Technique aseptique en sciences de l'environnement
1. préparation pour travail aseptique
- Obtenir et d’appliquer les articles suivants de la PPE : blouse, des gants en latex ou nitrile (exempts de déchirures ou trous) et des lunettes de sécurité (Figure 1). Pour la sécurité en cas d’utilisation d’une flamme nue, attacher les cheveux long.
Figure 1 : EPI : une blouse de laboratoire, gants en latex et des lunettes de sécurité. - Un deuxième aspect important d’une technique aseptique est l’autoclavage et le stockage des médias et les réactifs à utiliser dans le laboratoire. Préparer le bouillon liquide de culture (p. ex., bouillon trypticase soja) et axée sur la gélose médias (p. ex., R2A) par pesée la quantité appropriée de poudre séchée base, qui est ajoutée à la quantité appropriée d’eau déionisée.
- Pour le bouillon de culture, dissoudre la poudre sur une plaque chauffante avec faible chaleur appliquée et diluer le liquide soit en volumes de 100 mL dans des fioles de verre bouchon vissé, ou en volumes de 10 mL dans des éprouvettes de verre bouchon vissé. À l’aide d’une barre magnétique remuer, remuer le milieu d’agarose sur l’agitateur de plaque chauffante jusqu'à ce que la poudre soit complètement dissoute.
- Appliquer le Ruban autoclave pour les conteneurs et stériliser les médias selon les instructions du fabricant (p. ex., 20 min à 121 ° C) (Figures 2 et 3). Notez que la couleur des rayures sur le Ruban autoclave doit changer du blanc (autoclave avant) au noir (autoclave après). Bien que le changement de couleur indique généralement que la stérilisation a réussi, stérilité vérifie à l’aide de kits de bande de spores peut être effectuée pour vérifier le processus d’autoclavage.
Figure 2 : Ruban Autoclave appliqué au matériel.
Figure 3 : Note du changement de couleur des bandes sur ruban autoclave du blanc (autoclave avant) au noir (après autoclavage). - Cool les bouillons liquides à température ambiante et ensuite stocker à température ambiante ou au réfrigérateur à 4 ° C.
- Refroidir le milieu d’agarose en plaçant le récipient dans un bain d’eau réglé à ~ 50 ° C. Une fois refroidis, les médias peuvent être versés dans des plats de Pétri stérile. Laisser le milieu à refroidir et se solidifier, puis consolider à stocker sous températures spécifiées par le fabricant.
- Il existe plusieurs variétés de milieux de culture qui ne peuvent être stérilisés à l’autoclave, car les températures élevées dégradent ingrédients essentiels. Stérilisation ceux-ci nécessitent filtre-stérilisation à l’aide d’un système de filtration sous vide utilisant un filtre de 0,22 µm, suivi par un stockage à la température appropriée.
- Avant d’exécuter des travaux sur la paillasse, désinfecter la surface à l’aide d’une solution appropriée (p. ex., eau de Javel 500 ppm). Cela réduit le risque de transfert des contaminants de la surface de travail pour les cultures et milieux stériles.
- Pour établir un champ stérile, allumer un bec Bunsen. Le type de flamme mieux adapté pour stérilisation métal öses est une flamme bleue intense, avec un cône bleu définitif observé au milieu (Figure 4).
Figure 4 : Isoler les transfert de bactéries d’un Pétri affichant la croissance d’une culture à une autre plaque non inoculée de Petri contenant un milieu de croissance axée sur la gélose. - Lentement, passer la boucle inoculer dans la partie la plus chaude de la flamme (pointe du cône bleu). La boucle doit devenir rouge chaud aux fins de stérilisation.
2. bactériennes transferts : De Pétri de Pétri
- Un scénario de transfert de bactéries provient un Pétri affichant la croissance d’une souche à l’autre, stérile Pétri cultivée contenant un milieu de croissance axée sur la gélose.
- Pour commencer, ouvrez légèrement la plaque de Petri contenant la culture bactérienne pure et Tapotez doucement la boucle inoculer chaude, stérilisée à la surface de la gélose.
- Récupérer une colonie isolée de la surface de la plaque à l’aide de la boucle inoculer refroidie et ferme la Pétri.
- Effectuer une strie d’isolement à l’aide d’un frais de Pétri contenant le milieu de culture, avec le couvercle légèrement entrouvert.
