Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Résumé

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l'aide des tests d'activité de gel.

Résumé

Les mitochondries sont des organites cytoplasmiques qui ont un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire et l'homéostasie, la régulation du réseau de signalisation cellulaire, et la mort cellulaire programmée. Les mitochondries produisent l'ATP, de réglementer l'état redox cytoplasmique et Ca2 + bilan, cataboliser acides gras, de synthétiser l'hème, nucléotides, hormones stéroïdes, acides aminés, et aider à assembler fer-soufre dans les protéines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans la production de chaleur. Les mutations du génome mitochondrial entraîner plusieurs types de trouble humain. L'accumulation de mutations de l'ADNmt est en corrélation avec le vieillissement et est soupçonné d'avoir un rôle important dans le développement du cancer. En raison de leur rôle d'une importance vitale dans tous les types de cellules, la fonction des mitochondries doit aussi être critique pour les cellules souches. Avancées majeures ont été faites dans notre compréhension de la viabilité des cellules souches, la prolifération, et la capacité de différenciation. Mais l'activité fonctionnelle des cellules souches, en particulier de leur état énergétique, ne fut pas encore été étudiés en détail. Presque rien n'est connu sur les propriétés des mitochondries des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et leur descendance différenciée précurseur. Une façon de comprendre et d'évaluer le rôle des mitochondries dans la fonction de CSEh et le potentiel de développement est de mesurer directement l'activité des complexes respiratoires mitochondriaux. Ici, nous décrivons haute résolution électrophorèse sur gel natif claires et les suivants dans la visualisation de l'activité de gel comme une méthode pour analyser les cinq complexes de la chaîne respiratoire des CSEh.

Protocole

Haute Résolution électrophorèse sur gel natif Effacer (hrCNE) pour le complexe mitochondrial tests d'activité dans le gel

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été maintenus sur une monocouche de ˠ-irradiés ou la mitomycine C fibroblastes de souris traitées embryonnaires (MEF), puis passer à la croissance sur Matrigel pendant 5 jours dans MEF milieu conditionné utilisant des conditions standard. Pour enlever la contamination FAE, CSEh ont été re-plaquées sur Matrigel et cultivées en milieu conditionné MEF pour les 3 jours supplémentaires. Immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence Oct-4, SSEA-4 a été utilisé pour....

Discussion

Dans cette vidéo, nous avons décrit l'extraction des complexes de protéines mitochondriales de cellules souches embryonnaires humaines, leur séparation par électrophorèse haute résolution claire gel natif (hrCNE), et l'analyse subséquente par en gel des essais d'activité catalytique. hrCNE résout mitochondriale des complexes protéine membranaire à une résolution comparable à celle de l'électrophorèse sur gel bleu natif et est supérieure pour les tests d'activité dans le gel. Cette technique peut être employée non seuleme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
EDTA 0,5 M	Fisher Scientific	BP120-1	ajuster le pH à 8,0 avec du NaOH
NaCl 1 M	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
Succinate de sodium 1 M	Fisher Scientific	S413-500
Buffer de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2	Fisher Scientific	BP332-1 et BP329-1	Mélanger 68,4 ml de Na2HPO4 1 M et 31,6 ml de NaH2PO4 1 M pour préparer un tampon de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,2 à 25 °C
Tricine 1 M, pH 7,0 (ajusté avec NaOH)	EMD Millipore	9010	conserver à 4 °C
Imidazole/HCl 1 M, pH 7,0	Sigma-Aldrich	I-2399	conserver à 4 °C
Tris-HCl 1 M, pH 7,4	Fisher Scientific	BP153-1
Dodécyl-β-D-maltoside (DDM) 20 % (poids/volume)	Fluka	44205-500MG	Dissous dans l’eau. Conserver des aliquotes de 1 ml à –20 °C.
Digitonine 10 % (poids/volume) (>50 % de pureté, utilisée sans recristallisation)	Fluka	37008-1G	Dissous dans l’eau. Conserver des aliquotes de 0,1–1 ml à –20 °C. Doit être chauffé à 95 °C avant utilisation.
Acide 6-aminohexanoïque 2 M	Fluka	07260-100G	conserver à 4 °C
Solution mère de Ponceau S/glycérol 10x	Sigma-Aldrich	P-3504 et G6279-1L	Ponceau S 0,1 %, glycérol 50 % (poids/volume) dans l’eau.
Désoxycholate de sodium 10 % p/v	Fluka	30970-25G	Dissous dans l’eau. Doit être protégé de la lumière. Ajuster le pH à 7,0 avec du HCl, filtrer et conserver à température ambiante.
Phénazine méthasulfate (PMS) 250 mM	TCI America	P0083	Dissous dans le DMSO et aliquoté. Conserver à –20 °C.
Nitro-bleu de tétrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3’-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-10
Glycine	Fisher Scientific	G45-212
Adénosine 5’-triphosphate disodique (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grade I, minimum 99 %
Bêta-nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), forme réduite	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrome c provenant du cœur de cheval	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Saccharose	Fisher Scientific	BP220-212
Cocktail d'inhibiteurs de protéases 100x	Sigma-Aldrich	P8340	Conserver à – 20 °C.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Colorant bleu de trypan 0,4 %	GIBCO, by Life Technologies	15250-061
Tripsine 10x (0,5 %)	GIBCO, by Life Technologies	15400-054
Inhibiteur de la trypsine	GIBCO, by Life Technologies	17075-029