Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l'étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l'exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.
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Article de méthode
Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs
Dans cet article
Résumé
Résumé
La capacité à créer des cultures de cellules primaires de neurones à dopamine permet l'étude des caractéristiques présynaptique des neurones dopaminergiques dans l'isolement de l'entrée systémique d'ailleurs dans le cerveau. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces neurones pour évaluer la cinétique de libération de dopamine en utilisant l'ampérométrie en fibre de carbone, ainsi que les niveaux d'expression des gènes liés dopamine et de protéines en utilisant la PCR quantitative et immunocytochimie. Dans cette vidéo, nous vous montrons comment nous générons ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.
Le processus comporte plusieurs étapes, y compris le placage de corticale astrocytes gliales, le conditionnement des milieux de culture cellulaire neuronale par le substrat gliales, la dissection du mésencéphale chez les nouveaux nés, la digestion, l'extraction et le placage des neurones à dopamine et l'ajout de facteurs neurotrophiques pour d'assurer la survie cellulaire.
Les applications appropriées pour une telle préparation comprennent l'électrophysiologie, l'immunocytochimie, PCR quantitative, la microscopie vidéo (ie, de la fusion vésiculaire en temps réel avec la membrane plasmique), des dosages de la viabilité cellulaire et d'autres tests de dépistage toxicologique.
Protocole
Préparation de la culture précédente
Note: Les cellules gliales ** doit être plaqué à l'avance afin qu'ils aient le temps de proliférer et de couvrir le fond de la vaisselle. Pour les souris avec le fond génétique atypique ou expérimentale, assurez-vous réunir les cultures gliales et neurones en termes de génotype.
Note: ** 1-7 jours avant la dissection, préparer fraîches moyennes neuronales et remplacer le milieu gliales dans les plats avec 2ml.
Note: ** Le jour avant la dissection, les éléments suivants doivent être laissés sous la lumière UV dura....
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Discussion
Les méthodes décrites ici permettent de résolution fine des caractéristiques morphologiques et neurochimiques des neurones dopaminergiques centrales qui sont par ailleurs pas disponible dans une approche systémique ou dans l'approche in vivo.
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Remerciements
Le travail a été soutenu par DK065872 (PEV), un Prix Smith Family Foundation de l'excellence en recherche biomédicale (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) et P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).
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Matériaux
Les matériaux sont inclus dans le texte du protocole.
Références
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine....
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Réimpressions et autorisations
