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Analyse de la qualité de l'eau via des organismes indicateurs

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Water Quality Analysis via Indicator Organisms

2.6: Community DNA Extraction from Bacterial Colonies

2.13: Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

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08:17 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba – Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner

Analyse de qualité de l’eau surveille les influences anthropiques tels que les polluants, les nutriments, pathogènes et autres éléments qui peuvent influer sur l’intégrité de l’eau comme une ressource. La contamination fécale contribue pathogènes microbiens qui menacent les plantes, animaux et la santé humaine avec ou à une maladie. La demande en eau croissante et strictes normes de qualité exigent que l’eau fournie pour les ressources humaines ou environnementales soit surveillé pour niveaux faiblement pathogène. Toutefois, suivi chaque pathogène lié à la pollution fécale n’est pas possible, car des techniques de laboratoire impliquent des coûts, temps et le vaste travail. Détection de micro-organismes indicateurs offre donc une technique simple, rapide et rentable pour surveiller les pathogènes associés à des conditions non hygiéniques.

Principles

Les indicateurs sont facilement détectables organismes dont la présence est corrélée directement à un ou plusieurs agents pathogènes, contamination de l’environnement. Pour être considéré comme un indicateur approprié, un organisme doit satisfaire les cinq suivant critère :

L’organisme indicateur doit être présent quand l’agent pathogène est présent, et l’organisme indicateur doit être absent lorsque l’agent pathogène est absent.
Concentration de l’organisme indicateur doit mettre en corrélation avec la concentration de l’agent pathogène. Toutefois, l’organisme indicateur devrait toujours être trouvé à un plus grand nombre.
L’organisme indicateur devrait être capable de survivre plus facilement et plus longtemps dans l’environnement que l’agent pathogène.
Détection de l’organisme indicateur devrait être facile, sûre et peu coûteuse.
L’organisme indicateur devrait être efficace pour tous les types d’eau.

La plupart des indicateurs sont organismes entériques ou virus, qui sont généralement trouvés dans le sang mammifères et d’oiseaux gastro-intestinal systèmes chaud, donnant un accès direct à la contamination fécale. Cependant, de nombreux indicateurs peuvent manquer efficacité due à une mauvaise corrélation avec certains agents pathogènes. Deux des organismes bactériens indicateur plus largement acceptés sont Escherichia coli et les coliformes en raison de leurs liens fécales et aisance dans l’analyse en laboratoire.

Colilert est une approche de technologie (DST) de substrat défini pour la détection simultanée, l’identification spécifique et confirmation pour e. coli et coliformes totaux dans des échantillons d’eau. Cette technique de laboratoire utilise des nutriments de substrat spécifiques de voie métabolique des organismes de chaque indicateur, énumérer seulement les micro-organismes désirés, dégageant un signal lors de la bactérie modifie le composé. En présence d’un coliforme, nutriment (ONPG) ortho-nitrophényl-β-D-galactopyranoside est hydrolysé par l’enzyme β-galactosidase des coliformes. Le produit composé, ortho-nitrophényl, est un chromogène qui émet un signal de couleur, tournant l’eau jaune (Figure 1).

La figure 1. Schéma montrant les ortho-nitrophényl libérant un signal de couleur, tournant l’eau jaune.

En présence de e. coli, nutriment méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide (MUG) est clivé par enzyme de la bactérie glucuronidase, la production d’un produit de méthylumbelliférone qui émet une fluorescence bleue-verte sous la lumière ultraviolette (Figure 2).

La figure 2. Schéma montrant le nutriment méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide (MUG), clivé par l’enzyme glucuronidase de la bactérie, un produit de methylumberlliferone qui émet une fluorescence bleue-verte sous une lumière ultraviolette.

Colilert peut être effectuée comme test présence-absence (P-A) pour indiquer si oui ou non les organismes existent dans l’échantillon. Ce test est réalisé en dissolvant le substrat dans les échantillons d’eau de 100 mL, en incubation à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 h et en observant les signaux de couleur. Présence des “indicateurs peut également être quantifié en utilisant un système qui détermine le nombre le plus probable (NPP) pour chaque organisme. Cette procédure consiste à dissoudre le substrat dans les échantillons d’eau de 100 mL qui sont scellés dans un bac contenant 49 grands puits et 48 petits puits. Le plateau est incubé à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 h, et puis les puits contenant des changements de couleur positive sont comptés. Le ratio des grands aux petits puits contenant des signaux positifs est aligné sur le tableau NPP qui permet la quantification de la présence de chaque organisme indicateur présent. Règlement pour l’eau potable aux États-Unis exige que zéro coliformes sont présents dans 100 mL d’eau potable.

