2.6: Extraction d'ADN communautaire à partir de colonies bactériennes

1. Extraction d’ADN bacterial Community

1. Pour commencer la procédure, peser 100 g de sol tamisé. Ajouter ceci à un navire en polypropylène et ajouter 100 mL de tampon d’extraction, composée de tampon Tris modifié avec EDTA pour promouvoir la sortie de bactéries provenant de la matrice du sol, puis serrer à la main.
2. Ensuite, peser 100 g de perles de verre et les ajouter à la cuve de mélange. Agiter l’échantillon pendant 5 min avec un filet battant périphérique ou agitateur oscillant mécanique pour 15 min. Ajouter 10 mL 20 % sodium dodécyl sulfate ou SDS, pour le mélange, puis agiter pendant une minute supplémentaire. Incuber à une température élevée de 60-65 ° C pendant 60 min.
3. Tout aussi distribuer l’échantillon entre les tubes de 50 mL distincts et centrifugation pendant 10 min à 6 000 x g. transférer le surnageant des tubes dans un seul récipient stérile. Ensuite, répéter l’extraction sur le culot de sol comme décrit précédemment, en utilisant un volume frais de tampon d’extraction.
4. Ensuite, ajoutez le volume total de liquide surnageant transformé, environ 200 mL, un tube propre 50 mL rempli à la moitié du volume d’une solution de chlorure de sodium de polyéthylène glycol et 1,6 M de 30 %. Inverser les bouteilles plusieurs fois à la main pour bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 2 h. échantillons de centrifugation à 10 000 x g pendant 20 min à l’ADN de granule.
5. Retirez soigneusement le surnageant du tube à centrifuger, laissant derrière lui le culot d’acide nucléique partiellement purifiée. Ajouter 20 mL de tampon TE et 1,5 mL d’une solution d’acétate de potassium 7,5 M à Resuspendre le culot, puis vortexer. Placez la suspension sur la glace pendant 5 min. Centrifuger à 16 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, précipitation des protéines et des polysaccharides.
6. Ensuite, ajouter une RNAse et la protéinase K dans l’échantillon, mélanger doucement à la main et laisser reposer pour le moment. Ajouter un volume équivalent de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (mélange de ratio de 25:24:1) à la suspension à extraire et mélanger délicatement à la main. Centrifuger la préparation pendant 10 min à 13 000 x g. Retirer soigneusement le récipient de la centrifugeuse et note les deux couches.
7. Au fond, une couche plus lourd est composé de l’alcool de phénol : chloroforme : isoamylique et extraites des débris et la couche supérieure est l’humeur aqueuse et contient de l’ADN. Placez la phase aqueuse dans un récipient stérile, ajouter un volume équivalent d’isopropanol et inverser doucement pour ouvrir la précipitation de l’ADN. Incuber la suspension à température ambiante pendant 2 h. Pellet l’ADN purifié par centrifugation à 16 000 x g pendant 30 min. Retirer délicatement le surnageant l’ADN granulé peut ou pas être visible au fond du bateau, et puis remettre en suspension dans 1 mL de tampon TE.
8. À l’aide d’un spectrophotomètre ou un fluorimètre de quantification de l’ADN/ARN, mesurer le niveau de l’ADN extrait de l’échantillon. La quantité d’ADN est estimée à partir de la lecture nm 260. Une lecture d’absorbance de 1.0 équivaut à 50 µg d’ADN par mL de solution. Si la concentration est trop élevée pour une lecture précise, diluer la suspension de 1 à 10, ou 1 à 100 à l’aide de l’eau de qualité moléculaire.
9. La pureté de l’ADN est estimée par le rapport entre la lecture à 260 nm à celle à 280 nm. Une valeur > 1.7 indique ADN relativement pur. La valeur maximale théorique est 2.0.

L’extraction de l’ADN d’une communauté bactérienne est un processus par lequel l’ADN est obtenu à partir de plusieurs espèces bactériennes au sein d’une communauté au cours d’une seule procédure d’extraction.

Les analyses traditionnelles des communautés microbiennes dans le sol ont généralement impliqué des tests culturels, utilisant des méthodes de dilution et de placage sur différents milieux sélectifs. Cependant, de nombreuses bactéries se développent mal dans des conditions de laboratoire ou dans les conditions spécifiques du milieu de croissance sélectionné, ce qui signifie qu’elles peuvent passer inaperçus ou être gravement sous-représentées.

