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La microscopie électronique à balayage, ou MEB, est souvent utilisée pour imager des matériaux biologiques à l’échelle nanométrique. Les microscopes optiques, qui utilisent la lumière pour imager un échantillon, sont fortement utilisés pour imager de manière non destructive des échantillons biologiques, cependant, leur résolution et leur profondeur de champ sont limitées, donc le MEB est utilisé afin d’obtenir une résolution plus élevée jusqu’à un nanomètre.
Dans le MEB, un faisceau d’électrons est focalisé à travers une série de lentilles de condensateur, qui frappent ensuite l’échantillon. Lorsque le faisceau frappe l’échantillon, les électrons à la surface sont diffusés et mesurés par le détecteur.
Dans cette vidéo, nous allons voir comment fonctionne le MEB, montrer comment imager un échantillon biologique en laboratoire et, enfin, présenter certaines techniques utilisées pour imager des échantillons sensibles.
Un microscope électronique à balayage utilise un faisceau d’électrons de haute énergie, qui est généré par un canon à électrons équipé d’une cathode à filament. Les électrons générés sont propulsés vers l’anode, puis focalisés à l’aide de lentilles de condenseur avant d’entrer dans la lentille de l’objectif. La lentille de l’objectif est calibrée pour focaliser le faisceau sur l’échantillon, où il est balayé raster sur toute la surface. Les interactions des électrons avec les atomes de l’échantillon sont utilisées pour étudier la topographie, la composition élémentaire et la cristallinité de l’échantillon. Lorsque le faisceau d’électrons incident frappe la surface, il émet des électrons secondaires et rétrodiffusés. Les électrons secondaires sont des électrons de basse énergie qui sont émis par l’échantillon près de la surface et fournissent des informations topographiques.
Les électrons rétrodiffusés, en revanche, sont réfléchis dans la direction opposée du faisceau incident. L’intensité de l’interaction augmente avec l’augmentation de la masse atomique, ce qui permet à l’utilisateur de distinguer les différences de composition. Une attention particulière est nécessaire pour imager les échantillons biologiques avec le MEB, car le MEB utilise un vide poussé, de sorte que les échantillons biologiques, qui ont généralement une teneur élevée en eau, doivent d’abord être séchés. Cela peut provoquer l’effondrement de la structure des échantillons sensibles, en particulier des cellules. Ainsi, les cellules sont traitées avec un fixateur, rincées, puis déshydratées lentement par lavage avec des quantités croissantes d’éthanol.
Pour les matériaux biologiques rigides, tels que l’échafaudage tissulaire de collagène-hydroxyapatite utilisé dans cette démonstration, l’échantillon est séché sur une période de plusieurs jours sous vide poussé.
Enfin, étant donné que l’imagerie MEB typique nécessite une surface conductrice, les échantillons biologiques sont souvent recouverts d’une fine couche de métal avant l’imagerie. Maintenant que nous avons discuté du fonctionnement du MEB et de la préparation d’un échantillon biologique pour l’imagerie, voyons comment préparer et imager un échafaudage tissulaire de collagène-hydroxyapatite.
Tout d’abord, montez l’échantillon de biomatériau sur un talon MEB à l’aide d’un ruban de carbone conducteur et assurez-vous que l’échantillon est sec et qu’il n’y a pas de contamination à la surface.
Ensuite, placez l’échantillon monté dans la chambre d’une coucheuse par pulvérisation, pompez la chambre et appliquez une couche de pulvérisation cathodique pendant environ 40 secondes pour obtenir une fine couche de métal de quatre à six nanomètres d’épaisseur, dans ce cas de l’or, avec une couverture adéquate. Une fois enrobé, retirez l’échantillon et utilisez du ruban conducteur pour relier le talon au sommet de l’échantillon, qui est maintenant recouvert de métal conducteur.
Enfin, montez le talon sur la platine SEM et serrez la vis sur le côté. L’échantillon est maintenant prêt à être imagé avec SEM. Tout d’abord, chargez l’étage dans la chambre SEM et scellez la porte, puis appuyez sur le bouton de transfert pour ouvrir le passage de la chambre de chargement à l’aspirateur. Une fois la porte interne ouverte, vissez la tige métallique dans la platine et poussez l’échantillon dans la chambre à vide, puis dévissez la tige métallique et rétractez-la complètement dans la chambre de chargement, puis appuyez sur le bouton de mémorisation pour fermer la chambre à vide.
