans le noir pendant 40 minutes.
   REMARQUE : Ajouter l’anticorps anti-IFN-γ PE et l’anticorps anti-IL-17A PE-Cy7 au tampon Perm/Wash à un ratio 1:100 pour préparer le cocktail d’anticorps cytokines.
9. Laver chaque échantillon avec 1 mL de tampon Perm/Wash, centrifuger les cellules et retirer le surnageant. Resuspendez la pastille dans 300 μL de tampon FACS.
10. Mesurer la prolifération et la différenciation des cellules Tresp par cytométrie en flux. Utilisez la stratégie de verrouillage suivante (Figure 3) : d’abord, bloquer la population de lymphocytes parmi les cellules totales et exclure les débris cellulaires et impuretés ; deuxièmement, verrouiller la population unicellulaire parmi les lymphocytes en fonction des signaux de diffusion ; troisièmement, enfermer la population cellulaire vivante parmi les cellules uniques ; quatrièmement, la population de cellules T CD4⁺ parmi les cellules vivantes ; cinquièmement, verrouiller la population cellulaire enrichie en Treg CD45.1⁺ et la population cellulaire Teff CD45.2⁺ parmi les cellules T CD4⁺ ; sixièmement, les cellules CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1, CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17, et les cellules T CD45.2⁺CD4⁺ non proliférées parmi les cellules T CD45.2⁺ .
11. Effectuer l’acquisition des données de cytométrie en flux et analyser les données de cytométrie en écoulement.
    1. Utilisez des lymphocytes T cultivés marqués avec le colorant de prolifération cellulaire eFluor 450 comme témoin de coloration unique. Préparez le colorant jaune zombie avec un contrôle monocoloré avec des lymphocytes T cultivés qui n’ont pas été marqués avec un colorant de prolifération cellulaire. Préparez les autres contrôles à coloration unique avec des billes de compensation pour chaque fluorophore utilisé.
    2. Utilisez des lymphocytes T marqués avec le colorant de prolifération cellulaire eFluor 450 et cultivés sans anticorps anti-souris CD3 pour définir la porte des cellules non proliférées.
    3. Utilisez des lymphocytes T cultivés marqués avec un colorant de prolifération cellulaire et colorés avec un colorant jaune zombie, des anticorps de surface cellulaire, ainsi que des contrôles isotypes de l’anticorps anti-souris IFN-γ PE et anti-anticorps IL-17A PE-Cy7 pour définir les portes des cellules T IFN-γ⁺CD4⁺ et IL-17A⁺CD4⁺ .

Résultats

Dans l’expérience représentative, des cellules T naïves ont été utilisées comme cellules Tresp pour étudier les effets des cellules enrichies en Treg sur la prolifération et la différenciation des cellules Th1 et Th17. Dans cette expérience, les cellules Tresp ont été activées ^{par des cellules} CD3 anti-souris et des cellules non CD4+ enrichies en APC, puis différenciées en cellules Th1 sous induction IL-12 p70 ou en cellules Th17 sous induction TGF-β1 et IL-6. Dans ces deux conditions d’induction, les changeme...

Discussion

Dans cette étude, les résultats de la co-culture sous conditions d’induction Th1 sont cohérents avec les rapports antérieurs indiquant que les cellules Treg peuvent supprimer la prolifération et la différenciation des cellules^{Th1 17,18}. Les cellules enrichies en Treg inhibaient également la prolifération des cellules Tresp dans des conditions d’induction Th17. Cependant, dans les conditions polarisantes Th17 utilisées ici, la fré...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	ou équivalent
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	ou équivalent
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	ou équivalent
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	ou équivalent
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	ou équivalent
48-well plates	Corning Incorporated	3548	ou équivalent
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	ou équivalent
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	ou équivalent
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	ou équivalent
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	ou équivalent
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	ou équivalent
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	ou équivalent
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	ou équivalent
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	ou équivalent
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	ou équivalent
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	ou équivalent
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	pour l'acquisition de données cytométriques en flux des échantillons de cellules immunitaires
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	ou équivalent
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	pour l'isolement des lymphocytes primaires et des sous-ensembles de cellules T
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	ou équivalent
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	pour le tri cellulaire
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	pour le tri cellulaire
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	pour l'isolement des lymphocytes primaires et des sous-ensembles de cellules T
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	ou équivalent
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	ou équivalent
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	ou équivalent
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	ou équivalent
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	ou équivalent
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	ou équivalent
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	ou équivalent
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	logiciel pour l'analyse des données de cytométrie en flux
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	ou équivalent
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	ou équivalent
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	ou équivalent
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	ou équivalent
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	pour le tri cellulaire
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	ou équivalent
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	pour le tri cellulaire
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	pour le tri cellulaire
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pour le tri cellulaire
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	pour le tri cellulaire
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	ou équivalent
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	ou équivalent
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	ou équivalent
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	ou équivalent
PMA	Millipore Sigma	P8139	ou équivalent
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	ou équivalent
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	pour le tri cellulaire
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	ou équivalent
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	ou équivalent
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	ou équivalent
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	ou équivalent
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	ou équivalent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	ou équivalent
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222