Dénombrement des algues via une méthodologie de culture

Algae Enumeration via Culturable Methodology

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Environmental Microbiology

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Algae Enumeration via Culturable Methodology

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09:29 min

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February 23, 2015

Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba – Université de l’Arizona
Auteur mettant en évidence : Bradley Schmitz

Les algues sont un groupe très hétérogène de micro-organismes qui ont un trait commun, à savoir la possession des pigments photosynthétiques. Dans l’environnement, les algues peuvent causer des problèmes pour les propriétaires de piscine de plus en plus dans l’eau. Algues peuvent également causer des problèmes dans les eaux de surface, tels que les lacs et les réservoirs, en raison de la prolifération d’algues qui libèrent les toxines. Plus récemment, algues sont évalués comme nouvelles sources d’énergie par l’intermédiaire de biocarburants algues. Algues bleu – vert sont en fait des bactéries qualifiées de cyanobactéries. Les cyanobactéries non seulement effectuer la photosynthèse, mais ont également la capacité de fixer l’azote gazeux de l’atmosphère. Autres algues sont eucaryotes, allant des organismes unicellulaires à des organismes multicellulaires complexes, comme les algues. Il s’agit de l’algue verte, les euglènes, dinoflagellés, l’algue brune dorée, diatomées, des algues brunes et les algues rouges. Dans les sols, les populations d’algues sont fréquemment 10⁶ par gramme. Ces chiffres sont plus faibles que les chiffres correspondants pour les bactéries, actinomycètes et les champignons, surtout parce que la lumière du soleil nécessaire pour la photosynthèse ne peut pas pénétrer loin sous la surface du sol.

Parce que les algues sont phototrophes, obtention d’énergie de la photosynthèse et carbone de la biomasse de dioxyde de carbone, ils peuvent être cultivés dans des milieux de croissance composée entièrement de nutriments inorganiques et sans un substrat de carbone organique. L’absence de substrat organique s’oppose à la croissance des bactéries hétérotrophes. En utilisant un milieu inorganique, algues initialement présent dans le sol ou l’eau peut être dosée par la méthode le plus probable (NPP) numéro. La méthode du NPP s’appuie sur la dilution successivement un échantillon, tels que les algues se sont dilués à l’extinction. La présence d’algues dans toute dilution est déterminée par un signe positif de la croissance dans le milieu, qui est généralement un vase verte d’algues qui résulte de la photosynthèse. Utilisation de tubes répétées à chaque dilution et une évaluation statistique du nombre de tubes positifs pour la croissance à une dilution donnée permettant à calculer le nombre d’algues présentes dans l’échantillon original. Tableaux NPP ont été mis au point et publié spécifique à une conception particulière du NPP, y compris le nombre de répétitions utilisées à chaque dilution.

Procedure

Peser un échantillon de 10 g de sol qui a été recueillie humide du champ, ou a l’eau ajoutée à elle afin qu’elle reste humide pendant 2-3 jours. Notez que le sol doit être humide mais non saturé.
Préparer une série de dilution de 10 fois en ajoutant le 10 g de sol dans 95 mL d’une Solution de Bristol modifié (Figure 1). Pour créer Solution de Bristol modifié, dissoudre ce qui suit dans 1 000 mL d’eau : 0,25 g NaNO₃, 0,025 g de CaCl₂, 0,075 g MgSO^–₄ · 7H₂O, 0,075 g K₂HPO₄, 0,018 g KH₂PO₄, 0,025 g NaCl et 0,5 mg FeCl_3.
Continuer la série de dilution par l’addition de 1 mL de Suspension A dans 9 mL de Solution de Bristol et de dilution séquentielle supplémentaire.
Inoculer 5 tubes répétées chaque contenant 9 mL de Solution de Bristol modifié avec 1 mL de la dilution 10^-2 à 10^-6(tableau 1).
Incuber les tubes plafonnés pendant 4 semaines dans un endroit exposé aux rayons du soleil.
Observer les tubes pour la croissance des algues une fois tous les 7 jours. Tubes avec la croissance des algues apparaissent vertes.

