Extraction d'ADN communautaire à partir de colonies bactériennes

1. Extraction d’ADN bacterial Community

1. Pour commencer la procédure, peser 100 g de sol tamisé. Ajouter ceci à un navire en polypropylène et ajouter 100 mL de tampon d’extraction, composée de tampon Tris modifié avec EDTA pour promouvoir la sortie de bactéries provenant de la matrice du sol, puis serrer à la main.
2. Ensuite, peser 100 g de perles de verre et les ajouter à la cuve de mélange. Agiter l’échantillon pendant 5 min avec un filet battant périphérique ou agitateur oscillant mécanique pour 15 min. Ajouter 10 mL 20 % sodium dodécyl sulfate ou SDS, pour le mélange, puis agiter pendant une minute supplémentaire. Incuber à une température élevée de 60-65 ° C pendant 60 min.
3. Tout aussi distribuer l’échantillon entre les tubes de 50 mL distincts et centrifugation pendant 10 min à 6 000 x g. transférer le surnageant des tubes dans un seul récipient stérile. Ensuite, répéter l’extraction sur le culot de sol comme décrit précédemment, en utilisant un volume frais de tampon d’extraction.
4. Ensuite, ajoutez le volume total de liquide surnageant transformé, environ 200 mL, un tube propre 50 mL rempli à la moitié du volume d’une solution de chlorure de sodium de polyéthylène glycol et 1,6 M de 30 %. Inverser les bouteilles plusieurs fois à la main pour bien mélanger et laisser incuber à température ambiante pendant 2 h. échantillons de centrifugation à 10 000 x g pendant 20 min à l’ADN de granule.
5. Retirez soigneusement le surnageant du tube à centrifuger, laissant derrière lui le culot d’acide nucléique partiellement purifiée. Ajouter 20 mL de tampon TE et 1,5 mL d’une solution d’acétate de potassium 7,5 M à Resuspendre le culot, puis vortexer. Placez la suspension sur la glace pendant 5 min. Centrifuger à 16 000 x g pendant 30 min à 4 ° C, précipitation des protéines et des polysaccharides.
6. Ensuite, ajouter une RNAse et la protéinase K dans l’échantillon, mélanger doucement à la main et laisser reposer pour le moment. Ajouter un volume équivalent de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (mélange de ratio de 25:24:1) à la suspension à extraire et mélanger délicatement à la main. Centrifuger la préparation pendant 10 min à 13 000 x g. Retirer soigneusement le récipient de la centrifugeuse et note les deux couches.
7. Au fond, une couche plus lourd est composé de l’alcool de phénol : chloroforme : isoamylique et extraites des débris et la couche supérieure est l’humeur aqueuse et contient de l’ADN. Placez la phase aqueuse dans un récipient stérile, ajouter un volume équivalent d’isopropanol et inverser doucement pour ouvrir la précipitation de l’ADN. Incuber la suspension à température ambiante pendant 2 h. Pellet l’ADN purifié par centrifugation à 16 000 x g pendant 30 min. Retirer délicatement le surnageant l’ADN granulé peut ou pas être visible au fond du bateau, et puis remettre en suspension dans 1 mL de tampon TE.
8. À l’aide d’un spectrophotomètre ou un fluorimètre de quantification de l’ADN/ARN, mesurer le niveau de l’ADN extrait de l’échantillon. La quantité d’ADN est estimée à partir de la lecture nm 260. Une lecture d’absorbance de 1.0 équivaut à 50 µg d’ADN par mL de solution. Si la concentration est trop élevée pour une lecture précise, diluer la suspension de 1 à 10, ou 1 à 100 à l’aide de l’eau de qualité moléculaire.
9. La pureté de l’ADN est estimée par le rapport entre la lecture à 260 nm à celle à 280 nm. Une valeur > 1.7 indique ADN relativement pur. La valeur maximale théorique est 2.0.