Récemment, l’extraction de l’ADN d’une communauté à partir d’échantillons bactériens du sol a permis d’obtenir un échantillonnage plus complet des communautés bactériennes. On pense que cette approche non fondée sur la culture est plus représentative des communautés réelles présentes que les méthodes traditionnelles fondées sur la culture.

Cette vidéo présente une méthode d’extraction de l’ADN d’une communauté bactérienne sans culture, comment vérifier la qualité et la quantité d’ADN extrait, et explore comment cet ADN peut être utilisé pour étudier la diversité bactérienne.

L’extraction de l’ADN du sol peut être effectuée de deux manières. Dans la méthode de fractionnement, les cellules sont d’abord séparées de la matrice du sol avant l’extraction du matériel génétique. L’échantillon est ensuite soumis à des cycles successifs de mélange et de centrifugation lente afin de recueillir des cellules intactes dans une pastille.

Des lysozymes sont ensuite ajoutés aux cellules et la suspension est incubée. Les lysozymes sont des enzymes qui décomposent les parois cellulaires bactériennes. Une fois que la structure de la paroi cellulaire a été compromise, l’ADN peut alors être libéré pour la purification. Cependant, il a été démontré qu’une deuxième méthode d’extraction de l’ADN communautaire, la méthode in situ, permet une plus grande concentration d’ADN.

Ici, une masse de terre est combinée avec un volume équivalent de tampon d’extraction Tris-EDTA et de billes de verre, et mélangée de manière agressive pour faciliter la séparation des cellules des particules de sol. Un détergent est ensuite ajouté, généralement du dodécylsulfate de sodium, ou SDS, et l’échantillon est ensuite mélangé pour favoriser la lyse des cellules et la libération de leur contenu, y compris l’ADN.

L’incubation à haute température est ensuite entreprise pour lyser les cellules bactériennes restantes. Les échantillons sont centrifugés, puis une extraction et une incubation de polyéthylène glycol sont effectuées sur le surnageant afin de précipiter l’ADN, qui est ensuite centrifugé en une pastille.

L’ADN est remis en suspension dans du tampon TE et de l’acétate de potassium afin de laver davantage l’ADN des protéines et des polysaccharides, puis une centrifugation est effectuée pour granuler ces composants indésirables. Le surnageant aqueux contenant l’ADN est éliminé et soumis à une extraction au phénol-chloroforme et à une précipitation à l’isopropanol pour nettoyer et concentrer davantage l’ADN. Après une période d’incubation à température ambiante de deux heures, l’ADN est centrifugé et remis en suspension dans TE Buffer pour être stocké jusqu’à l’analyse.

Maintenant que nous sommes familiarisés avec les concepts et les processus qui sous-tendent l’extraction de l’ADN d’une communauté bactérienne, voyons comment elle est réalisée en laboratoire.

Pour commencer la procédure, pesez 100 g de terre tamisée. Ajoutez-le dans un récipient en polypropylène et ajoutez 100 ml de tampon d’extraction composé d’un tampon Tris amendé à l’EDTA pour favoriser la libération des bactéries de la matrice du sol, puis secouez à la main.

Ensuite, pesez 100 g de billes de verre et ajoutez-les dans le récipient de mélange. Agitez l’échantillon pendant 5 minutes à l’aide d’un appareil de battage de billes ou d’un agitateur mécanique au poignet. Ajoutez 10 ml de dodécylsulfate de sodium à 20 %, ou SDS, au mélange, puis agitez pendant une minute supplémentaire. Incuber à haute température pendant 60 min.

Répartir uniformément l’échantillon dans des tubes séparés de 50 mL et centrifuger pendant 10 min ?à 6 000 x g. Transférez le surnageant des tubes dans un seul récipient stérile. Ensuite, répétez l’extraction sur la pastille de sol comme décrit précédemment, en utilisant un nouveau volume de tampon d’extraction.

Ensuite, ajoutez le volume total de surnageant traité dans un tube propre de 50 mL rempli à moitié de volume avec une solution de polyéthylène glycol à 30 % et de chlorure de sodium à 1,6 M. Retournez les bouteilles plusieurs fois à la main pour mélanger, et incubez à température ambiante pendant 2 h. Centrifuger des échantillons à 10 000 x g pendant 20 min pour granuler l’ADN.