La figure 1. Comment faire une série de dilution de 10 fois.

Tube	Dilution
B	10^-2
C	10^-3
D	10^-4
E	10^-5
F	10^-6

Le tableau 1. Tubes et dilutions.

Les algues sont des organismes photosynthétiques qui vivent dans des environnements variés. Sol résidence algues peut être cultivée en laboratoire et leur concentration énumérés à l’aide de calculs simples.

Les algues sont un groupe hétérogène d’organismes qui ont un trait commun, à savoir la possession des pigments photosynthétiques, la chlorophylle couramment. La grande majorité des algues est microscopique, toutefois, la définition exacte du groupe est controversée et inclut également les algues, qui sont typiquement macroscopiques.

Dans l’environnement, algues peuvent causer des problèmes dans les eaux de surface telles que les lacs ou réservoirs, formant des proliférations d’algues qui appauvrissent les nutriments de l’eau, bloquant la lumière passant au-delà de la surface de l’eau et libérer des toxines. La possibilité d’énumérer des algues dans les échantillons permet aux scientifiques d’évaluer la santé d’un écosystème et le risque de prolifération des algues.

Populations d’algues dans les sols se produisent fréquemment à environ dix mille cellules par gramme. Ces chiffres sont généralement plus faibles que les concentrations correspondantes des bactéries, des champignons ou des actinomycètes, comme les algues ont besoin du soleil pour la photosynthèse, qui ne peut pas pénétrer loin au-dessous de la surface du sol.

Cette vidéo illustre comment la culture d’algues de sol en laboratoire et comment énumérer la concentration d’algues dans l’échantillon de sol départ.

Les algues ont des effets bénéfiques sur les écosystèmes. Algues bleu – vert ou cyanobactéries, ont la capacité de fixer l’azote gazeux de l’atmosphère, ce qui les rend utiles en augmentant l’azote du sol dans des milieux semi-arides et aussi comme un outil potentiel pour la production de biocarburants.

Autres algues sont eucaryotes et vont de la simple-celled à des organismes multicellulaires complexes, comme les algues. Il s’agit d’algues vertes, euglènes, dinoflagellés et diatomées, algues brunes et algues rouges.

Les algues sont phototrophes, obtention d’énergie de la photosynthèse et carbone de la biomasse du dioxyde de carbone. Ainsi, il peuvent être cultivés dans médias entièrement composé de nutriments inorganiques, sans un substrat de carbone organique ajouté. Ce manque de substrat organique empêche la croissance des bactéries hétérotrophes, qui dépendent de carbone organique externe pour la croissance.

Aux algues de culture pour le dénombrement, sol échantillons sont dilués en série décuplée à 10^-6 g de sol / mL et mis en culture dans des milieux de culture. Plusieurs répliques sont faites pour chaque dilution. Ils sont ensuite incubés dans un endroit bien éclairé pendant 4 semaines afin de permettre la croissance des algues.

La présence d’algues dans toute dilution est déterminée par un signe positif de la croissance dans le milieu, qui apparaît généralement comme un vase verte. Enfin, développés empiriquement tableaux NPP conçu pour la croissance des algues est consultés, permettant à l’utilisateur de déterminer la concentration d’algues originale basée sur la croissance en dilution réplique. La méthode du NPP s’appuie sur les dilutions d’échantillons tels que les algues sont dilués à l’extinction, ce qui signifie qu’à une certaine dilution, aucune croissance de l’algue s’ensuit.

Maintenant que nous sommes familiarisés avec les concepts de croissance et en énumérant les algues des échantillons, examinons un comment cela s’effectue en laboratoire.

