Micro-drive tableau pour les maladies chroniques In vivo Enregistrement: Assemblée Tétrode

Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication et l'installation de faisceaux Tetro composés de quatre électrodes destinés à l'enregistrement chronique in vivo chez le rongeur éveillé, afin d'entamer la fabrication des tétrodes. Un brin de fils microélectrodes est plié deux fois sur lui-même pour former un faisceau de quatre fils parallèles. Ces fils sont ensuite torsadés ensemble et imprégnés à l'aide d'un pistolet à air chaud.

Chaque tero terminé est placé dans une boîte de stockage. Pendant la fabrication d'autres teros, chaque tero est inséré dans un trajet dédié entrant par une ouverture dans un actionneur linéaire et sortant par la base du réseau de micro-entraînement. Chacun des quatre fils du tero est relié à des broches distinctes sur une carte de connecteur de sortie fixée au sommet du réseau de micro-entraînement.

L'impédance de chaque canal du tero est réduite à l'aide d'un procédé de galvanoplastie à l'or. Une fois que tous les teros ont été installés et galvanoplastiés, deux fils de masse sont fixés aux broches respectives de la plaque de connexion, et un cône de protection est fixé au cadre du réseau de micro-entraînement pour assurer la protection après mise à la masse du cône. Des réseaux de micro-entraînement Tero fonctionnels prêts à être implantés. Bonjour, je suis Dave Nian du laboratoire de Nat Wilson à l'Institut Pickout pour l'apprentissage et la mémoire.

Aujourd'hui, au MIT, nous allons vous montrer une procédure permettant de fabriquer des teros, de les charger et de réaliser les étapes finales de la reconstruction du micro-entraînement. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'activité neuronale coordonnée entre de grandes populations de neurones dans un préparatif d'animal éveillé et en comportement. Commençons donc.

Pour construire le tero de notre réseau microdynamique standard, nous commençons par un tronçon de 50 centimètres de fil micrométrique isolé de 12 µm. Pliez le fil en deux, passez les doigts le long de la paire pour les faire adhérer ensemble. Assurez-vous que la paire de fils présente un bon contact sur toute leur longueur.

Repliez la paire en tenant les deux extrémités ensemble. Veillez à ce que la boucle formée à une extrémité ne présente pas de pli. Coupez les quatre fils à l'extrémité sans boucle de manière à ce que les quatre pointes soient alignées.

Pour l'étape suivante, vous aurez besoin d'une pince crocodile modifiée, d'un dispositif motorisé de rotation et d'une barre horizontale placée au-dessus du dispositif de rotation. La pince crocodile est modifiée en collant une barre en plastique à la base de la pince. Lorsque les extrémités sont exposées, serrez les quatre fils ensemble à l'aide de la pince crocodile modifiée.

Accrochez la boucle de fil au-dessus de la barre horizontale. Placez la pince crocodile sur la platine motorisée. Appliquez 80 torsions dans le sens horaire, suivies de 40 torsions dans le sens antihoraire, au faisceau de fils sur une durée d'environ trois minutes.

Ces paramètres peuvent être ajustés selon vos besoins. Une fois le torsadage terminé, soudez les fils ensemble en les chauffant selon trois angles différents à l’aide d’un pistolet thermique, avec un débit moyen à faible pour chaque angle, en commençant un à deux centimètres en dessous de l’endroit où le faisceau de fils se sépare. Puis, faites passer le pistolet thermique vers le bas puis vers le haut à une distance de deux centimètres des fils pendant environ cinq secondes.

Procédez avec précaution car des températures élevées peuvent fondre complètement l'isolation et provoquer des courts-circuits. Maintenant que les fils sont soudés ensemble, retirez le tero de l'appareil de torsion en soulevant doucement la pince crocodile afin de relâcher la tension sur le tero, puis coupez le tero près de la pince crocodile. À l'autre extrémité, coupez la boucle de manière à obtenir quatre brins de fil non marqués de longueur égale. Ensuite, séparez les brins individuels au sommet en courbant délicatement les fils à l’aide d’une pince à épiler à embout souple.

Le téro est désormais prêt à être chargé dans le réseau de micro-lecteurs. Fabriquez 21 à 25 autres routes Tet supplémentaires et conservez-les dans une boîte sans poussière jusqu’au moment où le processus de chargement du téro pourra commencer. Vous aurez besoin d’un réseau complet de micro-lecteurs si vous n’en avez pas encore construit un.

Se référer à la vidéo sur le dispositif micro-électrode pour l'enregistrement chronique in vivo, concernant la fabrication du réseau de micro-dispositifs dans notre plan de conception. Le tero sera fixé à une extrémité au matériel de connecteur et passera à travers le tube porteur en polymide du micro-dispositif, de sorte que les pointes des électrodes dépassent sous la base du réseau de micro-dispositifs. Nous allons maintenant démontrer ce processus de chargement pour un tero.

