Un système d'attache magnétique d'enquêter sur les visuels et olfactifs Flight Control Mediated chez la drosophile

Le domaine en plein essor de l'olfaction chez Drosophila a stimulé le développement de tests comportementaux de plus en plus sophistiqués, tels que le dispositif olfactif à ancrage magnétique, ou OMT. Cette procédure consiste à coller le thorax dorsal de la drosophile sur une épingle en métal. La drosophile est suspendue à un angle de 30 degrés, l'épingle étant correctement inclinée, puis alignée entre deux aimants en terres rares.

Quand l'opération est effectuée correctement, cela permet une amplitude de mouvement libre. Un orifice d'odeur est ensuite aligné afin de produire un panache qui s'écoule en continu depuis la buse d'administration, au-dessus de la tête de la drosophile, jusqu'à la chambre sous vide. La capacité de la drosophile à localiser l'agent odorant est ensuite testée en présence de stimuli visuels.

Bonjour, je suis Brian DeMars du laboratoire du Dr Mark Fry, du Département des Sciences physiologiques de l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment fixer des mouches pour les utiliser dans un dispositif magnétique de maintien olfactif. Nous vous montrerons également comment aligner les aimants et les orifices d'odeur, ainsi que régler les débits massiques du système de délivrance des odeurs.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le contrôle du vol médié par les voies visuelle et olfactive chez les drosophiles. Commençons donc. Pour commencer l'attachement, récupérez des mouches quatre à six jours après l'émergence des adultes (ELOs) et privez-les de nourriture pendant quatre à six heures.

Dans un flacon de liste alimentaire contenant un essuie-tout humide pour éviter la dessiccation, transférez ensuite un lot de mouches marquées vers un petit flacon inséré dans un bloc en laiton placé sur un étage de refroidissement Peltier réglé à quatre degrés Celsius. À cette température, les mouches s'anesthésieront en environ 30 secondes.

Placez une serviette Kim sur le plateau de refroidissement pour absorber l'humidité. Ensuite, placez les mouches anesthésiées sur le plateau pour les trier, et sélectionnez les femelles les plus grandes pour les fixer. À l'aide d'un pinceau fin, poussez une seule mouche en position dans le sarcophage sur mesure, conçu pour accueillir une seule drosophile femelle de type sauvage.

Utilisez maintenant le microscope pour vous assurer que la drosophile est correctement positionnée sur son côté dorsal. L'extrémité antérieure de la drosophile doit être orientée vers vous et l'extrémité postérieure éloignée de vous. Positionnez ensuite une épingle minuchin munie d'une tige magnétique fixée sur un micromanipulateur.

L'aiguille doit être alignée avec l'extrémité émoussée tournée vers le thorax dorsal de la mouche. Cet emplacement se situe juste derrière la tête, entre les deux ailes. La mouche doit être positionnée correctement sur l'aiguille selon trois axes.

Le lacet, le roulis et le tangage de l'aiguille doivent être parfaitement verticaux lorsqu'on les observe de face, en regardant vers les yeux ; même une faible inclinaison en roulis entre la mouche et l'aiguille n'est pas tolérable. L'angle de vue latéral entre l'aiguille et l'axe longitudinal du corps, ou tangage, doit former un angle cabré de 30 degrés par rapport à l'horizon. Gardez à l'esprit que l'aiguille devra peut-être être ajustée pour un fonctionnement optimal du dispositif de fixation.

Cela dépendra de la distance entre les aimants de suspension. Une fois le brochette mnuchin alignée, utilisez un fin fil d'acier pour appliquer une petite goutte de colle activée par UV sur l'extrémité émoussée de la brochette mnuchin. Manipulez ensuite la brochette de manière à ce que la goutte de colle touche le thorax des mouches juste au-dessus de la tête.

Veillez à ne pas utiliser trop de colle. Avec la bonne taille de goutte, la colle doit former un ménisque et s'écouler de la pointe vers le thorax. Ensuite, polymérisez la colle avec deux impulsions de lumière UV de 22 secondes chacune.

Une fois le fixage terminé, placez à la main une petite lingette Kim sur chaque mouche à l’aide de pinces en raison d’un réflexe d’atterrissage instinctif. Les mouches saisiront les lingettes Kim. Après une heure de récupération, les mouches fixées sont prêtes pour les expériences.

Pour obtenir une amplitude de mouvement continue de 360 degrés, il est essentiel d'aligner correctement les aimants. Pour ce faire, maintenez les aimants annulaires inférieurs à l'horizontale à l'aide d'un manchon en plastique et placez-les directement au-dessus d'une chambre à vide transparente. L'aimant en barreau supérieur est fixé verticalement à environ trois quarts de pouce au-dessus des aimants inférieurs ; un roulement double en forme de V est fixé avec de la résine époxy à la surface inférieure de l'aimant supérieur.