- Pour chaque partie de la strie d’isolement (3 au total par plaque), flamme-stériliser l’inoculation boucle juste avant leur utilisation. En outre, flamme-stériliser la boucle juste après que la séquence finale est effectuée afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser ou entrent en contact avec les boucles inoculer.
- Placez les géloses ensemencées dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
3. bactériennes transferts : Du bouillon de Culture à Pétri
- Un deuxième scénario de transfert de bactéries provient d’un bouillon de culture présentant la croissance, comme généralement observée par la turbidité, sur une plaque de Petri stérile contenant du milieu de croissance.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant la culture bactérienne pure et l’ouverture du conteneur du passer 2-3 x à travers la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la boucle inoculer stérilisée dans le tube/ballon et appuyez doucement contre la paroi du récipient refroidir juste avant l’insertion dans le bouillon de culture.
- Supprimer une anse du bouillon de culture (Figure 5) et immédiatement remettre le couvercle.
Figure 5 : Une anse du bouillon de culture. - Effectuer une strie d’isolement à l’aide d’un frais de Pétri contenant le milieu de culture, avec le couvercle légèrement entrouvert.
- Pour chaque portion de la séquence (3 au total par plaque), flamme-stériliser l’inoculation boucle juste avant leur utilisation. En outre, flamme-stériliser la boucle juste après que la séquence finale est effectuée afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
- Placer les plaques striées pour l’isolement dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
4. bactériennes transferts : De Pétri avec une croissance à un milieu liquide stérile
- Un troisième scénario de transfert de bactéries provient d’une plaque de Petri contenant une strie de culture isolée dans une tube/fiole contenant le milieu de culture liquide stérile.
- Un peu ouvrir la plaque de Petri contenant la culture bactérienne pure et refroidir la boucle chaude inoculer en tapant doucement sur la surface de la gélose.
- Récupérer une colonie isolée de la surface de la plaque à l’aide de la boucle inoculer refroidie et ferme la Pétri.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant le liquide stérile milieu de croissance et passez l’ouverture du conteneur 2 à 3 fois par le biais de la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas le bouchon vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la colonie extraite dans le milieu de bouillon liquide et agiter délicatement la boucle afin de libérer les bactéries. Le reboucher immédiatement.
- Flamme-stériliser la boucle à inoculation afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
- Placer le ballon dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
- Retirer le flacon d’incubation le lendemain. Effectuer une série de dilution afin d’énumérer la culture.
- Les dilutions de la série sur les milieux de culture d’agarose sur plaque et incuber les boîtes pendant la nuit.
- Enlever les plaques le lendemain et observer toute contamination.
5. bactériennes transferts : Du bouillon de Culture au milieu de culture liquide stérile
- Un quatrième scénario de transfert de bactéries provient d’un bouillon de culture présentant la croissance dans une tube/fiole contenant le milieu de culture liquide stérile.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant la culture bactérienne pure et passez l’ouverture du contenant deux fois par le biais de la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la boucle inoculer dans le tube/ballon et appuyez doucement contre la paroi du récipient refroidir juste avant l’insertion dans le bouillon de culture.
- Supprimer une anse du bouillon de culture et immédiatement remettre le couvercle.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant le liquide stérile milieu de croissance et passez l’ouverture du contenant deux fois dans la partie plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement l’anse extraite dans le milieu du bouillon liquide stérile et agiter délicatement la boucle afin de libérer les bactéries. Le reboucher immédiatement.
- Flamme-stériliser l’inoculation boucle (Figure 6) afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
Figure 6 : Inoculant boucle tournant rouge chaud tout en étant stérilisé avec un bec Bunsen. - Placer le ballon dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
- Retirer le flacon d’incubation le lendemain. Effectuer une série de dilution afin d’énumérer la culture.
- Les dilutions de la série sur les milieux de culture d’agarose sur plaque et incuber les boîtes pendant la nuit.
- Enlever les plaques le lendemain et observer toute contamination.
Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner
Une technique aseptique est u…
1. préparation pour travail aseptique
- Obtenir et d’appliquer les articles suivants de la PPE : blouse, des gants en latex ou nitrile (exempts de déchirures ou trous) et des lunettes de sécurité (Figure 1). Pour la sécurité en cas d’utilisation d’une flamme nue, attacher les cheveux long.