Pour commencer l’expérience, premier poids à 10 grammes de terre humide qui a soit été recueillies humide sur le terrain, ou été réhydratées et est resté humide pendant 2 à 3 jours. Le sol doit mais pas saturé.

Ensuite, préparer une série de dilutions dix fois en ajoutant les 10 grammes de sol tout d’abord à 95 mL d’une solution de Bristol modifiés ou MBS. Ce qualifier de suspension A.

Après avoir agité vigoureusement, continuer la série de dilution en ajoutant 1 mL de suspension A dans 9 mL de MBS dans un tube à essai. Continuer cette série de dilution dix fois un autre 4 fois pour donner des dilutions allant jusqu’à 10^-6 g / mL.

Ensuite, inoculer 5 tubes répétés, chaque contenant 9 mL de MBS avec 1 mL de chacun de la dilution 10^-1 à 10^-5. Cela se traduit par 5 tubes de répétitions pour chaque dilution de 10^-2 à 10^-6. Plafonner les tubes sans serrer.

Enfin, incuber les tubes pendant un total de 4 semaines dans un endroit exposé aux rayons du soleil. Observer les tubes pour la croissance des algues une fois tous les 7 jours. Tubes présentant la croissance des algues seront affiche en verts.

La plupart du nombre Probable, ou NPP, l’analyse est une méthode mathématique couramment utilisée pour énumérer les micro-organismes est passées de dilution d’un substrat initial concentré. En prenant en compte les facteurs de dilution des solutions et le nombre d’éprouvettes présentant des signes positifs de la croissance à chaque dilution, le nombre le plus probable d’organismes par gramme d’échantillon de sol original peut être calculé en utilisant une table de NPP et la formule simple.

Pour calculer le NPP, la dilution la plus élevée avec le plus grand nombre de tubes positifs de répliquer est attribuée le label de p1, dans ce cas, la réplique du tube C. En revanche, certains des tubes de D & E sont négatifs avec aucun signe de la croissance des algues.

Le nombre de tubes dans les deux prochains dilutions plus élevées qui montrent une croissance positive est étiqueté comme p2 et p3. Ici, p2 = D et p3 = E.

La valeur de p₁ peut être trouvée en regardant vers le bas de la première colonne de la table de NPP. Le même devrait être fait avec la colonne p₂ . Enfin, la valeur de p₃, dans la partie supérieure, est utilisée pour se croisent les deux définis par p₁ et p₂, pour donner une valeur de nombre le plus probable d’organismes par mL.

Ensuite, pour calculer la concentration d’organismes par gramme dans l’échantillon de sol original, cette valeur est divisée par la concentration des sols dans la dilution à laquelle p₂ a été attribuée. L’équation suivante est utilisée pour définir le nombre réel d’organismes par gramme de sol.

Énumération algue et analyse du NPP ont un large éventail d’applications, dont certaines sont abordés ici.

Cette méthode de culture d’algues énumération peut servir dans une variété de configurations. Il peut être appliqué dans des rivières ou des lacs pour déterminer les niveaux d’algues et évaluer les risques d’efflorescences algales nuisibles. Alternativement, il peut être utilisé pour évaluer la propreté et la sécurité des eaux plus directement utilisé par les humains, y compris les piscines, fontaines d’eau ou d’autres sources d’eau potable. Idéalement, dans les piscines et les échantillons d’eau potable, il n’y a aucune algues présentes.

L’analyse de NPP pour dénombrement peut également être appliquée à d’autres microorganismes non-algues. Par exemple, la qualité de l’eau peut être évaluée à l’aide de micro-organismes indicateurs tels que les coliformes fécaux ou e. coli. Ici, les échantillons peuvent être cultivées avec un milieu contenant des produits chimiques qui sont modifiés pour produire la couleur ou la fluorescence en présence des organismes indicateurs. En effectuant plusieurs petites répliques de cette expérience dans des cellules individuelles, avec des échantillons diluées à une concentration connue, le rapport des cellules positives peut être référencé dans une table de NPP pour l’organisme indicateur spécifique et la concentration initiale dans les échantillons déterminé.

