Double Mont entier hybridation in situ d'embryons de poulet début

Résumé

Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.

Résumé

L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier l'expression des gènes dans le cerveau, le tube neural, et le cœur somite primordia formation. Cette vidéo montre les différentes étapes de 2-couleurs monter toute l'hybridation in situ; d'abord, l'embryon est disséquée de l'oeuf et fixés dans du paraformaldéhyde. Deuxièmement, l'embryon est traité pour préhybridation. L'embryon est ensuite hybridée avec deux sondes différentes, l'un couplé à creuser, et un couplé au FITC. Après hybridation pendant la nuit, l'embryon est incubée avec DIG couplé anticorps. Réaction colorée pour le substrat DIG est effectuée, et la région d'intérêt apparaît en bleu. L'embryon est ensuite incubée avec l'anticorps couplé au FITC. L'embryon est traitée pour une réaction de couleur avec le FITC, et la région d'intérêt apparaît en rouge. Enfin, l'embryon est fixe et traitées pour phtograph et le sectionnement. Un guide de dépannage est également présentée.

Protocole

Partie 1: Fixation des embryons

1. Remplissez-vaisselle dissection avec de la glace froide DEPC PBS. Restez sur la glace. Ouvrez l'œuf en tapant la coquille avec une pince et retirez les morceaux de coquille.
2. Retirer épaisse d'albumine avec une pince. Inclinez le sac vitellin avec une pince afin que les embryons grossière tournée vers le haut.
3. Avec des ciseaux, couper un carré de vitellus autour de l'embryon.
4. Aide d'une cuillère, retirer l'embryon du jaune d'œuf et le placer sur la glace froide DEPC PBS.
5. Sous le microscope, enlever les membranes et le jaune et le transfert à plat de fixation.
6. Pin, d'enlever DEPC PBS. Remplacez-le par 4% de PFA dans DEPC-PBS et fixer O / N à 4 ° C.
7. Retirer fixateur. Remplacez-la par de la glace froide DEPC PBS. En utilisant une aiguille extrémité émoussée microcapillaire ou un couteau de microdissection, perforer le système nerveux et les cavités du cœur, pour empêcher le piégeage de la sonde.
8. Laver 2x 10 mn DEPC PBS avec 0,1% de Tween-20 (PBT). Déshydrater à 10 mn chacun à 25%, 50%, méthanol 75% en PBT. Déshydrater embryons à deux reprises dans le méthanol à 100%. Conserver à -20 ° C dans le méthanol.

Partie 2: Préhybridation

1. Réhydrater embryons à 10 mn chacun à 75%, 50% et 25% de méthanol dans le PBT. Laver 2x 10 mn en PBT.
2. Pendant ce temps, préparer la glace froide fixateur (paraformaldéhyde 4% en PBT). Remplacer PBT avec la protéinase K solution (3 ml / flacon; [? 5 g / ml final] en PBT). Assurez-vous que le flacon entier est exposé à la protéinase K solution en faisant rouler délicatement le flacon, voir Dépannage des durées d'exposition.
3. Utiliser RNase Pasteur pipette pour enlever la protéinase K et ajouter fixateur (2 ml). Immédiatement placer sur la glace pendant exactement 20 mn.
4. Tous les lavages sont effectués sur RT nutator. Laver 2x 10 mn en PBT, et 1x 10mn en PBT contenant le tampon d'hybridation de 50%.
5. Lavez 1x dans le tampon d'hybridation. Incuber à 65 ° C en 2 ml de tampon d'hybridation pour 4-5 heures.

Partie 3: les embryons hybrides avec des sondes

1. DIG et la synthèse de sonde couplée au FITC est décrite dans l'annexe. La sonde devrait donner un signal fort, doit être synhesized avec FITC contenant les nucléotides, la plus faible de la sonde doit être synthétisés avec des DIG contenant les nucléotides.
2. Préchauffer sondes dans le tampon d'hybridation (500 ng / ml chacune) en utilisant un flacon de 2 ml. Rapidement remplacer le tampon d'hybridation avec la solution de sonde. Ne laissez pas les embryons sec. Incuber pendant 16 heures à 65 ° C.
3. Remplacer la sonde avec un tampon d'hybridation, 2 lavages, 30 mn chacun à 65 ° C. Laver à 15 mn dans le tampon d'hybridation / MABT (1 / 1 v / v /) à 65 ° C.

