Synthèse en phase solide

Solid Phase Synthesis

JoVE Science Education
Organic Chemistry II

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JoVE Science Education Organic Chemistry II

Solid Phase Synthesis

5.2: Nucleophilic Substitution

5.15: Polarimeter

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09:42 min

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February 22, 2017

Overview

Source : Vy M. Dong et Le Diane, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA

Synthèse en phase solide de Merrifield est un prix Nobel invention où une molécule du réactif est liée sur un support solide et subit des réactions chimiques successives pour former un composé désiré. Lorsque les molécules sont liées à un support solide, sous-produits et réactifs excédentaires peuvent être retirés en emportant les impuretés, tandis que le composé cible demeure lié à la résine. Plus précisément, nous permettra de présenter un exemple de synthèse de peptide de phase solide (RCR) pour illustrer ce concept.

Principles

Synthèse en phase solide est une méthode utilisée pour simplifier la synthèse de molécules. Il est souvent utilisé en chimie combinatoire (une technique utilisée pour préparer un grand nombre de molécules dans un court laps de temps), pour générer des bibliothèques de composés due à la facilité de la purification et la synthèse chimique dans l’ensemble. Synthèse en phase solide implique généralement l’utilisation d’une résine ; un matériau non soluble, à base de polymères, qui est pre-functionalized donc le départ blockcan bâtiment facilement lier. Les blocs de construction sont généralement protégés lorsqu’ils sont ajoutés sur la résine, et ils peuvent être facilement déprotégés et traités avec le prochain bloc de construction désiré en solution (Figure 1). Une fois qu’on a synthétisé la molécule désirée, elle peut facilement être clivée de la résine.

Parce qu’il est robuste, synthèse en phase solide a été utilisée pour synthétiser des acides nucléiques, oligosaccharides et le plus souvent, des peptides. Découvert et rapporté par Robert Bruce Merrifield en 1963, un RCR est devenue la méthode la plus utilisée pour générer des bibliothèques de peptides. Merrifield a remporté le prix Nobel de 1984 pour l’invention de RCR. Un RCR peut profiter facilement du Fmoc (sensible à la base) ou Boc (acide sensible)N-protéger les groupes sur les acides aminés à accumuler des bibliothèques de peptides dans un court laps de temps. HBTU (agent de couplage) et i-Pr₂EtN (base) activent le C-terminus de l’acide aminé pour le couplage avec un autre acide aminé. Fmoc groupes protecteurs peut être enlevée par 4-méthylpipéridine, tandis que Boc groupes protecteurs peut être enlevée par des acides forts comme l’acide trifluoroacétique. Dans cette expérience, nous allons démontrer un RCR grâce à la synthèse d’un dipeptide. Nous allons utiliser le test de Kaiser, une méthode qualitative pour tester la présence d’amines primaires, pour surveiller la progression de la réaction.

La figure 1. Concept qui sous-tend la synthèse de peptide de phase solide (SPPS).

Procedure

1. chargement de la résine

Pour un navire de synthèse de peptide 100mL, ajouter résine de chlorure (CCT) 2-chlorotrityl (1,1 mmol/g, g 0,360, 0.400 mmol). Ajouter 20 mL de DMF et laissez-les gonfler pendant 30 min sous le N_2.
Égoutter les perles sous vide et ajouter 10 mL de DMF.
Ajouter 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) et 2,5 mL i –Pr₂EtN et mélanger sous N₂ pendant 15 min.
Égoutter le solvant sous vide et répéter le chargement avec Fmoc-Ala-OH pendant 15 min.
Égoutter le solvant sous vide et laver les perles 10 ml DMFunder N₂et égoutter sous vide 3 x.

2. la déprotection du groupe Fmoc

Ajouter 10 mL 20 % 4-méthylpipéridine dans le DMF et remuer les perles sous N₂ pendant 15 min.
Égoutter le solvant sous vide et répétez la déprotection.
Laver les billes avec 10 mL de DMF sous N₂ et drain sous vide 3 x.

3. exécution de l’essai de Kaiser

Effectuer le test de Kaiser en ajoutant 1 à 2 gouttes de solution A (0,5 mL 0,01 M KCN, pyridine 24,5 mL), solution B (1 g ninhydrine, 20 mL de n-butanol) et la solution C (phénol 20 g, 10 mL de n-butanol) chacun dans deux tubes à essai. Un tube à essai sera le contrôle tandis que l’autre va surveiller la réaction.
Ajouter quelques perles de la résine de la cuve de réaction à éprouvette de réaction et de la chaleur vers le haut les deux tubes à essai à 110 ° C.
Si la déprotection est terminée, le contenu du tube à essai prennent une couleur bleu/violet foncée. Si la déprotection est incomplète ou défaillante, la solution reste jaune. Comparer l’éprouvette de réaction avec l’éprouvette de contrôle.