Algues peuvent aussi être cultivées pour les applications commerciales. Par exemple, certains types d’engrais biologiques utilisent des algues bleu – vert, qui peuvent agir comme des symbiotes de plantes, facilitant leur luminaire et l’absorption de l’azote, qui est particulièrement utile pour aider à la croissance des cultures dans les zones avec des sols pauvres. De même, les algues peuvent être cultivés pour les biocarburants, ou comme source d’aliments riches en éléments nutritifs pour le bétail.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE culture algale et énumération. Vous devez maintenant comprendre comment diluer les échantillons de sol pour la croissance des algues, comment la culture d’algues dans le laboratoire et comment énumérer la concentration d’algues de vos échantillons de départ. Merci de regarder !

Results

La figure 2 est un exemple des résultats représentatifs.

p ₁ est choisie pour être le nombre de tubes répétées de la dilution la plus élevée (moins concentrées dans le sol) qui a le plus grand nombre de tubes positifs. Ici, la réplique du Tube B ne compte pas, parce que ceux du Tube C proviennent d’une dilution plus élevée. En revanche, le nombre de tubes de Tube D qui montrent un signe positif de croissance est inférieur à celui du Tube C. Oui, p₁ = 5.

p ₂ et p₃ sont choisis pour représenter le nombre de tubes dans les deux prochains dilutions plus élevées qui montrent un signe positif de la croissance. Ainsi, p₂ = 3 et p₃ = 1.

La valeur de p₁ peut être trouvée en regardant vers le bas de la première colonne du tableau 2. La même chose est fait dans la colonne de₂ p. Ensuite, la valeur de p₃ (en haut) croise les deux définis par les valeurs de p₁ et p₂. Dans cet exemple, la valeur est de 1,1 organismes par mL.

Diviser cette valeur par la concentration des sols dans la dilution auquel vous avez attribué p₂. Dans cet exemple, c’est le Tube D.

Ainsi, dans cet exemple, il y a 1,1 x 10⁴ cellules d’algues par g de sol. Cette valeur est assez typique du nombre d’algues rencontrées dans le sol.

Figure 2. Résultat hypothétique d’une expérience d’énumération algues. Tubes ombrées indiquent la présence d’algues. Tubes non ombrées représentent l’absence d’algues.

		Nombre le plus probable pour les valeurs indiquées p ₃
P1	P2	0	1	2	3	4	5
0 0 0 0 0 0	0 1 2 3 4 5	— 0,018 0,037 0,056 0,075 0,094	0,018 0,036 0,055 0,074 0,094 0,11	0,036 0,055 0,074 0,093 0,11 0,13	0,054 0,073 0,092 0,11 0,13 0,15	0,072 0.091 0,11 0,13 0,15 0,17	0,090 0,11 0,13 0,15 0,17 0,19
1 1 1 1 1 1	0 1 2 3 4 5	0,020 0,040 0,061 0,083 0,11 0,13	0,040 0,061 0,082 0,1 0,13 0,16	0,060 0,081 0,10 0,13 0,15 0,17	0,080 0,10 0,12 0,15 0,17 0,19	0,10 0,12 0,15 0,17 0,19 0,22	0,12 0,14 0,17 0,19 0,22 0,24
2 2 2 2 2 2	0 1 2 3 4 5	0,045 0,068 0,093 0,12 0,15 0,17	0,068 0,092 0,12 0,14 0,17 0.20	0.091 0,12 0,14 0,17 0.20 0,23	0,12 0,14 0,17 0.20 0,23 0,26	0,14 0,17 0,19 0,22 0.25 0,29	0,16 0,19 0,22 0.25 0,28 0,32
3 3 3 3 3 3	0 1 2 3 4 5	0,078 0,11 0,14 0,17 0,21 0.25	0,11 0,14 0,17 0,21 0,24 0,29	0,13 0,17 0.20 0,24 0,28 0,32	0,16 0.20 0,24 0,28 0,32 0,37	0.20 0,23 0,27 0,31 0,36 0,41	0,23 0,27 0,31 0,35 0.40 0,45
4 4 4 4 4 4	0 1 2 3 4 5	0,13 0,17 0,22 0,34 0,41	0,17 0,21 0,26 0,33 0.40 0,48	0,21 0,26 0,32 0,39 0,47 0,56	0.25 0,31 0,38 0,45 0,54 0,64	0.30 0,36 0,44 0,52 0,62 0,72	0,36 0,42 0,5 0,59 0,69 0,81
5 5 5 5 5 5	0 1 2 3 4 5	0,23 0,33 0,49 0,79 1.3 2.4	0,31 0,46 0,7 1.1 1.7 3.5	0,43 0,64 0,95 1.4 2.2 5.4	0,58 0,84 1.2 1.8 2.8 9.2	0,76 1.1 1.5 2.1 3.5 16	0,95 1.3 1.8 2.5 4.3 —

