2.13: Culture et dénombrement des bactéries dans un échantillon de sol

1. préparation des Dilutions de sol

1. Pour commencer la procédure, peser 10 g d’échantillon de sol et ajouter à 95 mL d’eau désionisée. Bien agiter la suspension et qualifier de « A ».
2. Avant que le sol s’affaisse, prélever 1 mL de la suspension avec une pipette stérile et transférez-la sur un blanc 9-mL d’eau désionisée. Vortex soigneusement et l’étiquette « B ».
3. Répétez cette étape de dilution trois fois, chaque fois avec 1 mL de la suspension précédente et un 9-mL désionisée vide. Ces étiquettes séquentiellement comme tubes C, D et E. Cela se traduit par des dilutions de 10^-1 par le biais de 10^-5 grammes / mL de sol

2. faire répandre des plaques pour Culture bactérienne

1. Pour agrandir les colonies bactériennes, prendre trois boîtes de gélose de levure-peptone préparés à l’avance et étiquette les échantillons C, D et E. Vortex C, D et E et pipette 0,1 mL dans chaque assiette. Cela augmente la valeur de la dilution en outre, d’un facteur dix (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Ensuite, trempez un épandeur de verre dans l’éthanol. Placez le séparateur dans une flamme pendant quelques secondes à s’enflammer et brûler de l’éthanol. Cela va stériliser l’épandeur.
3. Maintenez l’épandeur au-dessus de la première plaque jusqu'à ce que la flamme s’éteint. Ouvrir la plaque rapidement, maintient le couvercle fermer par. Touchez le séparateur à l’agar loin de l’inoculum (Inoculum = utilisés pour commencer une culture de cellules) se refroidir et s’étend ensuite la chute d’inoculum autour de la surface de la gélose jusqu'à disparaissent des traces de liquide. Replacez le couvercle de la plaque.
4. Re-flamme de l’épandeur et répétez le processus avec la plaquette suivante, travailler rapidement pour ne pas contaminer l’agar avec organismes aéroportés
5. Incuber les boîtes de bactéries à la température ambiante pendant 1 semaine. Assurez-vous que les plaques sont inversées au cours de l’incubation pour éviter les gouttes d’humidité par condensation de tomber sur la surface de la gélose.

3. la fabrication des plaques de propagation pour actinomycètes

1. Pour cultiver des actinomycètes, prendre trois plaques de glycérol-caséine préparés à l’avance et les qualifier de B, C et D. en utilisant les techniques décrites précédemment, insérer la plaque 0,1 mL de la suspension, B, C et D. Les dilutions inférieures sont utilisées car les actinomycètes sont généralement présentes sous forme de 1/10^ème de la population bactérienne (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incuber les boîtes d’actinomycètes (inversés) à température ambiante pendant 2 semaines.

4. bactérien et comtes d’actinomycètes

1. Après incubation, examiner toutes les plaques de bactéries avec soin et notez les différences dans la forme et la taille de la colonie. Lorsqu’il est cultivé sur la gélose, bactéries produisent des colonies visqueux, allant de l’incolore à orange vif, jaune ou rose. En revanche, actinomycètes colonies sont calcaires, ferme, coriace et casseront sous pression, où autres colonies bactériennes seront salir. Cela permet aux colonies à se distinguer par le toucher avec une anse stérile.
2. Compter et noter le nombre de colonies bactériennes, y compris les actinomycètes. Ne compter que plaques avec 30-200 colonies par boîte.

5. isolement des Cultures pures

1. Sélectionner l’un des plaques des colonies bactériennes individuelles. Plus de colonies peuvent être sélectionnés, s’il y a un intérêt particulier dans le sol. Utiliser une plaque de grande dilution, car il a tendance à avoir des colonies pures qui sont séparés de bien. Choisissez seulement les colonies qui sont bien séparées des colonies voisines et look morphologiquement distincts les uns des autres.
2. Stériliser la boucle en plongeant dans de l’alcool et il flamber. Rapidement ouvrir la boîte de Pétri d’intérêt et appuyer sur la boucle à un point apparent dans l’agar pour la refroidir. Ensuite, retirer une petite quantité d’une colonie d’intérêt sur la boucle.
3. Prendre une plaque de peptone-levure fraîche, faire une strie de quelques centimètres long sur un côté. Stériliser et refroidir à nouveau, puis faire une rayure qui traverse le streak initial que sur la première passe. Répétez cette procédure deux fois plus de la même manière. Cette « dilution » trainage se traduit par des cellules sur la boucle étant séparés l’un de l’autre. Placer la plaque dans un endroit sombre à incuber à température ambiante pendant deux semaines.

Il est essentiel de déterminer un dénombrement précis des bactéries environnementales pour évaluer la santé d’un écosystème de sol. Cela peut être accompli en cultivant des colonies bactériennes avec des dilutions appropriées.

