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Source : Peiman Shahbeigi-Roodposhti et Sina Shahbazmohamadi, Département de génie biomédical, Université du Connecticut, Storrs, Connecticut
Un microscope électronique à balayage (SEM) est un instrument qui utilise un faisceau d'électrons pour imager et caractériser les matériaux conductrices dans le vide. Comme analogie, un faisceau d'électrons est à la SEM comme la lumière est au microscope optique. La différence est que le microscope électronique donne des images de résolution et de grossissement beaucoup plus élevés. Les meilleurs microscopes optiques ont généralement une résolution jusqu'à 200 nm, tandis que les SEM revendiquent généralement une résolution de 0,5 nm. Cela est dû au fait que les microscopes optiques sont limités par la diffraction des ondes, fonction de la longueur d'onde, qui est d'environ 500 nm pour la lumière visible. Inversement, le SEM utilise un faisceau d'électrons sous tension, qui comme longueur d'onde de 1 nm. Cette caractéristique en fait des outils très fiables pour l'étude des nanostructures et des microstructures. Les microscopes électroniques permettent également l'étude d'échantillons biologiques dont la taille des caractéristiques est trop petite pour la microscopie optique.
Cette démonstration offre une introduction à la préparation d'échantillons et à l'acquisition initiale d'échantillons biologiques à l'aide d'un microscope électronique à balayage. Dans ce cas, un échafaudage cellulaire collagène-hydroxyapatite (HA) sera étudié. L'environnement sous vide du SEM et la charge induite par le faisceau d'électrons sur des échantillons non-conductifs (tels que la matière organique) créent des défis qui seront abordés dans la préparation. Les avantages et les inconvénients des différentes méthodes d'imagerie en ce qui concerne la résolution, la profondeur de mise au point et le type d'échantillon seront également discutés. Le but de cette démonstration est de donner au participant plus d'informations sur SEM pour déterminer si ce module de microscopie est le meilleur ajustement pour un type d'échantillon biologique.
1. Préparation de l'échantillon
2. Procédure d'imagerie
La microscopie électronique à balayage, ou SEM, est souvent utilisée pour l'image de matériaux biologiques à l'échelle nanométrique. Les microscopes optiques, qui utilisent la lumière pour imager un échantillon, sont fortement utilisés pour l'image non destructive des échantillons biologiques, cependant, leur résolution et la profondeur de champ est limitée, donc SEM est utilisé afin d'atteindre une résolution plus élevée jusqu'à un nanomètre.
Dans SEM, un faisceau d'électrons est focalisé à travers une série de lentilles de condensateur, qui frappe ensuite l'échantillon. Lorsque le faisceau frappe l'échantillon, les électrons à la surface sont dispersés et mesurés par le détecteur.
Dans cette vidéo, nous allons discuter du fonctionnement de seM, démontrer comment imager un échantillon biologique en laboratoire, et enfin, introduire certaines techniques utilisées pour l'image d'échantillons sensibles.
Un microscope électronique à balayage utilise un faisceau d'électrons à haute énergie, qui est généré par un pistolet à électrons équipé d'une cathode filament. Les électrons générés sont propulsés vers l'anode, puis concentrés à l'aide de lentilles à condensateur avant d'entrer dans la lentille objective. La lentille objective est calibrée pour concentrer le faisceau sur l'échantillon, où il est raster numérisé sur la surface. Les interactions des électrons avec les atomes de l'échantillon sont utilisées pour étudier la topographie, la composition élémentaire et la cristallinité de l'échantillon. Lorsque le faisceau d'électrons incident frappe la surface, il émet des électrons secondaires et rétrodiffusés. Les électrons secondaires sont des électrons de faible énergie qui sont émis par l'échantillon près de la surface et fournissent des informations topographiques.
Les électrons rétrodiffusés, d'autre part, sont reflétés dans la direction opposée du faisceau incident. L'intensité de l'interaction augmente avec l'augmentation du poids atomique, ce qui permet à l'utilisateur de distinguer les différences de composition. Une attention particulière est nécessaire pour l'image des échantillons biologiques avec SEM, puisque SEM utilise un vide élevé, donc les échantillons biologiques, qui ont généralement une teneur élevée en eau, doivent être séchés en premier. Cela peut provoquer l'effondrement de la structure des échantillons sensibles, en particulier les cellules. Ainsi, les cellules sont traitées avec un fixatif, rincé, puis déshydraté lentement en se lavant avec des quantités croissantes d'éthanol.
Pour les matériaux biologiques rigides, tels que l'échafaudage de tissu collagène-hydroxyapatite utilisé dans cette démonstration, l'échantillon est séché sur une période de plusieurs jours sous vide élevé.