Figure 1 : EPI : une blouse de laboratoire, gants en latex et des lunettes de sécurité. - Un deuxième aspect important d’une technique aseptique est l’autoclavage et le stockage des médias et les réactifs à utiliser dans le laboratoire. Préparer le bouillon liquide de culture (p. ex., bouillon trypticase soja) et axée sur la gélose médias (p. ex., R2A) par pesée la quantité appropriée de poudre séchée base, qui est ajoutée à la quantité appropriée d’eau déionisée.
- Pour le bouillon de culture, dissoudre la poudre sur une plaque chauffante avec faible chaleur appliquée et diluer le liquide soit en volumes de 100 mL dans des fioles de verre bouchon vissé, ou en volumes de 10 mL dans des éprouvettes de verre bouchon vissé. À l’aide d’une barre magnétique remuer, remuer le milieu d’agarose sur l’agitateur de plaque chauffante jusqu'à ce que la poudre soit complètement dissoute.
- Appliquer le Ruban autoclave pour les conteneurs et stériliser les médias selon les instructions du fabricant (p. ex., 20 min à 121 ° C) (Figures 2 et 3). Notez que la couleur des rayures sur le Ruban autoclave doit changer du blanc (autoclave avant) au noir (autoclave après). Bien que le changement de couleur indique généralement que la stérilisation a réussi, stérilité vérifie à l’aide de kits de bande de spores peut être effectuée pour vérifier le processus d’autoclavage.
Figure 2 : Ruban Autoclave appliqué au matériel.
Figure 3 : Note du changement de couleur des bandes sur ruban autoclave du blanc (autoclave avant) au noir (après autoclavage). - Cool les bouillons liquides à température ambiante et ensuite stocker à température ambiante ou au réfrigérateur à 4 ° C.
- Refroidir le milieu d’agarose en plaçant le récipient dans un bain d’eau réglé à ~ 50 ° C. Une fois refroidis, les médias peuvent être versés dans des plats de Pétri stérile. Laisser le milieu à refroidir et se solidifier, puis consolider à stocker sous températures spécifiées par le fabricant.
- Il existe plusieurs variétés de milieux de culture qui ne peuvent être stérilisés à l’autoclave, car les températures élevées dégradent ingrédients essentiels. Stérilisation ceux-ci nécessitent filtre-stérilisation à l’aide d’un système de filtration sous vide utilisant un filtre de 0,22 µm, suivi par un stockage à la température appropriée.
- Avant d’exécuter des travaux sur la paillasse, désinfecter la surface à l’aide d’une solution appropriée (p. ex., eau de Javel 500 ppm). Cela réduit le risque de transfert des contaminants de la surface de travail pour les cultures et milieux stériles.
- Pour établir un champ stérile, allumer un bec Bunsen. Le type de flamme mieux adapté pour stérilisation métal öses est une flamme bleue intense, avec un cône bleu définitif observé au milieu (Figure 4).
Figure 4 : Isoler les transfert de bactéries d’un Pétri affichant la croissance d’une culture à une autre plaque non inoculée de Petri contenant un milieu de croissance axée sur la gélose. - Lentement, passer la boucle inoculer dans la partie la plus chaude de la flamme (pointe du cône bleu). La boucle doit devenir rouge chaud aux fins de stérilisation.
2. bactériennes transferts : De Pétri de Pétri
- Un scénario de transfert de bactéries provient un Pétri affichant la croissance d’une souche à l’autre, stérile Pétri cultivée contenant un milieu de croissance axée sur la gélose.
- Pour commencer, ouvrez légèrement la plaque de Petri contenant la culture bactérienne pure et Tapotez doucement la boucle inoculer chaude, stérilisée à la surface de la gélose.
- Récupérer une colonie isolée de la surface de la plaque à l’aide de la boucle inoculer refroidie et ferme la Pétri.
- Effectuer une strie d’isolement à l’aide d’un frais de Pétri contenant le milieu de culture, avec le couvercle légèrement entrouvert.
- Pour chaque partie de la strie d’isolement (3 au total par plaque), flamme-stériliser l’inoculation boucle juste avant leur utilisation. En outre, flamme-stériliser la boucle juste après que la séquence finale est effectuée afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser ou entrent en contact avec les boucles inoculer.