Le tableau 2. Nombres les plus probables pour une utilisation avec le protocole expérimental dans cet exercice.

Applications and Summary

La méthode NPP est utile, car elle permet d’estimer une population fonctionnelle basée sur une attribution liées au processus. Dans l’exemple, le processus fonctionnel a été entreprise par les algues, ce qui a permis à la croissance en l’absence du carbone organique de la photosynthèse. Cela a permis à des populations d’algues totales dans le sol soit énumérée.

NPP est également utilisé pour estimer le nombre d’un type particulier d’agents microbiens pathogènes dans l’eau, telles que les salmonelles, utilisant la résistance de Salmonella au vert de malachite.

Une autre application est l’estimation des champignons mycorhiziens en inoculant des dilutions de sol sur une plante hôte et à la recherche de la colonisation des racines par les champignons.

Transcript

Algae are photosynthetic organisms that live in a variety of environments. Soil dwelling algae can be cultured in the laboratory, and their concentration enumerated using simple calculations.

Algae are a highly heterogeneous group of organisms that have one common trait, namely the possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. The vast majority of algae are microscopic, however, the exact definition of the group is controversial, and also includes seaweeds, which are typically macroscopic.

In the environment, algae can cause problems in surface waters such as lakes or reservoirs, forming algal blooms that deplete the water nutrients, blocking light passing beyond the water surface, and releasing toxins. The ability to enumerate algae in samples allows scientists to evaluate the health of an ecosystem, and the potential risk of algal overgrowth.

Algal populations in soils frequently occur at around ten thousand cells per gram. These numbers are typically lower than corresponding concentrations of bacteria, fungi, or actinomycetes, as algae require sunlight for photosynthesis, which cannot penetrate far below the soil surface.

This video will illustrate how to culture algae from soil in the laboratory, and how to enumerate the concentration of algae in the starting soil sample.

Algae have beneficial effects on ecosystems. Blue-green algae, or cyanobacteria, have the ability to fix nitrogen gas from the atmosphere, making them useful in increasing soil nitrogen in semi-arid environments and also as a potential tool for biofuel production.

Other algae are eukaryotic, and range from single-celled to complex multicellular organisms, like seaweeds. These include green algae, euglenoids, dinoflagellates and diatoms, brown algae, and red algae.

Algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon for biomass from carbon dioxide. As a result, they can be grown in media consisting entirely of inorganic nutrients, without an added organic carbon substrate. This lack of organic substrate prevents the growth of heterotrophic bacteria, which are dependent on external organic carbon for growth.

To culture algae for enumeration, soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL, and cultured in growth media. Several replicates are made for each dilution. They are then incubated in a well-lit area for up to 4 weeks to allow algal growth.