4. les blocs de construction prochaine de couplage

Égoutter le solvant sous vide.
Laver les billes avec 10 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone N₂ et vidange le solvant sous vide.
Pour commencer le prochain accouplement, ajoutez 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) et 2,5 mLi –Pr₂EtN et laissez la résine à bouillonner sous N₂ pour 30 min.
Égoutter le solvant sous vide.
Laver les billes avec 10 mL de DMF sous N₂ et drain sous vide 3 x.
Effectuer le Kaiser pour chercher l’achèvement de l’assemblage d’essai (voir étapes 3.1 à 3.3). Les perles et la solution dans l’éprouvette doivent être jaunes.

5. clivage du Peptide au large de la résine

Fendre le reste du groupe Fmoc procédant 2.1 à 2.3.
Après que le solvant est drainé sous vide, ajouter 40 mL de solution de clivage (95 % TFA, 2,5 % H₂O, conseils de 2,5 %) à la résine et la bulle sous N₂ pendant 3 h.
Placer un nouveau ballon récepteur sur le synthétiseur de peptide et vidange theTFA solution contenant le peptide désiré sous vide dans le ballon à nouveau.

6. précipitation et j’ai la consolation du Peptide

Séparer la solution TFA en 4 fioles coniques et ajouter 25 mL éther diéthylique froid (−20 ° C) à chaque flacon à précipiter le peptide.
Centrifuger les flacons (3 000 tr/min, 0-4 ° C) pendant 20 min. décanter le reste de la solution TFA et éther des fioles coniques et de concentrer le précipité de peptide pour s’offrir le dipeptide désiré comme un solide blanc.

Synthèse en phase solide est une méthode dans laquelle le produit est synthétisé tout lié à une matière insoluble.

Synthèse en phase solide est souvent utilisée pour produire biologiques oligomères et polymères tels que des peptides, acides nucléiques et oligosaccharides. Ces molécules sont composées de chaînes plus petites des sous-unités moléculaires, appelées monomères. Synthétiser un oligomère ou polymère prend beaucoup d’étapes, les monomères s’ajoutent dans le bon ordre.

Un problème avec des synthèses multi-étapes, c’est cette purification et isolement des produits stables de chaque étape, appelée produits intermédiaires, diminue le rendement global. Dans la synthèse en phase solide, le produit intermédiaire demeure lié au solid soutien tout au long de la synthèse. Cela permet des réactifs de phase soluble, des solvants et des sous-produits à être emportés, éliminant le besoin de purifier et d’isoler chaque produit intermédiaire entre les étapes.

Cette vidéo va illustrer la procédure pour la synthèse de peptide de phase solide et introduire quelques applications de synthèse en phase solide en chimie.

Dans la synthèse en phase solide, une molécule est synthétisée sur un support solide dans une séquence de réactions. Par exemple, un oligomère ou polymère sera synthétisé un monomère à la fois pour former le produit final. Le croissant oligomère ou polymère reste fortement lié à l’appui solide jusqu’à ce qu’elle est séparée, ou clivés, du soutien avec des réactifs.

Chaque monomère doit avoir au moins deux sites de fixation de faire partie de la chaîne polymère, mais seulement un accepteur peut être disponible à la fois pour s’assurer que le monomère se lie à l’atome correct. Ceci est réalisé avec les groupes protecteurs, qui sont des groupes fonctionnels qui ne sont pas réactifs pendant une ou plusieurs étapes de la synthèse. Le site de liaison est restauré ou déprotégé, en traitant de la molécule avec des réactifs spécifiques pour convertir la protection du groupe à un groupe fonctionnel réactif.

Pour commencer la synthèse en phase solide, le matériel de départ est lié à une résine spécialement conçue ou polymère insoluble sur son site de liaison disponible uniquement. Ensuite, le produit de départ lié est déprotégé pour autoriser la liaison du second monomère dans la chaîne. Ensuite, on ajoute une solution de monomère deuxième dans la chaîne, ainsi qu’un agent de couplage pour faciliter la liaison entre les monomères.