Cela permettra de standardiser le positionnement des mouches et de minimiser le frottement rotatif. Gardez à l'esprit que ces aimants peuvent être dangereux et qu'une mauvaise utilisation peut entraîner des dommages matériels ou des blessures corporelles mineures. Ensuite, alignez grossièrement les aimants supérieur et inférieur à vue d'œil.

En plaçant l'aimant en barre supérieur directement au-dessus du point central des aimants annulaires inférieurs, il sera utile d'attacher l'aimant supérieur à un micromanipulateur pour un réglage fin. Placez maintenant une drosophile dans l'arène et ajustez la position horizontale et verticale de l'aimant supérieur jusqu'à ce que la drosophile puisse effectuer une rotation complète et régulière de 360 degrés. Au début de chaque expérience, chaque drosophile doit être vérifiée afin de s'assurer d'une rotation fluide, ce qui garantit un alignement correct des aimants et l'absence de dommages aux broches mnuchin. Si le montage est incorrect, la drosophile risque de ne pas tourner du tout.

Peut présenter une amplitude de mouvement limitée ou tourner à des vitesses irrégulières. Cela pourrait être dû à un problème de collage, qu’il est possible de vérifier en faisant tourner une grille rayée devant la mouche afin d’induire une réponse omo. Si la mouche ne tourne pas ou tourne de manière irrégulière, remplacez-la par une autre mouche.

Si cette mouche ne tourne pas correctement et que ces problèmes existent pour chaque mouche, le problème est probablement dû à l'alignement des aimants, et des ajustements supplémentaires seront nécessaires pour obtenir une odeur stable. Le suivi de la configuration initiale du système d'odeur exigera de faire passer un tube en téflon de petit diamètre du multiplexeur de gaz aux flacons d'odeur aqueuse sur mesure. La sortie de ces flacons doit être raccordée directement aux tubes de port hypodermique à l'aide du même tube en téflon.

Ensuite, placez une chambre à vide en acrylique transparent sous l'arène afin de supporter les aimants. Utilisez un tube en verre de quatre millimètres monté sous la drosophile et relié à la chambre à vide pour rapprocher l'ouverture du vide de la drosophile et réduire le diamètre de l'ouverture. Placez maintenant une drosophile attachée dans l'arène à l'aide de pinces.

Une fois la mouche en place, activez une odeur attractive. Vous pouvez vérifier visuellement si la mouche se dirige vers la position du port d'odeur lorsque celle-ci est activée. Si la mouche ne semble pas avoir de préférence pour l'odeur, utilisez des essais successifs pour optimiser l'OMT.

Pour ce faire, commencez par ajuster la position du port d’odeur jusqu’à ce que la drosophile semble suivre l’odeur. Ici, les ports d’odeur sont fixés sur des micromanipulateurs et positionnés à quatre millimètres en dorsal et à trois millimètres en antérieur par rapport à la tête de la drosophile. Si le changement de position du port d’odeur n’améliore pas le suivi de l’odeur, ajustez le débit massique jusqu’à ce que la drosophile semble suivre l’odeur.

Nous utilisons un débit de sept millilitres par minute. Si l'ajustement du débit massique n'améliore pas le suivi de l'odeur, modifiez le débit du vide jusqu'à ce que la drosophile semble suivre l'odeur. Nous réglons le débit du vide à 13 litres par minute à l'aide d'un régulateur de débit.

Une fois la position du port et les débits établis, alternez périodiquement entre la délivrance de vapeur d'eau et de vapeur d'odeur à l'aide d'un multiplexeur gazeux commutable. Si vous avez correctement configuré votre appareil, vous devriez observer deux phénomènes. Premièrement, sous des stimuli visuels en rotation constante, une mouche fixée placée dans le TOM devrait effectuer une rotation régulière de 360 degrés selon l'axe vertical ou axe ya ; des changements de direction saccadés appelés kos sont caractéristiques d'un comportement de virage spontané en l'absence de stimuli visuels constants.

Si les mouches ne peuvent pas tourner en douceur, un collage incorrect ou des aimants mal alignés peuvent en être la cause. Deuxièmement, vous devriez également observer que lorsque l’odeur est activée, la mouche doit se diriger vers le port d’odeur. Lorsque l’odeur est désactivée, la mouche doit tourner spontanément sans préférence pour aucune position dans l’arène.

Si les mouches ne suivent pas activement le panache odorant, cela peut signifier que vous devez ajuster la position du port d'odeur, le débit d'air ou le débit d'aspiration. Nous venons de vous montrer comment fixer une mouche pour son utilisation dans un dispositif de maintien magnétique olfactif. Nous vous avons également montré comment aligner correctement les aimants et les ports d'odeur, ainsi que comment régler les débits massiques du système de délivrance des odeurs.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.