- Placez les géloses ensemencées dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
3. bactériennes transferts : Du bouillon de Culture à Pétri
- Un deuxième scénario de transfert de bactéries provient d’un bouillon de culture présentant la croissance, comme généralement observée par la turbidité, sur une plaque de Petri stérile contenant du milieu de croissance.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant la culture bactérienne pure et l’ouverture du conteneur du passer 2-3 x à travers la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la boucle inoculer stérilisée dans le tube/ballon et appuyez doucement contre la paroi du récipient refroidir juste avant l’insertion dans le bouillon de culture.
- Supprimer une anse du bouillon de culture (Figure 5) et immédiatement remettre le couvercle.
Figure 5 : Une anse du bouillon de culture. - Effectuer une strie d’isolement à l’aide d’un frais de Pétri contenant le milieu de culture, avec le couvercle légèrement entrouvert.
- Pour chaque portion de la séquence (3 au total par plaque), flamme-stériliser l’inoculation boucle juste avant leur utilisation. En outre, flamme-stériliser la boucle juste après que la séquence finale est effectuée afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
- Placer les plaques striées pour l’isolement dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
4. bactériennes transferts : De Pétri avec une croissance à un milieu liquide stérile
- Un troisième scénario de transfert de bactéries provient d’une plaque de Petri contenant une strie de culture isolée dans une tube/fiole contenant le milieu de culture liquide stérile.
- Un peu ouvrir la plaque de Petri contenant la culture bactérienne pure et refroidir la boucle chaude inoculer en tapant doucement sur la surface de la gélose.
- Récupérer une colonie isolée de la surface de la plaque à l’aide de la boucle inoculer refroidie et ferme la Pétri.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant le liquide stérile milieu de croissance et passez l’ouverture du conteneur 2 à 3 fois par le biais de la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas le bouchon vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la colonie extraite dans le milieu de bouillon liquide et agiter délicatement la boucle afin de libérer les bactéries. Le reboucher immédiatement.
- Flamme-stériliser la boucle à inoculation afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
- Placer le ballon dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
- Retirer le flacon d’incubation le lendemain. Effectuer une série de dilution afin d’énumérer la culture.
- Les dilutions de la série sur les milieux de culture d’agarose sur plaque et incuber les boîtes pendant la nuit.
- Enlever les plaques le lendemain et observer toute contamination.
5. bactériennes transferts : Du bouillon de Culture au milieu de culture liquide stérile
- Un quatrième scénario de transfert de bactéries provient d’un bouillon de culture présentant la croissance dans une tube/fiole contenant le milieu de culture liquide stérile.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant la culture bactérienne pure et passez l’ouverture du contenant deux fois par le biais de la partie la plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement la boucle inoculer dans le tube/ballon et appuyez doucement contre la paroi du récipient refroidir juste avant l’insertion dans le bouillon de culture.
- Supprimer une anse du bouillon de culture et immédiatement remettre le couvercle.
- Enlever le bouchon de l’éprouvette (ou ballon) contenant le liquide stérile milieu de croissance et passez l’ouverture du contenant deux fois dans la partie plus chaude de la flamme. Pour prévenir la contamination, ne définissez pas de la PAC vers le bas sur la table.
- Déposez délicatement l’anse extraite dans le milieu du bouillon liquide stérile et agiter délicatement la boucle afin de libérer les bactéries. Le reboucher immédiatement.
- Flamme-stériliser l’inoculation boucle (Figure 6) afin de prévenir la contamination de la surface du banc et en contrepartie à des tiers dans le laboratoire, qui peut-être par la suite utiliser les boucles inoculer.
Figure 6 : Inoculant boucle tournant rouge chaud tout en étant stérilisé avec un bec Bunsen. - Placer le ballon dans un incubateur pour la croissance du jour au lendemain.
- Retirer le flacon d’incubation le lendemain. Effectuer une série de dilution afin d’énumérer la culture.
- Les dilutions de la série sur les milieux de culture d’agarose sur plaque et incuber les boîtes pendant la nuit.
- Enlever les plaques le lendemain et observer toute contamination.
La technique aseptique est une compétence fondamentale en microbiologie et a des applications cruciales dans la recherche environnementale.
Si les cultures microbiologiques sont contaminées, le temps, la main-d’œuvre et les coûts financiers qui seraient nécessaires à un laboratoire pour « nettoyer » ou remplacer les cultures, en particulier les isolats rares provenant d’environnements uniques, pourraient être très élevés et prohibitifs, et certains échantillons pourraient être irremplaçables.