Une fois le second monomère se lie à la matière première, produit intermédiaire dimère qui en résulte est déprotégé. Ce processus est répété jusqu’à ce que l’oligomère de cible ou polymère a formé. Le produit est clivé de l’appui solide dans la solution, d’où elle peut être purifiée, isolé et analysé.

Synthèse en phase solide est souvent utilisée pour la synthèse des peptides, qui sont des chaînes d’acides aminés. Les acides aminés ont un groupement amine, un groupe carboxyle et un substituant ou « side chain ». L’amine est protégé au départ. Une fois que déprotégé, l’amine forme une liaison peptidique avec la fonction carboxyle de l’acide aminé suivant.

Maintenant que vous comprenez les principes de la synthèse en phase solide, nous allons passer par une procédure pour la synthèse de peptide de phase solide, dans lequel nous allons démontrer l’addition des deux premiers acides aminés.

Pour commencer la procédure, raccorder un ballon récepteur pour les déchets à un navire de synthèse peptidique manuelle 100 mL. Placez ensuite 0,360 g de résine de chlorure de 2-chlorotrityl dans le navire.

Raccorder une conduite de gaz d’azote dans la cuve d’arme de poing et une ligne vide à l’adaptateur de tuyau dentelé.

Ajouter 20 mL de diméthylformamide à la résine et laisser les perles de résine gonfler pendant 30 min sous un flux d’azote gazeux. Ensuite, appliquez vide pour drainer le solvant.

Ajouter 10 mL de DMF, 1,6 mmol d’un acide aminé Fmoc-protégé et 2,5 mL de N, N –diisopropyléthylamine au navire. Des bulles sous l’azote gazeux, qui mêle la solution, pendant 15 min charger l’aminoacide protégée sur la résine.

Enlever le solvant sous vide et effectuer un deuxième chargement. Après avoir enlevé le solvant, agiter les perles de résine chargé trois fois en portions de 10 mL de DMF, drainant chaque lavage dans le ballon récepteur.

Ensuite, ajoutez aux talons chargés 10 mL d’une solution à 20 % des 4-méthylpipéridine dans le DMF. Le mélange pendant 15 min à supprimer le groupe Fmoc des bulles.

Égoutter le solvant et répéter la procédure de déprotection. Laver et égoutter la résine chargée trois fois, comme avant. Stocker les perles sous solvant jusqu’à ce qu’ils sont prêts pour l’étape suivante.

Pour vérifier que le composé chargé a été complètement déprotégé, placez d’abord 1 à 2 gouttes de chaque solution de test de Kaiser dans deux tubes à essai.

Placer quelques billes chargées dans un tube à essai et chauffer les deux tubes à 110 degrés dans un bain d’huile. La déprotection est terminée si le mélange de la résine s’assombrit bleu au violet, indiquant la présence de groupes amines dans le mélange.

Pour commencer l’étape de l’accouplement, tout d’abord laver les billes avec 10 mL de NMP sous un débit de gaz N2.

Puis, ajouter 10 mL de NMP, 1,6 mmol de l’aminoacide prochaine Fmoc-protégé, 1,6 mmol de l’agent de couplage HBTU et 2,5 mL de DIPEA à la résine chargée.

Bulle de gaz N2 dans le mélange de résine pendant 30 minutes et puis égoutter le solvant. Laver et égoutter les perles avec des portions de 10 mL de DMF trois fois, comme avant.

Refaites le test de Kaiser. Couplage s’est produite avec succès si les perles et la solution virent au jaunes, indiquant qu’aucun groupes amines ne sont présents.

Ensuite, attacher le nouveau groupe Fmoc avec 20 % 4-méthylpipéridine dans le DMF et laver les perles avec des portions de 10 mL de DMF. Répétez le couplage et la déprotection pour chaque autres acides aminés du peptide de la cible.

Après le dernier acide aminé a été déprotégé et les perles de résine ont été lavés, ajouter 40 mL de solution de clivage du peptide de séparer le produit du peptide de la résine.

Bulle de gaz d’azote dans le mélange de résine pour 3 h et ensuite remplacer le ballon récepteur. Transférer la solution du mélange de la résine dans le nouveau ballon récepteur sous vide.

Pour générer le produit final, enlever le solvant avec un évaporateur rotatif.

Synthèse en phase solide est largement utilisée en biologie et en chimie. Regardons quelques exemples.