Procedure

1. Colilert présence-Absence (P – A) Test

Ouvrez la bouteille Colilert en plastique de 100 mL. Le flacon contient une petite quantité de réactif en poudre qui est nécessaire pour les réactions appropriées, ne jetez pas cette poudre.
Ajouter échantillon de 100 mL en bouteille Colilert.
Ouvrir le tube d’oreiller contenant le substrat nutritif et versez le contenu dans l’échantillon d’eau à l’intérieur de la bouteille Colilert.
Boucher et sceller la bouteille Colilert. Agiter le flacon énergiquement, à plusieurs reprises, inversant la bouteille jusqu’à ce que le substrat soit complètement dissout.
Incuber le mélange témoin réactif/eau à l’intérieur de la bouteille à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 h.
Observez la couleur jaune changent dans le mélange réactif/eau de l’échantillon. La couleur jaune indique les coliformes est présent. L’eau claire ou aucun changement de couleur indique que les coliformes fécaux est absentes.
Exposer l’échantillon/réactif à la lumière ultraviolette et observer la fluorescence bleue. Fluorescence bleue indique qu’e. coli est présente. Aucune fluorescence n’indique qu’e. coli est absent (Figure 3).

La figure 3. P-A test négatif (à gauche), coliforme positif (au milieu) et e. coli positif (à droite).

2. Colilert MPN : Quanti-tray 2000

Ouvrir la bouteille Colilert et échantillon de 100 mL en bouteille Colilert.
Ouvrir le tube d’oreiller contenant le substrat nutritif et versez le contenu dans l’échantillon d’eau à l’intérieur de la bouteille Colilert.
Boucher et sceller la bouteille Colilert. Agiter le flacon énergiquement, à plusieurs reprises, inversant la bouteille jusqu’à ce que le substrat soit complètement dissout.
Ouvrir soigneusement Quanti-tray 2000 en pressant les bords en haut de la barre d’État et en tirant vers l’arrière l’onglet papier garder pressant afin que le tiroir est ouvert.
Verser le mélange réactif/eau de l’échantillon dans le bac et puis incuber l’échantillon à l’intérieur de la barre d’État à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 h.
Observez la couleur jaune changent dans le mélange réactif/eau de l’échantillon. Compter le nombre de petits et grands puits que le signal positif présence de coliformes fécaux. La couleur jaune indique les coliformes est présent. L’eau claire ou aucun changement de couleur indique que les coliformes fécaux est absentes.
Exposer l’échantillon réactif/eau aux rayons ultraviolets et observer la fluorescence bleue. Compter le nombre de grands et petits puits qui signalent la présence positive pour e. coli. La fluorescence bleue indique qu’e. coli est présente. Aucune fluorescence n’indique qu’e. coli est absent.
La fiche de Quanti-tray 2000 MPN (Figure 4) permet de quantifier la concentration pour chaque organisme indicateur présent dans 100 mL d’eau. Utilisez la feuille de calcul pour comparer grand : petit rapport bien positif pour énumérer la présence pour les deux organismes indicateurs.

La figure 4. Quanti-tray négatif (à gauche), coliforme positif (au milieu) et e. coli positif (à droite).

Analyse de qualité de l’eau est vitale pour préserver l’intégrité des ressources en eau. La présence de microorganismes indicateurs est corrélée avec la présence de matière fécale, pouvant contenir des agents pathogènes qui causent des maladies. Organismes indicateurs permet donc d’évaluer la sécurité des approvisionnements en eau.

La contamination fécale dans l’eau pose un risque important pour la santé des plantes, les animaux et les humains, comme les agents pathogènes gastro-intestinaux sont jetées dans un nombre très élevé dans les selles. Toutefois, le suivi des échantillons d’eau pour chaque type d’agent pathogène unique, associé à la pollution fécale n’est pas possible. Arpentage de micro-organismes indicateurs offre un moyen simple, rapid et rentable pour détecter la contamination fécale dans les ressources en eau.

Cette vidéo illustre les principes sous-jacents à l’aide de micro-organismes indicateurs pour évaluer la qualité de l’eau, comment faire pour tester les échantillons d’eau prélevés et l’interprétation et la quantification des données résultantes.