L’utilisation appropriée des techniques aseptiques réduit la probabilité de contamination bactérienne et fongique des réactifs, des milieux de culture et des échantillons environnementaux, et évite également la contamination croisée entre les échantillons. Il s’agit également d’une mesure de sécurité qui diminue la transmission potentielle de microbes à l’expérimentateur, ce qui est particulièrement important lorsque l’on travaille avec des agents pathogènes.
Cette vidéo présentera les principes de l’asepsie ; plusieurs techniques importantes pour maintenir des réactifs et des cultures stériles ; et enfin, certaines de leurs utilisations en sciences de l’environnement.
L’objectif de l’utilisation de techniques aseptiques est de créer et de maintenir un environnement de travail, des équipements et des réactifs stériles, afin de minimiser la contamination des échantillons biologiques. Les sources courantes de contamination comprennent les micro-organismes en suspension dans l’air, les microbes présents sur la paillasse ou l’équipement de laboratoire, ainsi que ceux provenant des cheveux, du corps et des vêtements du chercheur.
Deux types d’agents sont essentiels pour éliminer ou prévenir la contamination en laboratoire : les produits chimiques désinfectants et la chaleur. Des solutions telles que l’éthanol à 70 % et l’eau de Javel diluée sont souvent utilisées pour désinfecter l’équipement, les surfaces de travail et les gants des expérimentateurs avant de s’engager dans un travail aseptique.
Dans le même temps, les microbes présents sur ou dans les outils, la verrerie et les milieux liquides peuvent être tués thermiquement dans un autoclave, qui est une chambre qui stérilise le contenu en l’exposant à de la vapeur pressurisée à haute température. De plus, des outils tels que les tiges de verre utilisées pour le placage d’épandage et les boucles d’inoculation métalliques peuvent être stérilisés thermiquement à l’aide d’une source de flamme, telle qu’un bec Bunsen.
L’utilisation d’une source de flamme est également l’un des moyens les plus courants d’établir un environnement de travail aseptique. La chaleur de la flamme provoque une convection de l’air, générant un courant ascendant qui éloigne tous les contaminants en suspension dans l’air du voisinage du brûleur, et créant un « champ stérile » dans lequel effectuer des travaux expérimentaux aseptiques.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent les techniques aseptiques et pourquoi elles sont importantes, passons en revue un protocole pour créer un environnement de travail aseptique, préparer des milieux de croissance stériles et transférer aseptiquement des bactéries entre différentes conditions de culture.
Avant de commencer le travail d’asepsie, il est important que l’expérimentateur porte un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. Le but est à la fois d’empêcher l’expérimentateur de contaminer les échantillons et les cultures de laboratoire, et également d’empêcher le transfert de microbes potentiellement pathogènes au chercheur. Les articles EPI comprennent une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité.
L’étape suivante consiste à stériliser et à entreposer correctement les milieux de croissance à utiliser pour la culture des échantillons microbiens. Tout d’abord, pesez la quantité appropriée de composants du milieu solide et ajoutez-les au volume approprié de solvant liquide spécifié par le fabricant, tel que de l’eau déminéralisée, dans un récipient autoclavable Ajoutez une barre d’agitation magnétique, placez le récipient sur un agitateur à plaque chauffante et dissolvez les composants du milieu solide à feu doux et en agitant.
Fermez les récipients moyens. Si vous utilisez un récipient en verre avec un capuchon à vis, assurez-vous de ne pas serrer complètement le bouchon, car l’air à l’intérieur des récipients se dilatera en raison de la chaleur pendant l’autoclave et devra s’échapper. Sans s’échapper, le gaz pourrait provoquer la rupture du récipient. Mettez un morceau de ruban adhésif autoclave sur les récipients et autoclavez le support selon les instructions du fabricant, par exemple 20 min à 121 °C. Après l’autoclavage, vérifiez que les bandes sur les rubans de l’autoclave sont devenues noires, indiquant que la bonne température a été atteinte.
Pour les milieux de culture liquides, laissez-les refroidir à température ambiante et conservez-les à température ambiante ou au réfrigérateur, selon le cas. Pour les milieux de croissance solides à base d’agar-agar, laissez-les refroidir à environ 50 ? C, puis versez dans des boîtes de Pétri stériles. Laissez la gélose refroidir et se solidifier avant de la ranger à la température appropriée.