Synthèse en phase solide ouvre de nombreuses nouvelles voies synthétiques d’oligosaccharides, qui sont de courtes chaînes de monomères de sucres simples avec des rôles biologiques importants, tels que le stockage de l’énergie. Contrairement aux liaisons peptidiques, chaque liaison entre sucres contient un centre stéréogène. Pour synthétiser un oligosaccharide, doivent non seulement les monomères être dans le bon ordre, mais les obligations doivent aussi avoir la stéréochimie correcte. Techniques de synthèse en phase solide ont été développés pour atteler chaque monomère par un processus hautement stéréosélective, qui est aujourd’hui suffisamment raffiné à automatiser.

Synthèse en phase solide est une approche commune à la chimie combinatoire, qui est la pratique de synthétiser de nombreuses variantes d’un composé dans un seul processus synthétique. La résine chargée peut facilement être divisée en portions de réagir avec différents monomères ou molécules. Après chaque réaction, les portions sont lavées et recombinées. Cela est répété jusqu’à ce que le nombre désiré de produits a été généré. Cette technique est particulièrement utile dans la recherche pharmaceutique, car il peut être utilisé pour générer de nouveaux composés ou pour évaluer la réactivité d’un composé avec un large éventail de molécules.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE de synthèse en phase solide. Vous devez maintenant comprendre les principes sous-jacents de synthèse en phase solide, la procédure pour la synthèse de peptide de phase solide et quelques exemples de comment solid phase de synthèse est utilisée en chimie organique. Merci de regarder !

Results

Résultats représentatifs pour synthesisfor de peptide de phase solide procédure 3.

Étape de la procédure	Couleur d’une solution
3.1	Control – clair, jaune clair Réaction de clair, jaune clair
3.2	Control – clair, jaune clair Réaction-bleu foncé
3.3	Sombre solution bleue, perles bleus – déprotection complète ou couplage a échoué Incolores, perles jaunes – déprotection a échoué ou l’achèvement complet Solution incolore, perles rouge – incomplète déprotection de couplage ou incomplète

Tableau 1. Représentant de résultats pour Procédure 3.

Applications and Summary

Dans cette expérience, nous avons montré un exemple de synthèse en phase solide par l’intermédiaire de RCR grâce à la synthèse d’un dipeptide.

Synthèse en phase solide est largement utilisée en chimie combinatoire pour construire des bibliothèques de composés pour le dépistage rapide. Il a été couramment utilisé pour synthétiser des peptides, oligosaccharides et acides nucléiques. En outre, ce concept a été implémenté dans la synthèse chimique. Parce qu’il est hétérogène, ces réactifs solides-prise en charge peuvent souvent être recyclés et réutilisés dans des réactions subséquentes.

Transcript

Solid phase synthesis is a method in which the product is synthesized while bound to an insoluble material.

Solid phase synthesis is often used to produce biological oligomers and polymers such as peptides, nucleic acids, and oligosaccharides. These molecules are composed of chains of smaller molecular subunits, called monomers. Synthesizing an oligomer or polymer takes many steps, as the monomers must be added in the correct order.

An issue with multi-step syntheses is that purification and isolation of the stable products of each step, called intermediate products, decreases the overall yield. In solid phase synthesis, the intermediate product remains bound to the solid support throughout synthesis. This allows solution-phase reagents, solvents, and byproducts to be washed away, eliminating the need to purify and isolate each intermediate product between steps.

This video will illustrate the procedure for solid phase peptide synthesis and introduce a few applications of solid phase synthesis in chemistry.

In solid-phase synthesis, a molecule is synthesized on a solid support in a sequence of reactions. For instance, an oligomer or polymer will be synthesized one monomer at a time to form the final product. The growing oligomer or polymer remains strongly bound to the solid support until it is separated, or cleaved, from the support with reagents.

Each monomer must have at least two binding sites to be part of the polymer chain, but only one binding site can be available at a time to ensure that the monomer binds to the correct atom. This is achieved with protecting groups, which are functional groups that are not reactive during one or more steps of the synthesis. The binding site is restored, or deprotected, by treating the molecule with specific reagents to convert the protecting group to a reactive functional group.

To begin solid-phase synthesis, the starting material is bound to a specially designed resin or insoluble polymer at its only available binding site. Then, the bound starting material is deprotected to allow binding of the second monomer in the chain. Next, a solution of the second monomer in the chain is added, along with a coupling agent to facilitate bonding between the monomers.