Enfin, puisque l'imagerie SEM typique nécessite une surface conductrice, les échantillons biologiques sont souvent enduits d'une fine couche de métal avant l'imagerie. Maintenant que nous avons discuté du fonctionnement de SEM et de la façon de préparer un échantillon biologique pour l'imagerie, jetons un coup d'oeil à la façon de préparer et d'imager un échafaudage de tissu collagène-hydroxyapatite.
Tout d'abord, monter l'échantillon de biomatériau sur un talon SEM à l'aide de ruban de carbone conducteur et s'assurer que l'échantillon est sec et n'a pas de contamination à la surface.
Ensuite, placez l'échantillon monté dans la chambre d'un enduit de cputter, pompez vers le bas la chambre, et claquez l'échantillon pendant environ 40 secondes pour réaliser un mince, quatre à six nanomètres d'épaisseur de revêtement de métal, dans ce cas l'or, avec une couverture adéquate. Une fois enduit, retirer l'échantillon et utiliser du ruban conducteur pour relier le talon au dessus de l'échantillon, qui est maintenant recouvert de métal conducteur.
Enfin, montez le talon sur la scène SEM et serrez la vis sur le côté. Maintenant, l'échantillon est prêt à l'image avec SEM. Tout d'abord, chargez la scène dans la chambre SEM et scellez la porte, puis appuyez sur le bouton de transfert pour ouvrir le passage de la chambre de chargement au vide. Une fois que la porte interne est ouverte, visser la tige de métal dans la scène et pousser l'échantillon dans la chambre à vide, puis dévisser la tige de métal et le rétracter complètement dans la chambre de chargement, puis appuyez sur le magasin pour fermer la chambre à vide.
Maintenant, nous allons l'image de l'échantillon à l'aide de SEM.
Tout d'abord, déplacez l'étape à l'aide du contrôleur et naviguez dans le champ de vision, puis déplacez l'échantillon verticalement jusqu'à ce que la distance de travail soit de cinq à dix millimètres. Allumez le faisceau d'électrons et sélectionnez le détecteur pour les électrons secondaires, placez le faisceau à cinq volts de kiloélectrons d'abord, puis augmentez jusqu'à 20 à 30 volts d'électrons au besoin. Si l'image n'est pas claire, tournez la mise au point, la luminosité et les boutons de contraste jusqu'à ce qu'une image claire apparaisse.
Utilisez la navigation sur scène et les directions X et Y pour localiser un nouvel endroit sur l'échantillon, puis augmentez le grossissement jusqu'à ce que les caractéristiques désirées soient visibles. Ajustez la mise au point, le contraste et la luminosité au besoin pour améliorer la qualité de l'image. Vous devrez peut-être diminuer la vitesse d'analyse et activer la moyenne de ligne pour acquérir une meilleure image, puis enregistrer l'image.
Les images SEM révèlent une structure très tridimensionnelle et poreuse avec des caractéristiques fibreuses de moins de 25 microns. Ces caractéristiques seraient difficiles à visualiser à l'aide de la microscopie optique, car la microscopie optique a une profondeur de champ beaucoup plus faible.
Il existe de nombreux défis associés à l'imagerie des structures biologiques avec SEM, y compris l'effondrement de la structure ou des dommages causés par le faisceau d'électrons à haute énergie. Jetons maintenant un coup d'oeil à la façon dont la technique générale de SEM est appliquée à ces types d'échantillons sensibles. Les structures biologiques délicates, telles que ces jeunes tissus végétaux, ou celles à forte teneur en eau, doivent être traitées par un processus de fixation avant l'imagerie.
Ces méritéms floraux ont été immédiatement traités avec une solution fixative fraîchement préparée de formaline/acide acétique. Le tissu fixe a été disséqué dans l'éthanol, placé dans un récipient de maille, et déshydraté par une série d'éthanol de 70, 80%, 90%, et 100% d'éthanol. Enfin, les tissus végétaux ont été séchés à l'aide d'un séchoir à points critique, montés et enduits d'un mince revêtement métallique.
Après l'imagerie SEM, il est clair que les structures non traitées ont été lourdement endommagées par le processus de séchage et ont montré un effondrement considérable de la structure, tandis que ceux qui ont été fixés maintenu leur structure indigène. Alternativement, les cellules et autres spécimens à haute teneur en eau peuvent être photographiés à l'aide de SEM environnemental, ou ESEM. ESEM utilise un faisceau d'électrons à haute énergie qui est raster numérisé sur l'échantillon, comme avec SEM classique, cependant, il permet l'imagerie d'échantillons humides ou non couchés en maintenant un environnement gazeux dans la chambre.