Pour les milieux qui ne peuvent pas être autoclavés en raison de la présence de composants sensibles à la chaleur, stériliser le filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
Une technique de base dans le travail microbiologique consiste à transférer aseptiquement des cultures bactériennes entre différents milieux de croissance, solides et liquides. Avant de commencer, nettoyez la surface de la paillasse du laboratoire avec un désinfectant. Cela réduit le risque de contamination des cultures ou des milieux stériles.
Le transfert de cultures bactériennes se fait généralement à l’aide d’un outil appelé boucle d’inoculation, qui doit être stérilisé avant d’être utilisé en chauffant à la flamme.
Allumez une source de flamme. Passez lentement la boucle d’inoculation à travers la pointe de la flamme. La boucle deviendra rouge. Pour transférer une colonie bactérienne à partir d’une plaque de gélose solide, ouvrez légèrement la plaque de Petri et tapotez doucement la boucle d’inoculation chaude sur une partie vide de la surface de la gélose pour éviter de tuer les bactéries par la chaleur. Grattez une seule colonie avec la boucle d’inoculation et fermez la plaque.
Pour transférer des bactéries d’un milieu de croissance liquide, retirez le capuchon du récipient de culture. Pour aider à prévenir la contamination, évitez de poser le capuchon sur le banc. Passez l’embouchure du récipient 2-3 fois à travers la partie la plus chaude de la flamme. Ensuite, touchez délicatement la boucle d’inoculation chaude et stérilisée à l’intérieur du récipient et laissez-la refroidir avant de l’insérer dans la culture de bouillon. Retirez une boucle de la culture et fermez immédiatement le bouchon.
Pour transférer les bactéries obtenues dans un milieu de croissance stérile, retirez le bouchon d’un récipient contenant le bouillon stérile et passez l’ouverture du récipient à travers la flamme 2-3 fois. Ensuite, abaissez soigneusement la boucle d’inoculation dans le milieu et agitez doucement pour libérer les bactéries. Fermez immédiatement le bouchon. Stérilisez la boucle d’inoculation après utilisation.
Si vous transférez des bactéries sur une plaque de gélose stérile, ouvrez le couvercle d’une plaque de Pétri fraîche avec de la gélose non inoculée. Striez la boucle d’inoculation avec la culture bactérienne d’avant en arrière sur un secteur de la gélose. Stérilisez la boucle et refroidissez-la en touchant une partie vide de l’agar, puis faites une autre traînée sur la gélose à un angle obtus par rapport à la première traînée, en vous assurant de croiser la première traînée sur les 1-2 premiers coups mais évitez de toucher la première traînée sur les traits suivants. Répétez la stérilisation et le streaking 2 fois de plus. Fermez la plaque de Petri et stérilisez la boucle d’inoculation.
Une fois inoculé, le bouillon ou la plaque de gélose doit ensuite être incubé à la température de croissance idéale pour que le micro-organisme donné obtienne une culture viable. Sur un milieu solide, une pelouse ou un brin continu de bactéries serait visible sur la gélose recouverte par les deux premières sries, mais des colonies individuelles devraient être obtenues sur la dernière strie. De mauvaises techniques d’asepsie entraîneraient la croissance de moisissures et d’autres contaminants sur la plaque.
Les techniques aseptiques sont importantes dans de nombreuses expériences impliquant des échantillons microbiens de l’environnement. Dans cette étude, les chercheurs ont isolé des bactériophages, qui sont des virus infectant les bactéries, de la bactérie commune du sol Arthrobacter. Les cultures d’Arthrobacter ont d’abord été cultivées dans des conditions aseptiques. Les échantillons de sol ont ensuite été lavés et filtrés dans un tampon de phage, et la solution de phage a été mélangée à la culture bactérienne et plaquée sur des plaques de gélose. Une pelouse bactérienne se formait sur l’assiette, mais il y avait des dégagements, ou « plaques », aux endroits où le virus avait infecté et tué la bactérie. Les phages pourraient ensuite être purifiés à partir de ces plaques pour une étude plus approfondie.
