2.12: Préparation de cristaux pour analyse par diffraction des rayons X

1. préparation du Tube cristal et filtre

1. Placer un tube de NMR dans un erlenmeyer.
2. Préparer un filtre de la pipette.
   1. Construire le filtre en plaçant un morceau de chiffon non pelucheux (1 po par 1 po) à la pipette, puis utilisez une tige pour coincer fermement la lingette dans la partie du goulot d’étranglement de la pipette (Figure 1).
   2. Faire deux filtres de pipette pour chaque tube cristal nécessaire.

2. ajouter l’échantillon dans le Tube de cristal

1. Dissoudre le composé (tétraphénylporphyrine, 10 mg) à 0,75 mL de solvant (dichlorométhane).
2. Avec une pipette, ajouter doucement le mélange vers le haut du tube, en le faisant passer à travers le filtre.
   1. Les particules sont filtrées pour éviter la création de sites de nucléation, qui peut conduire à petits cristaux multiples plutôt que les plus gros monocristaux désirées.
3. Une fois que l’échantillon a été placé dans le tube de cristal, très lentement et doucement, ajouter du anti-solvant (1,5 mL de méthanol) dans le tube à travers une nouvelle pipette de filtre. Laisser le anti-solvant couche lentement sur la solution précédemment ajoutée (Figure 2). Ne pas utiliser une ampoule pour pousser le solvant grâce à la pipette, plutôt laisser le solvant s’écouler à travers le filtre de lui-même.
   1. Vous assurer que le solvant de densité plus élevée est ajouté au tube cristal tout d’abord.
   2. Vérifiez que les deux solvants sont miscibles entre eux. Cela se fait avant l’addition du solvant.
4. Fermer le tube avec un bouchon de NMR.

3. croissance des cristaux

1. Sans causer les deux solvants mélanger, placer les tubes de cristal dans une armoire où ils ne seront pas perturbés.
2. Temps de cristallisation varie avec chaque composé - généralement le cristal tubes devraient être laissées intactes pendant une semaine.
3. Après une semaine, inspecter les tubes pour la croissance des cristaux.
   1. Croissance des cristaux se produit généralement à l’interface des deux solvants.
   2. Inspecter visuellement les tubes des preuves de la croissance des cristaux. Veillez à ne pas faciliter le mélange des solvants, dans le cas où le composé nécessite un délai supplémentaire pour la formation de cristaux.
   3. S’il apparaît que la croissance des cristaux s’est produite, outre inspecter les tubes à l’aide d’un microscope.

4. Crystal sélection

1. Diffraction des rayons x de cristaux doit avoir bien définies visages.
2. Les cristaux qui ont regroupés doivent être évitées si possible.
3. Laisser les cristaux dans le tube de cristal jusqu’au moment de récolter le cristal, immédiatement avant de placer le cristal sur le diffractomètre.
   1. Garder les cristaux dans le tube veillera à ce que les cristaux restent solvatés. La solvatation peut causer les cristaux à craquer et entraver la diffraction du cristal.

Figure 1. Une image du filtre pipette. Un petit morceau de pelucheux a été fermement coincé dans le goulot d’étranglement de la pipette. Les solutions sont passées bien que ces filtres pipette avant est introduit dans le tube de cristal.

La figure 2. Une fois la solution contenant le composé est placée dans le tube de cristal, le anti-solvant est lentement posé sur le dessus en le faisant passer à travers un nouveau filtre de pipette.

Un seul cristal est nécessaire pour la détermination de sa structure. La qualité du cristal influence fortement la qualité et la précision de la détermination structurelle.

Un monocristal est un solide dans lequel l’arrangement des molécules se répète dans les trois dimensions. La disposition spatiale des atomes à l’intérieur du solide cristallin peut être déterminée à l’aide de la cristallographie aux rayons X. Dans cette technique, un échantillon cristallin pur est enveloppé d’un faisceau de rayons X. Le cristal diffracte les rayons X selon un motif distinctif lié à la structure et à la composition moléculaire des cristaux. Si un cristal se forme trop rapidement, les molécules peuvent être désordonnées, des impuretés peuvent être incorporées dans le cristal ou deux cristaux fusionnés ou plus peuvent se former à la place d’un seul cristal. Par conséquent, des méthodes spécialisées mettant l’accent sur la croissance lente sont nécessaires pour produire des cristaux de qualité suffisante pour la cristallographie aux rayons X.

Cette vidéo illustrera les caractéristiques souhaitées des cristaux de qualité rayons X, démontrera une procédure de leur croissance et présentera quelques applications de cette technique en chimie.

Les électrons diffusent les rayons X en émettant une onde sphérique de rayons X lorsqu’ils sont touchés. Si les atomes sont disposés de manière ordonnée, l’interférence constructive entre les ondes produit un motif de diffraction caractéristique sur un détecteur de rayons X. Le cristal est tourné à l’intérieur du faisceau pour collecter des motifs de diffraction sous plusieurs angles. Avec des modèles de diffraction suffisants, la structure moléculaire peut être dérivée.