Ceci est fait en séparant la chambre à vide élevé contenant le pistolet d'électron de la chambre de spécimen utilisant deux ouvertures. Le faisceau d'électrons entraîne des pertes importantes dues à la dispersion par les molécules de gaz, mais est généralement une énergie assez élevée pour l'imagerie. Ici, des cellules ont été cultivées sur une puce de silicium, fonctionnalisées avec des points quantiques, et fixées utilisant un protocole de fixation de glutaraldéhyde. Les cellules ont été représentées dans l'eau et montrent la structure non effondrée de la cellule avec des points quantiques individuels visibles sur la surface de la cellule.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la visualisation des biomatériaux à l'aide de SEM. Vous devez maintenant comprendre comment SEM fonctionne, comment les échantillons biologiques sont préparés et photographiés, ainsi que certaines applications de la technique pour les structures sensibles.
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La microscopie électronique à balayage, ou MEB, est souvent utilisée pour imager des matériaux biologiques à l’échelle nanométrique. Les microscopes optiques, qui utilisent la lumière pour imager un échantillon, sont fortement utilisés pour imager de manière non destructive des échantillons biologiques, cependant, leur résolution et leur profondeur de champ sont limitées, donc le MEB est utilisé afin d’obtenir une résolution plus élevée jusqu’à un nanomètre.
Dans le MEB, un faisceau d’électrons est focalisé à travers une série de lentilles de condensateur, qui frappent ensuite l’échantillon. Lorsque le faisceau frappe l’échantillon, les électrons à la surface sont diffusés et mesurés par le détecteur.
Dans cette vidéo, nous allons voir comment fonctionne le MEB, montrer comment imager un échantillon biologique en laboratoire et, enfin, présenter certaines techniques utilisées pour imager des échantillons sensibles.
Un microscope électronique à balayage utilise un faisceau d’électrons de haute énergie, qui est généré par un canon à électrons équipé d’une cathode à filament. Les électrons générés sont propulsés vers l’anode, puis focalisés à l’aide de lentilles de condenseur avant d’entrer dans la lentille de l’objectif. La lentille de l’objectif est calibrée pour focaliser le faisceau sur l’échantillon, où il est balayé raster sur toute la surface. Les interactions des électrons avec les atomes de l’échantillon sont utilisées pour étudier la topographie, la composition élémentaire et la cristallinité de l’échantillon. Lorsque le faisceau d’électrons incident frappe la surface, il émet des électrons secondaires et rétrodiffusés. Les électrons secondaires sont des électrons de basse énergie qui sont émis par l’échantillon près de la surface et fournissent des informations topographiques.
Les électrons rétrodiffusés, en revanche, sont réfléchis dans la direction opposée du faisceau incident. L’intensité de l’interaction augmente avec l’augmentation de la masse atomique, ce qui permet à l’utilisateur de distinguer les différences de composition. Une attention particulière est nécessaire pour imager les échantillons biologiques avec le MEB, car le MEB utilise un vide poussé, de sorte que les échantillons biologiques, qui ont généralement une teneur élevée en eau, doivent d’abord être séchés. Cela peut provoquer l’effondrement de la structure des échantillons sensibles, en particulier des cellules. Ainsi, les cellules sont traitées avec un fixateur, rincées, puis déshydratées lentement par lavage avec des quantités croissantes d’éthanol.
Pour les matériaux biologiques rigides, tels que l’échafaudage tissulaire de collagène-hydroxyapatite utilisé dans cette démonstration, l’échantillon est séché sur une période de plusieurs jours sous vide poussé.
Enfin, étant donné que l’imagerie MEB typique nécessite une surface conductrice, les échantillons biologiques sont souvent recouverts d’une fine couche de métal avant l’imagerie. Maintenant que nous avons discuté du fonctionnement du MEB et de la préparation d’un échantillon biologique pour l’imagerie, voyons comment préparer et imager un échafaudage tissulaire de collagène-hydroxyapatite.
Tout d’abord, montez l’échantillon de biomatériau sur un talon MEB à l’aide d’un ruban de carbone conducteur et assurez-vous que l’échantillon est sec et qu’il n’y a pas de contamination à la surface.
Ensuite, placez l’échantillon monté dans la chambre d’une coucheuse par pulvérisation, pompez la chambre et appliquez une couche de pulvérisation cathodique pendant environ 40 secondes pour obtenir une fine couche de métal de quatre à six nanomètres d’épaisseur, dans ce cas de l’or, avec une couverture adéquate. Une fois enrobé, retirez l’échantillon et utilisez du ruban conducteur pour relier le talon au sommet de l’échantillon, qui est maintenant recouvert de métal conducteur.