Pour être utilisé comme un indicateur de qualité de l’eau, les organismes doivent satisfaire à cinq critères spécifiques. Tout d’abord, il devrait être détectable dans l’eau où l’agent pathogène est présent, et absent lorsque l’agent pathogène est absent. En second lieu, le nombre de micro-organismes indicateurs doit correspondre avec les concentrations d’agents pathogènes. Il devrait également être plus sévères et persister plus longtemps dans l’environnement que l’agent pathogène. Enfin, la détection devrait être facile, sûre et peu coûteux et efficace pour tous les types d’eau.

Deux de chaque groupe d’indicateurs bactériens plus courantes sont les coliformes totaux et des coliformes fécaux, généralement e. coli. Coliformes totaux se trouvent dans l’intestin des mammifères, mais peuvent également se produire naturellement dans le sol et les eaux de surface. Les coliformes fécaux sont un sous-ensemble qui se trouvent entièrement à l’intérieur du tractus gastrointestinal de mammifères et d’oiseaux et sont continuellement excrétés dans les fèces. Les coliformes sont vulnérables aux mêmes contraintes comme de nombreux pathogènes courants de l’intestin, comme le traitement de l’eau ou le faible niveau des éléments nutritifs, leur présence dans un échantillon d’eau est un indicateur utile de la présence potentielle d’agents pathogènes. Les coliformes totaux et Escherichia coli sont facilement détectées dans l’environnement de laboratoire.

Pour la détection, les substrats chimiques sont ajoutés à l’échantillon qui métabolisent les coliformes, conduisant à un changement de couleur. Pour les coliformes totaux, ONPG ajouté est converti en nitrophénol, tournant l’eau jaune. Pour les coliformes fécaux, e. coli convertit MUG à un produit de méthyl-umbelliferone qui émet une fluorescence bleue-verte sous une lumière ultraviolette. Dans son application la plus simple, le test de substrat peut confirmer la présence ou l’absence de coliformes existant dans l’eau au moment de l’échantillonnage.

Contrairement à cette méthode qualitative, le nombre de coliformes totaux par exemple on peut estimer en utilisant un plateau partitionné spécialisé. Une fois le substrat réactif est dissoute, l’échantillon d’eau est ajouté à un plateau contenant les grands et les petits puits et puis incubé. Puits, montrant le changement de couleur sont comptés, et le ratio des petits et grands puits démontrant des signaux positifs colorimétriques est aligné sur un graphique qui indique une quantité. US d’eau potable doit contenir zéro coliformes totaux par 100 mL.

Maintenant que nous sommes familiers avec les principes de l’utilisation de micro-organismes indicateurs pour identifier et quantifier la contamination de l’eau, examinons un comment cela s’effectue en laboratoire.

Une fois que les échantillons ont été prélevés, mettez-les en laboratoire pour les essais. Pour commencer, ouvrez une bouteille en plastique de 100 mL. Bouteilles peuvent contenir une petite quantité de réactif de thiosulfate de sodium en poudre qui sert à s’assurer de la neutralisation de tout chlore qui peut-être être présente. Ajouter 100 mL d’échantillon d’eau dans la bouteille. Ouvrez un oreiller tube contenant le substrat nutritif et versez le contenu dans l’échantillon d’eau à l’intérieur de la bouteille. Cap et sceller la bouteille, puis secouez vigoureusement, à plusieurs reprises, inversant la bouteille jusqu’à ce que le substrat soit complètement dissout. Ensuite, incuber la bouteille d’échantillon-réactif à 35 ° C pendant 24 h.

Observez la couleur jaune changent dans le mélange échantillon-réactif. Couleur jaune indique que les coliformes fécaux est présents. Aucun changement de couleur n’indique que les coliformes fécaux est absentes. Enfin, exposer le mélange échantillon-réactif à la lumière ultraviolette et observer. Fluorescence bleue, en combinaison avec un changement de couleur jaune, indique qu’e. coli est présente. Aucune fluorescence n’indique absence.

La plupart du nombre Probable, ou NPP, peut aussi être déterminé pour les échantillons. Ouvrir une bouteille et ajouter 100 mL d’échantillon d’eau. Ouvrir le tube d’oreiller du substrat nutritif et versez le contenu dans l’échantillon d’eau dans la bouteille. Boucher et sceller la bouteille. Agiter vigoureusement, retournant à plusieurs reprises jusqu’à ce que le substrat soit complètement dissout. Avec précaution, ouvrir le tiroir en serrant les bords en haut et tirez le papier onglet. Exercez une pression constante pour garder le plateau ouvert. Versez le mélange échantillon-réactif dans le bac et le joint. Incuber le plateau à 35 ° C pendant 24 h.