Les cristaux de qualité rayons X forment généralement des formes symétriques et ont des faces lisses et réfléchissantes pour la lumière. Lorsqu’ils sont observés sous un microscope polarisant, ils seront transparents, mais la plupart devraient devenir sombres lorsqu’ils sont tournés de 90 °. Cela indique une structure très ordonnée. Pour faire croître ces cristaux, la diffusion liquide-liquide est souvent utilisée. Il utilise deux solvants miscibles : un solvant de faible densité, ou précipitant, dans lequel le composé à recristalliser est insoluble ; et un solvant à haute densité dans lequel le composé est soluble. En règle générale, le rapport volumétrique entre le précipitant et le solvant est de 2:1.

Le précipitant de faible densité est superposé à une solution concentrée du composé dans le solvant de haute densité. Au fil du temps, le composé devient moins soluble à mesure que le précipitant se mélange à la solution. Une interface de solvant plus petite entraîne un taux de diffusion plus lent, ce qui donne des cristaux plus gros et plus purs. Maintenant que vous comprenez les principes de la culture de cristaux de qualité rayons X, passons en revue une procédure de leur culture par diffusion liquide-liquide.

Pour commencer, procurez-vous l’équipement nécessaire qui se trouve dans le protocole texte. Acquérir un solvant pour le composé et un précipitant moins dense.

Pour préparer un filtre de pipette, placez un petit morceau de Kimwipe dans le haut d’une pipette en verre et appuyez doucement sur le papier jusqu’au bas du corps de la pipette à l’aide d’une tige ou de la tige d’une autre pipette, en faisant attention de ne pas percer le papier. Préparez deux filtres de pipette. Placez-en un dans le tube RMN. Si nécessaire, fixez l’ensemble à l’aide d’une pince de laboratoire et d’un support à anneau. Dissoudre environ 10 mg du composé à recristalliser dans 0,75 mL de solvant.

Maintenant, ajoutez soigneusement la solution d’échantillon dans le filtre à pipette. Fixez une poire sur le dessus et pressez lentement pour faire passer la solution dans le tube RMN afin d’éliminer les impuretés solides. Ne laissez pas l’ampoule se dilater à nouveau lorsqu’elle est fixée, car l’aspiration délogera le papier filtre.

Ensuite, retirez le filtre de pipette usagé et placez le deuxième filtre dans le tube RMN. Pipeter environ 1,5 mL de précipitant dans le tube. Laissez le solvant passer à travers le filtre par gravité. Désormais, veillez à ne pas déranger le filtre lors d’éventuelles manipulations. Une fois que tout le précipitant a filtré dans le tube, retirez le filtre et fermez le tube. Placez-le dans une armoire ou un autre endroit facile à vérifier où il ne sera pas agité.

Après au moins une journée, inspectez les tubes pour la croissance des cristaux. S’il n’y a pas de cristaux ou si les cristaux sont très petits, laissez le tube d’échantillon intact. Si des cristaux sont visibles, vérifiez leur taille et leur forme sans perturber les couches de solvant.

Si les cristaux sont grands, bien définis et ne sont pas regroupés, inspectez-les au microscope pour vérifier leur potentiel de qualité rayons X. Ne retirez pas les cristaux du tube avant que le diffractomètre ne soit prêt à commencer le balayage. Si des molécules de solvant sont incorporées dans la structure cristalline, laisser le cristal sécher dégradera le cristal. À l’aide de la cristallographie aux rayons X, la structure moléculaire de ces cristaux rouge-violet foncé a été vérifiée comme étant celle de la tétraphénylporphyrine.

La cristallographie aux rayons X est un outil analytique essentiel en chimie et en biochimie.

Les méthodes de recristallisation comprennent le chauffage et le refroidissement, la diffusion liquide-liquide, la diffusion de vapeur et l’évaporation lente. Dans l’évaporation lente d’un système à solvant unique, le composé est dissous dans une petite quantité de solvant et placé dans un récipient avec un petit trou dans le bouchon. Au fur et à mesure que le solvant s’évapore, la concentration augmente jusqu’à ce que le composé commence à cristalliser.

La fonctionnalité des protéines est souvent liée à leur structure. Cependant, les protéines peuvent être très difficiles à cristalliser. Des techniques spécialisées doivent être développées pour faire pousser des cristaux de protéines de qualité rayons X. Ici, une goutte de solution protéique est mélangée à une goutte de précipitant et ce mélange est scellé dans une chambre avec un précipitant pur. Au fur et à mesure que la vapeur de solvant se diffuse hors de la goutte, la solubilité de la protéine dans la goutte diminue et la protéine cristallise lentement. Une autre technique consiste à mélanger la solution protéique et le précipitant sous de l’huile minérale. À l’aide de ces techniques, une variété de protéines peut être cristallisée pour l’analyse.

Dans la diffraction de poudre, chaque orientation spatiale possible est représentée simultanément dans l’échantillon. La diffraction des poudres n’est pas aussi informative sur la structure que la diffraction des rayons X sur monocristal en raison de la perte de données de structure tridimensionnelle. Au lieu de cela, la diffraction des poudres excelle dans l’analyse des mélanges de solides cristallins et l’évaluation de la cristallinité des structures amorphes.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la croissance des cristaux pour la cristallographie aux rayons X. Vous devriez maintenant être familiarisé avec les propriétés des cristaux de qualité rayons X, une procédure pour les cultiver et quelques applications de cette technique en chimie.

Merci d’avoir regardé !