Imaginons maintenant l’échantillon à l’aide du MEB.
Tout d’abord, déplacez la platine à l’aide du contrôleur et naviguez l’échantillon dans le champ de vision, puis déplacez-le verticalement jusqu’à ce que la distance de travail soit de cinq à 10 millimètres. Allumez le faisceau d’électrons et sélectionnez le détecteur d’électrons secondaires, réglez le faisceau sur cinq kiloélectronvolts au départ, puis augmentez jusqu’à 20 à 30 kiloélectronvolts si nécessaire. Si l’image n’est pas claire, tournez les boutons de mise au point, de luminosité et de contraste jusqu’à ce qu’une image claire apparaisse.
Utilisez la navigation par étape et les directions X et Y pour localiser un nouveau point sur l’échantillon, puis augmentez le grossissement jusqu’à ce que les caractéristiques souhaitées soient visibles. Ajustez la mise au point, le contraste et la luminosité selon vos besoins pour améliorer la qualité de l’image. Vous devrez peut-être réduire la vitesse de balayage et activer la moyenne en ligne pour obtenir une meilleure image, puis enregistrer l’image.
Les images MEB révèlent une structure hautement tridimensionnelle et poreuse avec des caractéristiques fibreuses inférieures à 25 microns. Ces caractéristiques seraient difficiles à visualiser à l’aide de la microscopie optique, car la microscopie optique a une profondeur de champ beaucoup plus faible.
L’imagerie des structures biologiques avec le MEB présente de nombreux défis, notamment l’effondrement de la structure ou les dommages causés par le faisceau d’électrons de haute énergie. Voyons maintenant comment la technique générale du MEB est appliquée à ces types d’échantillons sensibles. Les structures biologiques délicates, comme ces jeunes tissus végétaux, ou celles à forte teneur en eau, doivent être traitées par un processus de fixation avant l’imagerie.
Ces méristèmes floraux ont été immédiatement traités avec une solution fixatrice de formol / acide acétique fraîchement préparée. Le tissu fixé a été disséqué dans de l’éthanol, placé dans un récipient en filet et déshydraté à travers une série d’éthanol à 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol. Enfin, les tissus végétaux ont été séchés à l’aide d’un séchoir à point critique, montés et recouverts d’un mince revêtement métallique.
Après l’imagerie MEB, il est clair que les structures non traitées ont été lourdement endommagées par le processus de séchage et ont montré un effondrement considérable de la structure, tandis que celles qui ont été fixées ont conservé leur structure d’origine. Alternativement, les cellules et autres échantillons à haute teneur en eau peuvent être imagés à l’aide du MEB environnemental, ou ESEM. L’ESEM utilise un faisceau d’électrons de haute énergie qui est balayé par trame sur l’échantillon, comme avec le MEB conventionnel, cependant, il permet l’imagerie d’échantillons humides ou non revêtus en maintenant un environnement gazeux à l’intérieur de la chambre.
Cela se fait en séparant la chambre à vide poussé contenant le canon à électrons de la chambre d’échantillon à l’aide de deux ouvertures. Le faisceau d’électrons subit des pertes importantes en raison de la diffusion par les molécules de gaz, mais il a généralement une énergie suffisamment élevée pour l’imagerie. Ici, les cellules ont été cultivées sur une puce de silicium, fonctionnalisées avec des points quantiques et fixées à l’aide d’un protocole de fixation du glutaraldéhyde. Les cellules ont été imagées dans l’eau et montrent la structure non effondrée de la cellule avec des points quantiques individuels visibles à la surface de la cellule.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la visualisation des biomatériaux à l’aide du MEB. Vous devriez maintenant comprendre comment fonctionne le MEB, comment les échantillons biologiques sont préparés et imagés, ainsi que certaines applications de la technique pour les structures sensibles.
Merci d’avoir regardé !