Les bactéries du sol jouent un rôle important dans un écosystème de sol sain, jouant un rôle dans la décomposition, la fixation de l’azote et le cycle des nutriments. Les sols de surface sont un substrat de particules organiques et inorganiques formant une matrice complexe entourant des pores qui se remplissent d’air ou d’eau. Ces conditions créent un écosystème idéal pour les bactéries, les sols de surface contenant généralement plus d’un million de bactéries par gramme.

En raison de cette forte concentration de bactéries, une dilution est nécessaire avant le placage sur un milieu de croissance. Les dilutions en série peuvent réduire la concentration de l’échantillon de sol d’origine à des niveaux suffisamment bas pour que des colonies individuelles puissent être cultivées sur des plaques de milieu, ce qui permet de calculer le nombre initial de bactéries dans l’échantillon de sol.

Cette vidéo illustre comment préparer des dilutions en série d’échantillons de sol, comment plaquer ces échantillons bactériens et comment calculer le nombre de bactéries dans le sol à partir des plaques de dilution.

Les bactéries sont de simples organismes procaryotes, mais très diversifiés en termes d’espèces et d’écosystèmes. Les actinomycètes sont un sous-ensemble de bactéries qui sont souvent considérées comme un groupe unique en raison de leur structure filamenteuse, où elles se développent enfilées pour former des hyphes.

En règle générale, les actinomycètes représentent 10 % de la population bactérienne totale dans le sol. Les bactéries et les actinomycètes sont abondants dans presque tous les environnements sur Terre, mais on les trouve dans une diversité et une abondance inégalées dans le sol.

Les bactéries du sol sont dénombrées, puis cultivées et identifiées par placage de dilution. Ici, un échantillon de sol est dilué en série dans de l’eau, puis dispersé sur des plaques de croissance de gélose. Les colonies résultantes sont ensuite comptées. Cette valeur, ainsi que le facteur de dilution, est utilisée pour élucider la concentration initiale de bactéries dans le sol.

Le placage de dilution est une méthode courante, peu coûteuse et simple pour le dénombrement des bactéries, mais elle souffre de plusieurs inconvénients. Il ne faut pas laisser le sol se tasser pendant les dilutions, ce qui pourrait entraîner une croissance biaisée. Certaines bactéries du sol ne se développent pas sur les plaques ou se développent trop lentement pour être observées. De plus, cette méthode suppose que les colonies sont formées à partir d’une seule bactérie, mais qu’elles peuvent provenir d’amas de plusieurs cellules.

Certaines espèces bactériennes se développent mieux sur des milieux de croissance différents. Un substrat commun pour la culture d’un large éventail de bactéries est une plaque de levure agar-peptone. Les actinomycètes se développent préférentiellement sur des plaques à base de glycérol-caséine, qui conviennent mieux à la croissance de ces bactéries filamenteuses.

Maintenant que vous comprenez le concept derrière le dénombrement bactérien, voyons comment ce processus est effectué en laboratoire.

Pour commencer la procédure, pesez 10 g d’échantillon de sol et ajoutez-le à 95 ml d’eau désionisée. Secouez bien la suspension et étiquetez-la comme « A ». Avant que le sol ne se dépose, prélever 1 mL de suspension à l’aide d’une pipette stérile et le transférer dans 9 mL d’eau déminéralisée. Vortex à fond et étiqueter comme « B ».

Répétez cette étape de dilution 3 fois, chaque fois avec 1 mL de la suspension précédente et 9 mL d’eau déminéralisée. Étiquetez-les séquentiellement comme les tubes C, D et E. Il en résulte des dilutions en série de 10-1 à 10-5 grammes de sol par ml.

Pour faire croître des colonies bactériennes, prélevez 3 plaques de gélose peptone-levure pré-préparées et étiquetez-les comme C, D et E. Vortex les échantillons correspondants et pipetez 0,1 mL sur chaque plaque. Étant donné que les UFC sont déclarées par ml, l’utilisation de 0,1 mL augmente encore la dilution d’un facteur dix.

Ensuite, trempez un épandeur de verre dans de l’éthanol. Placez l’épandeur dans une flamme pendant quelques secondes pour allumer et brûler l’éthanol. Cela stérilisera l’épandeur.

Tenez l’écarteur au-dessus de la première plaque jusqu’à ce que la flamme s’éteigne. Ouvrez rapidement la plaque en tenant le couvercle à proximité. Touchez l’épandeur à la gélose en l’éloignant de l’inoculum pour qu’il refroidisse, puis étalez la goutte d’inoculum sur la surface jusqu’à ce que les traces de liquide libre disparaissent. Replacez le couvercle de la plaque.