Partie 4: incubation d'anticorps DIG et la couleur de réaction

1. Lavez 2x20 mn en MABT. Lavez 1 h à 2% BBR / MABT. Laver 5 h à 2% BBR/20% HISS / MABT (tampon de blocage). Incuber dans 1:2000 DIG anticorps dilué dans un tampon de blocage, O / N à 4 ° C sur nutator.
2. Laver 3x 10 mn chacun dans MABT, et 3x 1 heure chacune dans MABT.
3. Laver 2x 20 mn dans NTMT. Ajouter 200ul substrat NBT / BCIP à 10 NTMT ml. Retirer immédiatement NTMT du flacon et de le remplacer par 1-2 ml de NBT / BCIP tampon. Placer dans l'obscurité. Moniteur réaction colorée après 20 mn, et à intervalles 20 mn après.
4. Suite à la réaction de couleur (bleu devrait apparaître), se laver dans du PBS pendant 10 mn, épingler sur le plat de fixation remplis avec du PBS, et remplacer la solution à 4% en PBS PFA. Fix O / N à 4 ° C.
5. Transfert à nouveau flacon à scintillation. Laver dans du PBST (PBS avec 1% de Tween-20) 2x10 mn. Laver à l'MABT 2x 10 mn.
6. Incuber dans MABT 30 mn à 63 ° C.

Partie 5: l'incubation d'anticorps FITC et la couleur de réaction

1. Laver 2x 10 mn dans MABT, 1 h à 2% BBR / MABT, 5 h en tampon de blocage
2. Incuber dans la phosphatase alcaline couplée anti-FITC-anticorps (1:500) O / N à 4 ° C.
3. Laver 3x 10 mn chacun dans MABT, et 3x 1 heure chacune dans MABT.
4. Laver à 2x 20 mn dans du TBS pH 8,45 avec 0,1% de Tween-20 (TBST).
5. Préparer Vecteur Rouge solution de travail (5 ml) dans TBST utilisant les réactifs 1,2 et 3 fournis dans le kit. Retirer immédiatement TBST du flacon et de le remplacer par Vector Rouge tampon. Placer dans l'obscurité. Moniteur réaction colorée après 40 mn, et à intervalles de 30 mn après.
6. Suite à la réaction de couleur (rouge devrait apparaître), les embryons transfert à PBS.

Partie 6: Fixation et de traitement

1. Transférer dans le plat de fixation contenant du PBS, et de fixer à 4% PFA pour 20 mn à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
2. Laver dans du PBS, 2x 10 mn. Pour traiter de la photographie, le transfert à 20% de glycérol dans du PBS (cela rendra les embryons translucide). Pour créer une chambre, couper deux bandes de ruban en PVC, les superposer sur la diapositive. Couper un carré dans le centre à l'aide d'une lame. Retirer les pinces carré à l'aide.
3. Pour traiter de la cire pour la coupe, retour à PBS, laver 2x 10 mn, déshydrater en série graduée de méthanol (25%, 50%, 75% et 100% dans le PBS, à 10 mn chacun).
4. Remplacez-le par le propanol, 3mn. Remplacez-le par 1,2,3,4-tétrahydronaphtalène, à 20 mn suivi d'Histoclear (2x 1 h). Remplacez-le par histoclear / cire 1 / 1 (v / v) 60 ° C pendant 1 heure. Remplacer avec de la cire d'un processuspour l'histologie.

Partie 7: Solutions

Tampon d'hybridation, de stocker à -20 ° C à Falcon de 50 ml: 25 ml de formamide; 3,25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5 M EDTA); 1 ml (10% de Tween-20); 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml ARNt);. 100ul (50 mg / ml d'héparine) MABT, préparer 100 mM d'acide maléique; pH à 7,5 avec des pastilles de NaOH. Ajouter 150 mM NaCl et 0,1% de Tween-20.

NTMT (faite juste avant l'utilisation), 50 ml: 1 ml (NaCl 5M); 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5); 1,25 ml (2M MgCl _2), 5 ml (10% de Tween-20).