The presence of algae in any dilution is determined by a positive sign of growth in the medium, which will typically appear as a green slime. Finally, empirically developed MPN tables designed for algal growth are consulted, enabling the user to determine the original algal concentration based on growth in dilution replicates. The MPN method relies on the serial dilution of samples such that the algae are diluted to extinction, meaning that at some dilution, no algal growth ensues.

Now that we are familiar with the concepts behind growing and enumerating algae from samples, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.

To begin the experiment, first weight out 10 grams of moist soil that has either been collected moist from the field, or been rehydrated and remained moist for 2 to 3 days. The soil should but not saturated.

Next, prepare a ten-fold dilution series by adding the 10 grams of soil first to 95 mL of Modified Bristol’s solution, or MBS. Label this as suspension A.

After shaking vigorously, continue the dilution series by adding 1 mL of suspension A to 9 mL of MBS in a test tube. Continue this ten-fold dilution series another 4 times to give dilutions up to 10-6 g per mL.

Next, inoculate 5 replicate tubes, each containing 9 mL of MBS with 1 mL of each of the dilutions 10-1 to 10-5. This results in 5 replicates tubes for each dilution from 10-2 to 10-6. Cap the tubes loosely.

Finally, incubate the tubes for a full 4 weeks in an area exposed to sunlight. Observe the tubes for algal growth once every 7 days. Tubes exhibiting algal growth will appear green.

Most Probable Number, or MPN, analysis is a commonly used mathematical method to enumerate microorganisms grown from dilution of a concentrated initial substrate. By taking into account the dilution factors of the solutions, and the number of tubes which show positive signs of growth at each dilution, the most probable number of organisms per gram of original soil sample can be calculated using an MPN table and simple formula.

To calculate MPN, the highest dilution with the highest number of positive replicate tubes is assigned the label of p1, in this case, the replicates of tube C. In contrast, some of the tubes from D & E are negative with no signs of algal growth.

The number of tubes in the next two higher dilutions that show positive growth are labeled as p2 and p3. Here, p2 = D and p3 = E.

The value for p1 can be found by looking down the first column in the MPN table. The same should be done with the p2 column. Finally, the value of p3, across the top, is used to intersect the two defined by p1 and p2, to give a value of the most probable number of organisms per mL.

Next, to calculate the concentration of organisms per gram in the original soil sample, this value is divided by the concentration of soil in the dilution to which p2 was assigned. The following equation is used to define the actual number of organisms per gram of soil.

Algal enumeration and MPN analysis have a wide range of applications, some of which are explored here.

This culturing method of algal enumeration can be used in a variety of settings. It can be applied to rivers or lakes to determine algal levels, and assess the risks of harmful algal blooms. Alternatively, it can be used to assess the cleanliness and safety of waters more directly used by humans, including swimming pools, water fountains, or other drinking water sources. Ideally, in potable water samples and swimming pools, there are no algae present.

The MPN analysis for enumeration can also be applied to other non-algal microorganisms. For example, water quality can be assessed using indicator organisms such as coliforms or E. coli. Here, samples can be cultured with media containing chemicals that are altered to produce color or fluorescence in the presence of the indicator organisms. By performing multiple small replicates of this experiment in individual cells, with samples diluted to a known concentration, the ratio of positive cells can be referenced to an MPN table for the specific indicator organism, and the starting concentration in the samples determined.

Algae may also be cultured for commercial applications. For example, some types of biofertilizer utilize blue-green algae, which can act as symbionts with plants, aiding their fixture and take-up of nitrogen, which is particularly useful in aiding crop growth in areas with poor soil. Similarly, algae can be grown for biofuels, or as a source of nutrient rich food for livestock.

You’ve just watched JoVE’s introduction to algal culture and enumeration. You should now understand how to dilute soil samples for algal growth, how to culture algae in the laboratory, and how to enumerate the algal concentration of your starting samples. Thanks for watching!

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