Outre l’utilisation de becs Bunsen, les environnements de travail aseptiques peuvent également être maintenus dans des postes de travail spécialisés connus sous le nom de hottes à flux laminaire, qui utilisent un flux d’air dirigé et des filtres pour maintenir la stérilité. Ici, les scientifiques ont travaillé dans une hotte d’écoulement pour isoler des bactéries et des virus potentiellement pathogènes à partir d’échantillons d’eau. Ces isolats ont ensuite été cultivés avec des amibes. Parce que les amibes mangent normalement ou « phagocytent » les bactéries, toutes les bactéries capables de résister à la digestion des amibes et de rester dans ces organismes peuvent également potentiellement rester viables dans les cellules humaines et provoquer des maladies.
Enfin, les conditions stériles permettent une étude détaillée des mécanismes écologiques tels que la formation de nodules racinaires chez les légumineuses - des organes remplis de bactéries qui « fixent » l’azote atmosphérique en ammoniac, qui est utilisé par la plante pour sa croissance. Les chercheurs ont créé des « microcosmes » pour étudier le processus de nodulation à l’aide de plaques de Pétri entaillées avec un milieu de croissance végétal, y ont placé des semis et ont inoculé les semis avec des bactéries rhizobiennes formant des nodules. L’environnement aseptique de la hotte d’écoulement empêche la contamination des cultures par d’autres bactéries ou champignons.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur les techniques aseptiques en sciences de l’environnement. Vous devriez maintenant comprendre pourquoi les conditions de travail aseptiques sont importantes ; comment effectuer des expériences microbiologiques de manière aseptique ; et certaines applications des techniques aseptiques à la recherche environnementale. Comme toujours, merci d’avoir regardé !
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Q1: Why is aseptic technique critical in environmental microbiology research?
Aseptic technique prevents bacterial and fungal contamination of reagents, culture media, and environmental samples, while avoiding cross-contamination between samples. Contamination can result in prohibitive costs to replace cultures, especially rare isolates from unique environments that may be irreplaceable. The technique also protects researchers by reducing pathogen transmission during laboratory work.
Q2: What are the main sources of contamination in a microbiology laboratory?
Common contamination sources include airborne microorganisms adhering to dust and lint particles, microbes on laboratory benches and unsterilized equipment, and microbes transferred from the researcher's hair, body, and clothing. Understanding these sources helps guide proper aseptic practices to maintain sterile working environments and protect culture integrity.
Q3: How does a Bunsen burner create a sterile working environment?
A Bunsen burner generates heat that causes air convection, creating an updraft that lifts airborne contaminants away from the flame vicinity. This updraft establishes a sterile field where aseptic experimental work can be conducted safely. The flame also sterilizes tools like inoculation loops and glass rods through direct heat exposure.
Q4: What is the proper procedure for sterilizing growth media in an autoclave?
Dissolve solid medium components in the specified liquid solvent in an autoclavable container with a magnetic stir bar. Loosely cap glass vessels to allow gas expansion during heating. Apply autoclave tape, then sterilize according to manufacturer instructions, typically 20 minutes at 121°C. Verify the tape stripes turned black, indicating proper temperature was reached.
Q5: How do you aseptically transfer bacteria using an inoculating loop?
Sterilize the inoculation loop by passing it through a flame until red hot. For solid agar, gently tap the hot loop on empty agar to cool it, then scrape a single colony. For liquid culture, pass the container mouth through flame 2-3 times, insert the cooled loop, and remove one loopful. Always sterilize the loop after use to prevent contamination.
Q6: What technique produces isolated bacterial colonies on an agar plate?
Streak the inoculation loop back-and-forth across one sector of sterile agar. Sterilize and cool the loop, then make a second streak at an obtuse angle, crossing the first streak on initial strokes only. Repeat sterilization and streaking two more times. Individual colonies appear on the final streak, while a bacterial lawn covers earlier streaks.
Q7: How are aseptic techniques applied to studying bacteriophages in environmental samples?
Researchers grow bacterial cultures under aseptic conditions, then mix soil-derived phage solutions with the bacterial culture and plate onto agar. A bacterial lawn forms on the plate, but plaques—clearings where viruses killed bacteria—appear at infection sites. Phage can then be purified from these plaques for further study using detection of bacteriophages in environmental samples methods.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:10
Principles of Aseptic Technique
3:02
Preparation for Aseptic Work
5:10
Aseptic Transfer of Bacteria Between Liquid Media and Petri Plates
8:13
Applications
10:20
Summary
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