TBST: Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Partie 8: Dépannage

Problème	Cause	Remède
Embryons est recroquevillé	Déshydratation insuffisant / réhydratation	Maintenir des intervalles de 10 mn au cours successifs déshydratation / réhydratation étapes
Il n'ya pas de signal de la sonde	Probe est dégradé la contamination de RNase en flacon	Exécuter sonde sur agarose à 1% de gel Assurez-vous que le flacon entier est exposé à la protéinase K solution dans l'étape 2
Probe est cavités étiquettes du cœur d'un tube neural	Sonde est piégé	Dans l'étape 2, assurez-vous que toutes les cavités sont perforés couteau microdissection utilisant ou microcapillaire
Embryon désintégré hybridation suivante (étape 3)	Protéinase K PG température d'hybridation trop longtemps est trop élevé	Protéinase K ne doit pas être laissé plus longtemps que 1mn (stades 3 et 4 +), à 2 mn (étape 5 à 7), 3 mn (stade 8-10), 4 mn (stade 11-13) ne s'hybrident pas à T o supérieur de 65 o C

Partie 9: Résultats Représentant

Embryons représentatifs sont présentés ci-dessous: (A) Embryon (stade HH7) est étiqueté avec une sonde DIG-Sox (bleu) et un FITC-delta-1 sonde (rouge). (B) embryon (stade de HH8) est étiqueté avec une sonde DIG-Pax6 (bleu) et une sonde FITC-Chut (rouge). Nf, neurales pli, ANP, plaque neurale antérieure, PSM, mésoderme presomitic, n, notochorde, NT, du tube neural). Cadeaux de la sonde dans les laboratoires des Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, et J. Briscoe.

Discussion

Le support 2-couleur d'ensemble de méthode d'hybridation in situ est utilisée pour déterminer à la fois la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique, en utilisant un ou deux gènes d'intérêt. Les applications incluent l'évaluation des profils d'expression génique de nouveaux gènes (par exemple ^1,2, ainsi que des changements dans l'expression des gènes insulte suivantes (manipulations d'embryons ^{3, 4} perles, et l'électroporation d'ADN ou d'ARN des constructions...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Œufs	Animal	Charles River Laboratories	Fertile Premium
Stéréomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5
Incubateur automatique Marsh	Outil	Lyon	RX
Incubateur d'hybridation	Outil	Hybaid	Micro-4
Agitateur orbital Adams Nutator	Outil	Fisher Scientific	14-062
Pince courbe (1)	Outil	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Ciseaux fins	Outil	Fine Science Tools	14161-10
Cuillère	Outil	Fine Science Tools	10370-18
Pipette capillaire Pasteur		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Tube microcapillaire		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Tirer à l’aide d’un tireur de micropipettes vertical ; émousser l’extrémité avec des pinces fines
Lame de microdissection		Fine Science Tools	10056-12	Utiliser pour percer les cavités avant l’hybridation in situ
Épingles Minuten, diamètre 0,2 mm		Fine Science Tools	26002-20	Garder les épingles ensemble à l’aide d’un agitateur magnétique ;
Agent de réticulation et base d’élastomère de silicone Sylgard 184	Réactif	Dow Corning	0001986475	Mélanger 1 part d’agent de réticulation, 9 parts de base ; laisser durcir O/N à 37 °C
Diéthylpyrocarbonate (DEPC)	Réactif	Acros Organics	10025025	Ajouter 1 ml de DEPC à 1 l de PBS ; agiter ; stériliser à l’autoclave
PFA à 16 %	Réactif	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Réactif	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Protéinase K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Stocker à 10 mg/ml dans de l’eau DEPC, en aliquots de 10 µl. Conserver à -20 °C.
Formamide, désionisé	Réactif	Ambion	9342
tRNA de levure – 25 mg	Réactif	Invitrogen	15401-011	Stock à 20 mg/ml dans de l’eau DEPC, en aliquots de 125 µl. Conserver à -20 °C
Héparine, sel de sodium	Réactif	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Stock à 50 mg/ml dans de l’eau DEPC, en aliquots de 100 µl. Conserver à -20 °C.
SSC x20, pH 5,5	Réactif	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0,5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Réactif	Fisher Scientific	BP166-100
Acide maléique	Réactif	Fluka	63189
Réactif de blocage B–hringer	Réactif	Roche Group	11096176001	Utiliser à 2 % dans le MABT. Pour préparer, chauffer avec le MABT pendant 20 min à 60 °C. On peut préparer un stock et le conserver en aliquots de 1 à 5 ml à 20 °C.
Sérum de mouton inactivé par la chaleur	Réactif	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Dissoudre dans 10 ml d’eau H2O ; chauffer à 55 °C pendant 30 min. Aliquoter en 1 ml, à -20 °C.
Anti-digoxigénine-AP, fragments Fab	Réactif	Roche Group	11093274910
Solution mère NBT/BCIP	Réactif	Roche Group	11681451001
Anti-fluorescéine-AP, fragments Fab	Réactif	Roche Group	11426338910
Tris 2 M	BP1759-500	Fisher Scientific
Kit de substrat phosphatase alcaline Vector Red	Réactif	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tétrahydronaphtalène	Réactif	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Sous hotte