Observez la couleur changent dans le bac de mélange échantillon-réactif. Compter le nombre de puits grands et petits puits qui ont jauni pour indiquer la présence de coliformes. Ensuite, ouvrir le tiroir de l’échantillon-réactif à la lumière ultraviolette et observer la fluorescence bleue. Compter le nombre de petits et grands puits que le signal positif présence d’Escherichia coli.

À l’aide de la feuille MPN fournie, quantifier la concentration pour chaque organisme indicateur présent dans 100 mL d’eau. Trouver le nombre de petits puits positifs sur le haut du tableau et le nombre de grands puits positifs sur l’axe du côté gauche. L’intersection des deux donnera un chiffre représentant le nombre le plus Probable, c’est-à-dire le nombre estimatif d’organismes par 100 mL.

Coliformes totaux et les tests de détection d’e. coli sont utilisés pour vérifier la contamination dans une variété d’échantillons d’eau.

L’eau qui est destiné à la consommation humaine, ou potable, est régulièrement testé pour la contamination. Afin que l’eau soit considéré comme sans danger, il doit contenir moins de 1 coliformes / 100 mL. Ici, l’eau d’un robinet a été recueillie et testé pour les coliformes totaux ou contamination par e.coli , comme précédemment démontré. Les résultats déterminés si une source d’eau était propre à la consommation.

Un autre échantillon communément testé est le traitement des eaux usées. L’eau doit être testé pour s’assurer que c’est sans danger pour le rejet dans l’environnement ou la réorientation à usage humain. Comme des niveaux élevés de contamination ont été prévus avant le traitement, l’échantillon d’eaux usées non traitées a été dilué au 1/100 000. Ces échantillons ont ensuite été soumis au NPP calculé et tests de détection d’e. coli et coliformes totaux. La valeur sûre après traitement doit être zéro détectable indicateurs bactériens.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE au contrôle qualité de l’eau à l’aide de micro-organismes indicateurs. Vous devez maintenant comprendre comment tester des échantillons d’eau pour e. coli et autres coliformes et comment quantifier le degré de contamination. Merci de regarder !

Applications and Summary

Organismes indicateurs sont employés pour rapidement et à moindre coût déterminer la contamination de l’environnement. Colilert dosages sont utilisés pour analyser la qualité de l’eau pour boire, loisirs et les sources d’eaux usées. Qualité de l’eau doit respecter des normes juridiques fixées par l’Environmental Protection Agency (EPA) et les services réglementaires de l’État afin d’être accepté comme une ressource pour la consommation humaine et/ou environnementale.

Colilert dosages sont aussi stratégiquement utilisés comme marqueurs du bilan massique au sein de la recherche sur l’environnement, et ces données peuvent être analysées ainsi que d’autres tests environnementaux pour mesurer la corrélation entre les résultats. Effectuer un simple test Colilert p-a indique si un échantillon est contaminé, ce qui peut être analysé à côté des résultats de recherche. Si l’échantillon de P-A montre qu’il y a contamination dans l’eau, puis les échantillons d’eau utilisées dans la recherche peuvent aussi avoir de contamination qui mène à mal interprétés résultats, tandis que le NPP Quanti-tray fournit une quantification de base pour la contamination actuelle. Par exemple, les organismes indicateurs permet de corréler les quantifications de l’indicateur avec le nombre de pathogènes trouvés dans un échantillon d’eau. Si le quanti-tray énumère les chiffres de l’indicateur de faible, cela laisse supposer que l’échantillon d’eau devrait également rencontrer des tendances similaires avec des niveaux faiblement pathogène.

Transcript

Water quality analysis is vital to safeguard the integrity of water resources. The presence of indicator microorganisms is correlated with the presence of fecal matter, which may contain disease-causing pathogens. Indicator organisms can therefore be used to evaluate the safety of water supplies.

Fecal contamination in water poses a significant risk to the health of plants, animals, and humans, as gastrointestinal pathogens are shed in very high numbers in the feces. However, monitoring water samples for each type of unique pathogen associated with fecal pollution is not feasible. Surveying for Indicator organisms provides a simple, rapid, and cost effective way to detect fecal contamination in water resources.

This video will illustrate the principles behind using indicator organisms to evaluate water quality, how to test collected water samples, and the interpretation and quantification of resulting data.