Once the second monomer binds to the starting material, the resulting dimeric intermediate product is deprotected. This process is repeated until the target oligomer or polymer has formed. The product is cleaved from the solid support into solution, from which it can be purified, isolated, and analyzed.

Solid phase synthesis is often used for the synthesis of peptides, which are chains of amino acids. Amino acids have an amine group, a carboxyl group, and a substituent, or ‘side chain’. The amine is initially protected. Once deprotected, the amine forms a peptide bond with the carboxyl group of the next amino acid.

Now that you understand the principles of solid phase synthesis, let’s go through a procedure for solid phase peptide synthesis, in which we will demonstrate the addition of the first two amino acids.

To begin the procedure, connect a receiving flask for waste to a 100-mL manual peptide synthesis vessel. Then place 0.360 g of 2-chlorotrityl chloride resin into the vessel. Connect a nitrogen gas line to the vessel sidearm and a vacuum line to the serrated hose adapter.

Add 20 mL of dimethylformamide to the resin and allow the resin beads to swell for 30 min under a flow of nitrogen gas. Then, apply vacuum to drain the solvent.

Add 10 mL of DMF, 1.6 mmol of an Fmoc-protected amino acid, and 2.5 mL of N,N-diisopropylethylamine to the vessel. Bubble under the nitrogen gas, which mixes the solution, for 15 min to load the protected amino acid onto the resin.

Remove the solvent under vacuum and perform a second loading. After removing the solvent, agitate the loaded resin beads three times in 10-mL portions of DMF, draining each wash into the receiving flask.

Next, add to the loaded beads 10 mL of a 20% solution of 4-methylpiperidine in DMF. Bubble the mixture for 15 min to remove the Fmoc group.

Drain the solvent and repeat the deprotection procedure. Wash and drain the loaded resin three times, as before. Store the beads under solvent until they are ready for the next step.

To verify that the loaded compound was completely deprotected, first place 1 to 2 drops of each Kaiser test solution in two test tubes.

Place a few loaded beads in a test tube and heat both tubes to 110 degrees in an oil bath. Deprotection is complete if the resin mixture turns dark blue to purple, indicating the presence of amine groups in the mixture.

To begin the coupling step, first wash the beads with 10 mL of NMP under a flow of N2 gas.

Then, add 10 mL of NMP, 1.6 mmol of the next Fmoc-protected amino acid, 1.6 mmol of the coupling agent HBTU, and 2.5 mL of DIPEA to the loaded resin.

Bubble N2 gas through the resin mixture for 30 minutes, and then drain the solvent. Wash and drain the beads with 10-mL portions of DMF three times, as before.

Repeat the Kaiser test. Coupling has occurred successfully if the beads and solution turn yellow, indicating that no amine groups are present.

Next, cleave the new Fmoc group with 20% 4-methylpiperidine in DMF and wash the beads with 10-mL portions of DMF. Repeat the coupling and deprotection for each remaining amino acid in the target peptide.

After the last amino acid has been deprotected and the resin beads have been washed, add 40 mL of peptide cleavage solution to separate the peptide product from the resin.

Bubble nitrogen gas through the resin mixture for 3 h, and then replace the receiving flask. Transfer the solution from the resin mixture to the new receiving flask under vacuum.

To generate the final product, remove the solvent with a rotary evaporator.

Solid phase synthesis is widely used in biology and chemistry. Let’s look at a few examples.

Solid-phase synthesis opened many new synthetic pathways to oligosaccharides, which are short chains of simple sugar monomers with important biological roles, such as energy storage. Unlike peptide bonds, each bond between sugars contains a stereocenter. To synthesize an oligosaccharide, not only must the monomers be in the correct order, but the bonds must also have the correct stereochemistry. Solid-phase synthesis techniques were developed to couple each monomer by a highly stereoselective process, which today is sufficiently refined to be automated.

Solid-phase synthesis is a common approach to combinatorial chemistry, which is the practice of synthesizing many variants of a compound in a single synthetic process. The loaded resin can easily be split into portions to react with different monomers or molecules. After each reaction, the portions are washed and recombined. This is repeated until the desired number of products has been generated. This technique is particularly useful in pharmaceutical research, as it can be used to generate new compounds or to evaluate the reactivity of a compound with a wide array of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to solid phase synthesis. You should now understand the underlying principles of solid phase synthesis, the procedure for solid phase peptide synthesis, and a few examples of how solid phase synthesis is used in organic chemistry. Thanks for watching!

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