Allumez à nouveau l’épandeur et répétez le processus avec la plaque suivante, en travaillant rapidement afin de ne pas contaminer la plaque avec des organismes en suspension dans l’air. Retournez les plaques pour éviter que les gouttes d’humidité ne tombent sur l’agar-gar et incubez les plaques à température ambiante pendant une semaine.

Pour cultiver des actinomycètes, prenez trois plaques de glycérol-caséine préparées à l’avance et étiquetez-les comme B, C et D. En utilisant les techniques décrites précédemment, étalez la plaque 0,1 mL des suspensions B, C et D. Les dilutions les plus faibles sont utilisées parce que les actinomycètes sont généralement présents à 1/10e de la population bactérienne.

Enfin, retournez ces plaques et conservez-les à température ambiante pendant deux semaines.

Après l’incubation, examinez attentivement toutes les plaques bactériennes et notez les différences de taille et de forme de la colonie. Lorsqu’elles sont cultivées sur de la gélose, les bactéries produisent des colonies visqueuses allant de l’incolore à l’orange vif, au jaune ou au rose. En revanche, les colonies d’actinomycètes sont crayeuses, fermes, coriaces et se brisent sous la pression, là où d’autres colonies bactériennes s’étalent. Cela permet de distinguer les colonies au toucher à l’aide d’une boucle stérile.

Comptez et notez le nombre de colonies bactériennes, y compris les actinomycètes. Ne comptez que les plaques de 30 à 200 colonies par plaque.

Pour cultiver des cultures de bactéries individuelles spécifiques, sélectionnez des colonies discrètes dans l’une des plaques, en choisissant des colonies bien séparées des colonies voisines. Stérilisez une boucle d’étalement, puis ouvrez la plaque et touchez la boucle à un endroit vide pour qu’elle refroidisse. Ensuite, choisissez une petite quantité de la colonie d’intérêt sur la boucle.

En prenant une assiette fraîche de peptone-levure, faites une traînée de quelques centimètres de long sur un côté. Stérilisez et refroidissez à nouveau, puis faites une traînée qui ne croise la traînée initiale qu’au premier passage. Répétez ce processus deux fois de plus de la même manière. Cette « dilution » des stries entraîne la séparation des cellules de la boucle les unes des autres. Placez l’assiette dans un endroit sombre pour l’incuber à température ambiante pendant deux semaines.

À partir du dénombrement des colonies de bactéries et d’actinomycètes, il est possible de déterminer les unités formant des colonies par gramme de sol. Le nombre de colonies par gramme de sol est égal au nombre de colonies comptées sur la plaque, multiplié par l’inverse de la diluation plaquée. Par exemple, si l’on compte 46 colonies sur une plaque de dilution de 10-5 avec un inoculant de 0,1 ml, alors l’UFC par gramme de sol est égale à 10-6 par 46, soit 46 millions d’UFC par gramme de sol.

La réalisation de comptages et de cultures bactériennes est une première étape clé dans de nombreuses recherches ou protocoles scientifiques.

Un sol sain contient entre 106 et 108 bactéries par gramme. Le dénombrement bactérien du sol peut être utilisé pour déterminer la santé des sols d’intérêt, et des dénombrements inférieurs à 106 et 108 bactéries par gramme indiquent un sol malsain ou pauvre. Cela peut être causé par un manque de nutriments ou de matière organique, un stress abiotique dû à un pH extrême du sol ou une contamination du sol.

De nombreux types d’antibiotiques utilisés en médecine aujourd’hui ont été identifiés pour la première fois à partir de bactéries ou de champignons vivant dans le sol. L’isolement de souches pures à partir de cultures de sol peut aider les scientifiques à identifier de nouveaux composés antibiotiques. Ici, des bactéries d’essai ou des composés d’intérêt isolés peuvent être ajoutés aux plaques cultivées avec des pelouses bactériennes, et leurs effets sur la croissance de la pelouse peuvent être enregistrés. Des taches claires dans les pelouses bactériennes où la croissance a été inhibée par la bactérie ou le composé testé peuvent indiquer une activité antibiotique.

Les légumineuses, y compris les pois et les haricots, dépendent de relations symbiotiques avec les bactéries fixatrices d’azote. Ces bactéries vivent librement dans le sol ou dans les nodules du système racinaire et produisent des composés azotés qui sont utilisés par la plante. Dans les sols pauvres, compléter les cultures de légumineuses avec des bactéries fixatrices d’azote cultivées à partir des sols peut stimuler la croissance et la santé des plantes. Cela peut donner des plantes plus grandes et plus résistantes, ce qui donne un meilleur rendement des cultures.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’énumération bactérienne. Vous devriez maintenant comprendre comment effectuer des dilutions d’échantillons de sol, comment dresser des plaques pour le comptage et l’isolement des colonies, et comment calculer le nombre de bactéries dans les échantillons de sol. Merci d’avoir regardé !