Avant de commencer, construisez le support du dispositif qui peut être fixé à la carte de connexion à une extrémité et, à l'autre extrémité, serré par un bac de glace. Dans cet exemple, le support du dispositif est un connecteur milax collé à une extrémité d'un manche de cutter X, tenant le tétro avec des pinces à embout souple, et à l'aide d'un stéréoscope, poussez l'extrémité du tétro dans le tube porteur en poly-milieu d'un des micro-dispositifs. Enfoncez le tétro dans le tube jusqu'à ce que les fils électrodes individuels soient proches de la carte de connexion située en haut du réseau de dispositifs ; faites attention de ne pas casser ni courber les fils, car cela entraînerait une insertion du tétro dans le cerveau selon un angle plutôt que perpendiculairement, et compromettrait l'intégrité du tétro.

Insérez maintenant délicatement l'autre extrémité des quatre fils dans les trous respectifs de la carte d'interface des électrodes à l'aide de pinces à pointes souples. Évitez encore une fois de plier ou de tordre les fils. Une fois les quatre fils en place, insérez les broches en or dans leurs trous à l'aide d'une pince dont la mâchoire inférieure a été raccourcie.

Lorsque les broches sont insérées dans le trou, elles dénudent l'isolation du fil et établissent une connexion électrique servant de référence ultérieure. Notez soigneusement la correspondance entre les micro-entraînements et la position des broches sur la carte d'interface des électrodes. Continuez à charger un total de 18 tétradés.

Les trois micro-entraînements restants de la matrice serviront à loger les électrodes de référence. Chaque électrode de référence est constituée d'un tero qui n'utilise qu'un seul des quatre yns non soudés. Pour fixer les électrodes de référence, suivez la procédure de chargement, mais reliez uniquement l'une des quatre électrodes à la broche correspondante de l'électrode de référence sur la platine de connexion.

Si vous prévoyez des enregistrements multicanaux, il peut être utile de planifier à l’avance les connexions entre les teros et la plaque de connexion. Par exemple, regroupez sur la plaque d’interface électrode les tétras destinés à une même région anatomique. Cela devrait minimiser le risque de régler accidentellement le mauvais tétra pendant les expériences.

Une fois le chargement de tero terminé, préparez deux fils de mise à la terre, un pour l'animal et un pour le cône de protection. Coupez un fil d'acier gainé de six pouces de long et retirez trois millimètres d'isolation à chaque extrémité du fil à l'aide de pinces en métal. Ensuite, coupez un fil d'acier gainé de quatre pouces de long.

Retirez trois millimètres d'isolant à une extrémité et un centimètre à l'autre extrémité. Passez le fil de masse de six pouces à travers le trou sur le côté du dispositif micro-entraîné et remontez vers la carte d'interface. Connectez le fil dénudé à la carte d'interface des électrodes à l'aide d'une broche en or insérée dans le trou de masse désigné.

Ce fil sera relié au crâne de l'animal. Acheminez le fil de masse de quatre pouces parallèlement au fil de masse précédemment installé. Connectez l'extrémité dénudée de trois millimètres à la carte d'interface des électrodes à l'aide d'une broche en or insérée dans un autre trou de masse désigné.

Ce fil sera ultérieurement relié à un cône de protection, qui servira de petite cage de Faraday afin de réduire la capture de bruit. Nous avons maintenant terminé la connexion des fils et pouvons passer à l'affinage de nos teros. Notre objectif dans ce processus est de couper tous les teros de manière à ce qu'ils soient légèrement plus longs que la profondeur de la structure cérébrale cible et de notre exemple.

Les micropousseurs sont conçus pour une course maximale de cinq à six millimètres, suffisante pour atteindre de nombreuses régions du néocortex et l'hippocampe dorsal d'un rat adulte. Abaissez d'abord tous les micropousseurs afin que les tétrodes soient entièrement exposées simultanément. Coupez toutes les tétrodes à une longueur d'environ cinq millimètres supérieure à la longueur finale souhaitée, en utilisant une paire de ciseaux fins et tranchants pour la coupe finale.

Préparez une paire de ciseaux crantés dans un récipient d'eau glacée, fixez une poignée avec un léger angle vers le bas et les crans orientés vers le haut, tout en laissant l'autre poignée libre. Retirez maintenant complètement tous les fils Tet dans leurs cannules guide en tournant les micropoussoirs vers le haut. À l'aide d'un stéréoscope, étendez entièrement un tero hors de sa cannule.

À l’aide d’une règle, positionnez les ciseaux crantés à la distance souhaitée par rapport au guide de la canule. Coupez délicatement le tero d’un seul mouvement fluide. Une fois le tero coupé, retirez le micro-entraînement de trois à quatre millimètres vers le haut.

Répétez ce processus pour chaque tero jusqu'à ce que tous aient été découpés. À ce stade, vous êtes prêt pour le plaquage or. Plaquage or.

Le ro teros est essentiel pour des enregistrements stables à long terme. Il empêche la corrosion et améliore la biocompatibilité. Configurez le métrificateur d'impédance en mode externe sur le générateur de courant et en mode vérification CC avec sortie audio.