Enfin, montez le talon sur la platine SEM et serrez la vis sur le côté. L’échantillon est maintenant prêt à être imagé avec SEM. Tout d’abord, chargez l’étage dans la chambre SEM et scellez la porte, puis appuyez sur le bouton de transfert pour ouvrir le passage de la chambre de chargement à l’aspirateur. Une fois la porte interne ouverte, vissez la tige métallique dans la platine et poussez l’échantillon dans la chambre à vide, puis dévissez la tige métallique et rétractez-la complètement dans la chambre de chargement, puis appuyez sur le bouton de mémorisation pour fermer la chambre à vide.
Imaginons maintenant l’échantillon à l’aide du MEB.
Tout d’abord, déplacez la platine à l’aide du contrôleur et naviguez l’échantillon dans le champ de vision, puis déplacez-le verticalement jusqu’à ce que la distance de travail soit de cinq à 10 millimètres. Allumez le faisceau d’électrons et sélectionnez le détecteur d’électrons secondaires, réglez le faisceau sur cinq kiloélectronvolts au départ, puis augmentez jusqu’à 20 à 30 kiloélectronvolts si nécessaire. Si l’image n’est pas claire, tournez les boutons de mise au point, de luminosité et de contraste jusqu’à ce qu’une image claire apparaisse.
Utilisez la navigation par étape et les directions X et Y pour localiser un nouveau point sur l’échantillon, puis augmentez le grossissement jusqu’à ce que les caractéristiques souhaitées soient visibles. Ajustez la mise au point, le contraste et la luminosité selon vos besoins pour améliorer la qualité de l’image. Vous devrez peut-être réduire la vitesse de balayage et activer la moyenne en ligne pour obtenir une meilleure image, puis enregistrer l’image.
Les images MEB révèlent une structure hautement tridimensionnelle et poreuse avec des caractéristiques fibreuses inférieures à 25 microns. Ces caractéristiques seraient difficiles à visualiser à l’aide de la microscopie optique, car la microscopie optique a une profondeur de champ beaucoup plus faible.
L’imagerie des structures biologiques avec le MEB présente de nombreux défis, notamment l’effondrement de la structure ou les dommages causés par le faisceau d’électrons de haute énergie. Voyons maintenant comment la technique générale du MEB est appliquée à ces types d’échantillons sensibles. Les structures biologiques délicates, comme ces jeunes tissus végétaux, ou celles à forte teneur en eau, doivent être traitées par un processus de fixation avant l’imagerie.
Ces méristèmes floraux ont été immédiatement traités avec une solution fixatrice de formol / acide acétique fraîchement préparée. Le tissu fixé a été disséqué dans de l’éthanol, placé dans un récipient en filet et déshydraté à travers une série d’éthanol à 70 %, 80 %, 90 % et 100 % d’éthanol. Enfin, les tissus végétaux ont été séchés à l’aide d’un séchoir à point critique, montés et recouverts d’un mince revêtement métallique.
Après l’imagerie MEB, il est clair que les structures non traitées ont été lourdement endommagées par le processus de séchage et ont montré un effondrement considérable de la structure, tandis que celles qui ont été fixées ont conservé leur structure d’origine. Alternativement, les cellules et autres échantillons à haute teneur en eau peuvent être imagés à l’aide du MEB environnemental, ou ESEM. L’ESEM utilise un faisceau d’électrons de haute énergie qui est balayé par trame sur l’échantillon, comme avec le MEB conventionnel, cependant, il permet l’imagerie d’échantillons humides ou non revêtus en maintenant un environnement gazeux à l’intérieur de la chambre.
Cela se fait en séparant la chambre à vide poussé contenant le canon à électrons de la chambre d’échantillon à l’aide de deux ouvertures. Le faisceau d’électrons subit des pertes importantes en raison de la diffusion par les molécules de gaz, mais il a généralement une énergie suffisamment élevée pour l’imagerie. Ici, les cellules ont été cultivées sur une puce de silicium, fonctionnalisées avec des points quantiques et fixées à l’aide d’un protocole de fixation du glutaraldéhyde. Les cellules ont été imagées dans l’eau et montrent la structure non effondrée de la cellule avec des points quantiques individuels visibles à la surface de la cellule.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la visualisation des biomatériaux à l’aide du MEB. Vous devriez maintenant comprendre comment fonctionne le MEB, comment les échantillons biologiques sont préparés et imagés, ainsi que certaines applications de la technique pour les structures sensibles.
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