Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a> .

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Déterminer le nombre de cellules en culture est importante dans la normalisation des conditions de culture et de réaliser des expériences de quantification précise. Un hématimètre est une lame de verre épais avec une zone centrale conçue comme une chambre de comptage. Suspension cellulaire est appliquée à une zone définie et comptée pour la densité des cellules peut être calculée.

Déterminer le nombre de cellules en culture est importante dans la normalisation des conditions de culture et de réaliser des expériences de quantification précise. Dans cette vidéo, nous démontrons comment les cellules sont comptées en utilisant un hématimètre.

Comptage et détermination de la viabilité des cellules cultivées

La détermination du nombre de cellules en culture est importante pour la standardisation des conditions de culture et pour la réalisation d'expériences de quantification précises. Un ...

La détermination du nombre de cellules en culture est importante pour la standardisation des conditions de culture et lors de la réalisation d'expériences nécessitant des nombres précis de cellules. Nous allons ici vous montrer comment compter les cellules à l’aide d’un hémoscytomètre et calculer la concentration des cellules présentes en suspension. Nous vous montrerons également comment déterminer le nombre de cellules viables présentes dans votre culture à l’aide du test de viabilité au bleu de trypan.Bonjour, je suis Ricky, ici au laboratoire du Dr. LAN au sein du réseau des laboratoires de pathologie moléculaire du Tennessee oriental. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment dénombrer les cellules en suspension et comment déterminer leur viabilité. Pour préparer le cytomètre hématologique au dénombrement cellulaire, vous devez d'abord nettoyer sa surface ainsi que la lame couvre-objet associée avec de l'éthanol à 70 %.La lame et la lamelle doivent être propres, sèches et exemptes de peluches, d'empreintes digitales et de traces d'eau. Ensuite, humidifiez légèrement les bords du cytomètre sanguin avec de l'eau du robinet et appuyez la lamelle par-dessus. La lamelle doit reposer uniformément au-dessus de la zone de comptage argentée.Maintenant, nous sommes prêts pour la suspension cellulaire afin de préparer la suspension cellulaire en vue du comptage. Tout d'abord, si les cellules sont cultivées en cultures en monocouche, détachez les cellules de la surface de la plaque à l’aide de trypsine, comme illustré dans la vidéo sur le transfert des cellules. Une fois les cellules détachées de la plaque, diluez-les selon les besoins pour obtenir une suspension homogène.Veillez à disperser tous les agrégats dans la suspension lors de l'utilisation du cytomètre hématique. Un nombre maximal de 20 à 50 cellules par carré d'un millimètre est recommandé. Lorsque vous êtes prêt à charger le cytomètre hématique avec votre échantillon de cellules, utilisez une micropipette pour transférer la suspension cellulaire vers le bord de la chambre de comptage du cytomètre hématique.Tenez la pointe de la pipette sous la lame couvre-objet et déposez une goutte de suspension. La suspension sera attirée sous la lame couvre-objet par action capillaire. Une fois la première chambre remplie, remplissez la deuxième chambre de comptage, puis vous êtes prêt à compter vos cellules avant de commencer le dénombrement.Laissez les cellules se déposer pendant quelques minutes. Il est également utile d'essuyer tout excès de liquide une fois que les cellules se sont déposées. Vous pouvez observer la préparation au microscope avec un grossissement de cent fois.Vous devriez voir la grande zone centrale de la grille, délimitée par un ensemble de trois lignes parallèles. Les subdivisions situées à l’intérieur de cette grande zone centrale sont également entourées de trois lignes parallèles, et chaque subdivision est divisée en 16 petits carrés par des lignes simples. Les cellules présentes dans cette zone doivent être réparties uniformément, sans agglomération.Si les cellules ne sont pas uniformément réparties, effectuez un lavage et rechargez l'échantillon. Utilisez un hémocytomètre avec un compteur manuel pour compter les cellules présentes dans chacun des quatre coins et dans le carré central. Ne comptez pas les cellules touchant la ligne médiane des lignes triples situées en bas ou à droite du carré ; comptez uniquement celles touchant la ligne médiane des lignes triples situées en haut ou à gauche.Nombre de répétitions pour la chambre de dénombrement. Une fois que vous avez compté les cellules, vous pouvez déterminer le nombre de cellules par millilitre. Pour ce faire, prenez le nombre moyen de cellules par carré, puis multipliez par le facteur de dilution et par 10 000 afin d’obtenir le nombre de cellules dans votre échantillon.Multiplier le nombre de cellules par millilitre par le volume total de la suspension cellulaire à partir de laquelle l'échantillon a été prélevé. Nous sommes maintenant prêts à déterminer la viabilité de notre suspension. Pour déterminer le nombre de cellules viables dans votre échantillon, nous utiliserons le bleu de trypan : commencez par combiner 0,5 millilitre de bleu de trypan à 4 %, 0,03 millilitre de HBSS et 0,1 millilitre de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélangez soigneusement, puis laissez le tube reposer pendant cinq minutes avant de charger l'hémocytomètre.Les cellules viables ne doivent pas être colorées, mais les cellules mortes apparaîtront en bleu au cytomètre hématique. Comptez le nombre total de cellules et le nombre total de cellules viables, c'est-à-dire non colorées, puis calculez le pourcentage de cellules viables dans votre échantillon. Une fois terminé, décontaminez la lame en la rinçant avec de l'éthanol à 70 %, puis avec de l'eau déionisée dans le cytomètre hématique.Laissez sécher à l'air et conservez-le pour une utilisation ultérieure. Nous venons de vous montrer comment déterminer le nombre et la viabilité de vos cellules cultivées. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance dans tous vos expériences.

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