Toucher les deux broches du générateur de courant aux six paires de canaux possibles dans chaque tero et utiliser le retour audio pour déterminer s'il existe des courts-circuits entre les paires. Un court-circuit entre des paires de canaux produit un son de ce type. S'il y a un court-circuit, recouper le tero avec des ciseaux crantés et effectuer à nouveau le test.

Si le problème persiste, jetez le trajet Tet et remplacez-le. Déplacez toutes les micromoteurs vers le bas, en étendant tous les trajets Tet aussi loin que possible. Modifiez la configuration de l'équipement pour vérifier l'impédance des électrodes.

Trempez maintenant les extrémités de tous les teros dans un bain de solution standard de placage or. Le bain d'or est relié électriquement à la borne négative du milliohmmètre. Vérifiez l'impédance de l'électrode en touchant la borne positive du milliohmmètre à la broche correspondante sur la platine de connexion.

Mesurez et enregistrez l'impédance de chaque fil sur le réseau de micro-entraînement. Les valeurs normales varient entre un et trois mégohms sur le générateur actuel. Réglez le courant entre un et trois microampères.

Ensuite, fixez fermement. Connectez la borne positive du milliohmmètre à la broche située sur la platine de connexion. Sur le milliohmmètre.

Passer rapidement du mode normal au mode contournement et inversement, tout en étant en mode contournement. Le courant traversera la voie Tet et la solution d'or, et l'or sera déposé sur la pointe de l'électrode. L'impédance après chaque cycle de dépôt doit être inférieure à celle précédente.

Répétez l'impulsion électrique. Si l'impédance n'est pas descendue en dessous d'un mégohm. Une plage conservatrice d'impédances acceptables va de 250 kilohms à 350 kilohms.

Si l'impédance descend en dessous de 200 kiloohms, cela peut indiquer un court-circuit. Si, après plusieurs impulsions répétées, l'impédance ne diminue pas suffisamment, la pointe de l'électrode pourrait être obstruée. Recoupez le tero, vérifiez les courts-circuits et répétez le processus de plaquage or.

Si le recoupage ne donne pas de résultat, remplacez le tero et recommencez. Après avoir ensemencé tous les teros, plongez-les dans de l'éthanol et laissez-les sécher de trois à cinq minutes. Vérifiez la présence de courts-circuits à l'intérieur des teros à l'aide du générateur de courant, les extrémités des teros étant exposées à l'air.

Si une connexion continue existe entre deux électrodes ou plus d'un tero, recouper le tero et le plaquer à nouveau avec de l'or. Une fois le plaquage or de tous les teros terminé, placer tous les teros dans le support. Comme étape finale en haut de chaque micro-support, ajouter une goutte de colle cyanoacrylate de viscosité moyenne à l'interface entre chaque tero et son tube en polyéthylène.

Cela permettra de fixer le tero à son micro-entraînement. L'objectif du con protecteur est de protéger les micro-entraînements et le fil de tero exposé des agressions environnementales. Il assure également un soutien pour la manipulation pendant une expérience et réduit les bruits électriques.

Nous utilisons un cône en plastique imprimé en 3D. Toutefois, il est possible de fabriquer le cône à partir d'autres matériaux, comme un morceau de canette courbé. On peut prendre le cône en plastique et fixer un ruban adhésif en aluminium sur la surface intérieure ou extérieure.

Insérez d'abord et tournez partiellement trois vis de taille 3 1 72, mesurant trois seizièmes de pouce de longueur, dans les côtés du cône avec le réseau de moteurs en suspension. Insérez le cône par-dessus le moteur. Assurez-vous que les deux fils de masse sortent par le bas du réseau de moteurs.

Enroulez la partie exposée du fil de terre de quatre pouces autour de l'une des vis 1 72 plusieurs fois et serrez fermement la vis. Fixez solidement le cône à la base d'entraînement en resserrant les deux autres vis du cône. La fabrication du dispositif micro-entraînement est désormais terminée. Votre dispositif micro-entraînement est chargé avec 18 téros répartis en trois références.

Il est enfermé dans un cône et un capuchon de protection pour assurer sa durabilité. L'unité terminée pèse généralement entre 20 et 25 grammes en moyenne.

Le réseau de micro-électrodes terminé est implanté à l'aide d'une procédure chirurgicale standard. Comme vous pouvez le voir, le dispositif est relié à une puce préamplificatrice et à un faisceau de fils qui transmettent le signal vers le matériel et les logiciels d'acquisition de données. Nous venons de vous montrer comment fabriquer les téros et achever la procédure de construction du réseau de micro-électrodes.

Dans cette vidéo, nous vous avons montré comment fabriquer des teros, charger et conditionner les teros pour l'enregistrement in vivo. De plus, nous vous avons montré comment ajouter un cône à la matrice de micro-driver afin de la rendre plus robuste au fil du temps. La construction de la matrice de micro-driver comporte de nombreuses étapes ; soyez donc patient, manipulez délicatement les électrodes et veillez à ce que toutes les étapes intermédiaires soient correctement réalisées.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.