To be used as a water quality indicator, organisms must meet five specific criteria. First, it should be detectable in water where the pathogen is present, and absent when the pathogen is absent. Second, the number of indicator organisms must correspond with pathogen levels. It should also be tougher and persist longer in the environment than the pathogen. Finally, detection should be easy, safe, and inexpensive, and effective across all water types.

Two of the most common bacterial indicator groups are total coliforms and fecal coliforms, typically E. coli. Total coliforms can be found in the mammalian gut, but may also occur naturally in soil and surface water. Fecal coliforms are a subset that reside entirely within the gastrointestinal tracts of mammals and birds and are continuously shed in feces. Coliforms are vulnerable to the same stresses as many common gut pathogens, such as water treatment or low nutrient levels, their presence in a water sample is a useful indicator of the potential presence of pathogens. Both total coliforms and E. coli are readily detected in the laboratory setting.

For detection, chemical substrates are added to the sample that the coliforms metabolize, resulting in a color change. For total coliforms, added ONPG is converted to nitrophenol, turning the water yellow. For fecal coliforms, E. coli converts MUG to a methyl-umbelliferone product that fluoresces blue-green under ultraviolet light. In its simplest application, the substrate test can confirm the presence or absence of coliforms existing in the water at the time of sampling.

In contrast to this qualitative method, the number of total coliforms per sample can be estimated using a specialized partitioned tray. After the reactive substrate is dissolved, the water sample is added to a tray containing large and small wells, and then incubated. Wells exhibiting the color change are counted, and the ratio of small to large wells demonstrating positive colorimetric signals is aligned to a chart that indicates a quantity. US drinking water supplies must contain zero total coliforms per 100 mL.

Now that we are familiar with the principles of using indicator organisms to identify and quantify water contamination, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.

Once samples have been collected, bring them into the laboratory for testing. To begin, open a 100-mL plastic bottle. Bottles may contain a small amount of powdered sodium thiosulfate reagent that is used to ensure the neutralization of any chlorine that might be present. Add 100 mL of water sample into the bottle. Open a pillow tube containing nutrient substrate and pour the contents into the water sample inside the bottle. Cap and seal the bottle, then shake vigorously, repeatedly inverting the bottle until the substrate is completely dissolved. Next, incubate the sample-reagent bottle at 35 °C for 24 h.

Observe the yellow color change in the sample-reagent mixture. Yellow color indicates that coliforms are present. No change in color indicates that coliforms are absent. Finally, expose the sample-reagent mixture to ultraviolet light and observe. Blue fluorescence, in combination with a yellow color change, indicates that E. coli is present. No fluorescence indicates absence.

Most Probable Number, or MPN, can also be determined for samples. Open a bottle, and add 100 mL of water sample. Open the pillow tube of nutrient substrate and pour the contents into the water sample in the bottle. Cap and seal the bottle. Shake vigorously, inverting repeatedly until the substrate is completely dissolved. Carefully open the tray by squeezing the edges at the top and pull back the paper tab. Apply constant pressure to keep the tray open. Pour the sample-reagent mixture into the tray and seal. Incubate the tray at 35 °C for 24 h.

Observe the color change in the sample-reagent mix tray. Count the number of large wells and small wells that have turned yellow to indicate the presence of coliforms. Next, expose the sample-reagent tray to ultraviolet light and observe blue fluorescence. Count the number of large and small wells that signal positive presence of E. coli.

Using the provided MPN sheet, quantify the concentration for each indicator organism present in 100 mL of water. Find the number of small positive wells along the top of the table, and the number of large positive wells on the left side axis. The intersection of the two will give a figure representing the Most Probable Number, which is the estimated number of organisms per 100 mL.

Total coliform and E. coli detection tests are used to check for contamination in a variety of water samples.

Water that is meant for human consumption, or potable, is routinely tested for contamination. In order for water to be deemed safe, it should contain fewer than 1 coliform per 100 mL. Here, water from a tap was collected, and tested for total coliform or E. coli contamination, as previously demonstrated. The results determined if a water source was safe for consumption.

Another sample commonly tested is treated wastewater. The water must be tested to ensure it is safe for release into the environment or repurposing for human use. As high levels of contamination were expected prior to treatment, the raw sewage sample was diluted to 1:100,000. These samples were then subjected to total coliform and E. coli detection tests, and MPN values calculated. The safe value after processing should be zero detectable indicator bacteria.

You’ve just watched JoVE’s introduction to testing water quality using indicator organisms. You should now understand how to test water samples for E. coli and other coliforms, and how to quantify the degree of contamination present. Thanks for watching!