Retirez soigneusement le surnageant du tube à centrifuger, en laissant derrière lui la pastille d’acide nucléique partiellement purifiée. Ajouter 20 mL de tampon TE et 1,5 mL d’une solution d’acétate de potassium de 7,5 M pour remettre la pastille en suspension, puis vortex. Placez la suspension sur de la glace pendant 5 min. Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 30 min à 4 ? C pour précipiter les protéines et les polysaccharides.

Ensuite, ajoutez une ARNase et une protéinase K à l’échantillon, mélangez doucement à la main et laissez reposer un instant. Ajouter un volume équivalent d’alcool phénol :chloroforme :isoamylique à la suspension à extraire, et mélanger délicatement à la main. Centrifuger la préparation pendant 10 min à 13 000 x g. Retirez délicatement le récipient de la centrifugeuse et notez les deux couches.

La couche inférieure, plus lourde, est composée de phénol :chloroforme :alcool isoamylique et de débris extraits, et la couche supérieure est aqueuse et contient l’ADN. Placez la phase aqueuse dans un récipient stérile, ajoutez un volume équivalent d’isopropanol et retournez doucement pour initier la précipitation de l’ADN. Incuber la suspension à température ambiante pendant 2 h. Granulez l’ADN purifié par centrifugation à 16 000 x g pendant 30 min. Retirer soigneusement le surnageant, car l’ADN granulé peut être visible ou non au fond du récipient, puis le remettre en suspension dans 1 mL de tampon TE.

À l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un fluorimètre de quantification de l’ADN/ARN, mesurez le niveau d’ADN extrait de l’échantillon. Les fluorimètres d’ADN/ARN produiront des niveaux d’ADN en nanogrammes par millilitre. Si la concentration est trop élevée pour des lectures précises, diluez la suspension de 1 à 10, ou de 1 à 100 avec de l’eau de qualité moléculaire.

Une fois que l’ADN est obtenu à partir d’une communauté bactérienne, il peut être utilisé de différentes manières. Certaines de ces applications sont explorées ici.

Les analyses spectrophotographiques de l’ADN extrait de l’ADN de la communauté peuvent donner un aperçu du nombre de cellules bactériennes présentes dans un échantillon de sol donné. La quantité estimée d’ADN en ng par mL de solution peut être reliée au volume total d’ADN extrait en solution, pour obtenir la quantité totale d’ADN par g de sol. Connaissant la valeur théorique de l’ADN par cellule, le nombre total de cellules par g de sol peut être calculé.

Pour des applications plus ciblées, l’ADN extrait des communautés bactériennes peut être soumis à la PCR pour déterminer si une espèce particulière est présente au sein de la communauté. Par exemple, les scientifiques voudront peut-être déterminer si les échantillons de sol contiennent des agents pathogènes spécifiques, tels que Clostridium perfringens ou Bacillus anthracis.

Enfin, pour obtenir une compréhension plus complète des bactéries présentes dans une communauté, les échantillons d’ADN peuvent être soumis à une caractérisation « omique » et bioinformatique qui permet une analyse plus approfondie des bactéries d’origine dans l’échantillon. ? Omiques ? Décrit une gamme de technologies qui explorent les rôles, les relations et les actions des molécules dans les organismes ou les communautés. Cela inclut l’étude des gènes et de leur fonction, ou ? Génomique ?, et ? la protéomique ?, l’étude des protéines et de leurs rôles. ? Par exemple, le séquençage de 16S ? L’ARN des échantillons peut permettre une détermination métagénomique d’espèces spécifiques au sein de la communauté, donnant une estimation plus détaillée de la diversité. Cette approche peut donner aux scientifiques une meilleure compréhension de la composition des espèces d’une communauté et des rôles qu’elles peuvent jouer.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’extraction de l’ADN des communautés bactériennes. Vous devriez maintenant comprendre comment extraire l’ADN d’une communauté bactérienne, comment vérifier la qualité de cet ADN et comment cet ADN peut être utilisé pour des études de la composition de la communauté bactérienne. Merci d’avoir regardé !