Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">Current Protocols in Cell Biology.</a>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

congélation, la décongélation, et les cellules d&#39;emballage pour les transports

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Elle nécessite un certain nombre de compétences particulières pour être en mesure de préserver la structure, la fonction, le comportement et la biologie des cellules en culture. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

Congélation, la décongélation, et les cellules d&#39;emballage pour les transports

Les cellules mammaliennes cultivées sont largement utilisées dans les études de biologie cellulaire. Leur utilisation requiert un certain nombre de compétences particulières afin de pouvoir préserver la ...

Les cultures cellulaires sont utilisées dans une grande variété d'applications de recherche et de diagnostic. Il peut être parfois souhaitable de conserver des lignées cellulaires pour des travaux futurs afin de préserver les cellules, d'éviter la sénescence, de réduire le risque de contamination et de minimiser les effets de la dérive génétique. Les lignées cellulaires peuvent être congelées pour une conservation à long terme.Dans cette vidéo, nous vous montrons comment congeler des cellules cultivées en monocouche ainsi qu'en suspension, et comment les décongeler afin de les faire repousser. Bonjour, je suis Ricky, du laboratoire du Dr. LAN au sein du réseau des laboratoires de pathologie moléculaire du Tennessee oriental. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment congeler des cellules pour un stockage à long terme et comment les décongeler à partir de l'azote liquide.Pour congeler des cellules adhérentes humaines, commencez par les détacher de la plaque comme vous le feriez lors d'une mise en culture. Gardez à l'esprit qu'il est préférable d'utiliser des cellules en phase logarithmique de croissance pour la cryoconservation. Une fois les cellules détachées et la réaction de trypsine arrêtée par l'ajout de sérum ou de milieu contenant du sérum, transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile pour centrifugeuse et ajoutez deux millilitres.Des cellules issues de trois plaques ou plus provenant de la même sous-culture de la même source peuvent être combinées dans un seul tube avec du milieu complet contenant du sérum. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 300 à 350 Gs à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mils à quatre degrés Celsius.Milieu complet, ajouter un volume égal de milieu de congélation à quatre degrés, mélanger soigneusement les cellules, puis placer le tube sur de la glace et dénombrer les cellules. À l’aide d’un cytomètre sanguin, diluer la suspension avec davantage de milieu de congélation afin d’obtenir une concentration finale de 1 million ou 10 millions de cellules par millilitre. Pour congeler les cellules provenant d’un flacon carré de 25 centimètres carrés presque confluent, resuspendre dans environ trois millilitres de milieu de congélation. Prélever à la pipette un millilitre de la suspension cellulaire et le déposer dans des cryotubes de deux millilitres préalablement étiquetés.Veillez à bien serrer les bouchons des vials. Placez les vials une heure à toute la nuit dans un congélateur à -80, puis transférez-les dans un congélateur de stockage à azote liquide. La congélation de cellules en culture en suspension suit un principe similaire à celui de la congélation de cellules issues d'une monocouche.La principale différence est que les cultures en suspension n'ont pas besoin d'être d'abord tryps. Inisées ; transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse et centrifugez pendant 10 minutes à 300 à 350 Gs à température ambiante. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez le culot dans du milieu de congélation à quatre degrés, à une densité de 1 million à 10 millions de cellules par millilitre.Ensuite, transférez des aliquots de un millilitre de la suspension cellulaire dans des cryotubes et congélez-les. Comme cela a été fait pour les cultures en monocouche, qui ont été démontrées dans le chapitre précédent pour décongeler et récupérer les cryotubes congelés. Retirez d'abord le cryotube contenant les cellules du congélateur à azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain d'eau à 37 degrés.Agiter continuellement le flacon jusqu'à ce que le milieu soit décongelé, ce qui prend généralement moins de 60 secondes. Une fois décongelé, essuyer le dessus du flacon avec de l'éthanol à 70 % avant de l'ouvrir. Ensuite, transférer la suspension de cellules décongelées dans un tube stérile de centrifugeuse contenant deux millilitres de milieu complet chaud et 20 % de sérum de veau fœtal, puis centrifuger.Cette étape pendant 10 minutes à 150 à 200 Gs à température ambiante. Cette étape permet d'éliminer tout DMSO résiduel après la centrifugation ; jeter le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire dans une petite quantité d'environ un millilitre de milieu complet contenant 20 % de FBS, puis transférer cette suspension dans une plaque de culture correctement étiquetée contenant la quantité appropriée de milieu. Généralement, un millilitre de suspension cellulaire est nécessaire pour cinq à vingt millilitres de milieu.Vous pouvez maintenant placer les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour les faire croître après 24 heures. Vous devrez vous assurer que les cellules se sont bien fixées à la plaque après cinq à sept jours, ou lorsque l'indicateur de pH dans le milieu change de couleur, auquel cas vous devrez renouveler le milieu. Vous devrez maintenir les cultures dans un milieu contenant 20 % de FBS jusqu'à ce que la lignée cellulaire soit réétablie.Si le taux de récupération est extrêmement faible, seule une sous-population de la culture initiale pourrait être en croissance. Soyez particulièrement vigilant à ce phénomène lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires connues pour être mosaiques. Si des cultures doivent être expédiées, cela peut être réalisé facilement tant pour les cultures en monocouche que pour les cultures en suspension.Dans des flacons de culture de tissus de 25 centimètres, les cellules sont cultivées jusqu'à une confluence quasi complète en monocouche ou jusqu'à la densité souhaitée en suspension. Pour les cultures en monocouche, le milieu est d'abord éliminé, puis le flacon est rempli de milieu frais. Il est essentiel que le flacon soit complètement rempli de milieu afin d'empêcher les cellules de se dessécher si les flacons sont retournés pendant le transport.Pour la suspension, du milieu frais est ajouté afin de remplir le flacon. Le bouchon est serré et fixé à l'aide de parafilm. Le flacon est scellé dans un sac en plastique étanche ou tout autre récipient étanche conçu pour éviter les déversements.Dans le cas où le flacon serait endommagé, le contenant primaire est alors placé dans un contenant secondaire isolé afin de le protéger des températures extrêmes pendant le transport. Une étiquette de danger pour l'acheteur est apposée à l'extérieur de l'emballage. Généralement, les cultures sont transportées en service express la même nuit ou en une nuit par des coursiers.Nous venons de vous montrer comment congeler et décongeler des cultures cellulaires humaines, tant pour les cellules adhérentes que pour les cellules en suspension. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.

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