Purification et visualisation de la grippe A complexes ribonucléoprotéiques virale

Cette procédure commence par l'élimination de tous les débris présents dans la solution virale de la grippe par centrifugation. La membrane virale est ensuite rompue à l'aide d'un détergent, et les VRnps libérés sont séparés sur un gradient de glycérol.

Les fractions issues de la centrifugation sur gradient sont recueillies et un aliquot de chaque fraction est analysé. Sur une électrophorèse SDS-PAGE, les gels sont colorés au bleu de Kumasi afin de déterminer les fractions pic contenant les VNP. Les fractions contenant les VNP sont ensuite concentrées par centrifugation, et les VRP purifiées sont déposées sur une grille de microscopie électronique à transmission en cuivre, qui est ensuite négativement contrastée pour visualiser les VRP en microscopie électronique en transmission. Bonjour, je suis WinCo Wu au laboratoire de la Dre Nellie Pane, du Département de zoologie de l'Université de la Colombie-Britannique.

Je suis Lindsay Weaver, anciennement du laboratoire Pane. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de purification des complexes ribonucléoprotéiques viraux de la grippe. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'importation nucléaire du virus de la grippe A dans des cellules en culture tissulaire.

Commençons. Pour commencer l'expérience, introduisez 750 microlitres de tampon MNT dans un tube à centrifuger Beckman en polycarbonate de 11 millimètres par 34 millimètres. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d'une solution de virus de la grippe A à 2 milligrammes par millilitre dans le tube, puis pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour mélanger le virus avec le tampon MNT.

Après le mélange, placer le tube dans un rotor TLA 100.2 et centrifuger dans une centrifugeuse Beckman Optima max E pendant 10 minutes à 109 000 ×g à 4 °C. Une fois la centrifugation terminée, retirer le surnageant, puis resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon de disruption à l’aide d’un vortex. Resuspendre vigoureusement le culot, puis agiter à 31 °C pendant 20 minutes dans un mélangeur thermique Eppendorf.

Lorsque l'agitation est terminée, procédez à la centrifugation en gradient de glycérol selon la vitesse de sédimentation. Pour préparer le gradient de glycérol, ajoutez les volumes suivants de glycérol dans un tube à centrifuger Beckman UltraClear de 13 millimètres par 51 millimètres : un millilitre de glycérol à 70 % volume par volume, 0,75 millilitre de glycérol à 50 %, 0,375 millilitre de glycérol à 40 %, et 1,8 millilitre de glycérol à 33 %. Ces solutions de glycérol sont préparées en mélangeant du glycérol pur avec du tampon NM.

Préparez également un tube témoin contenant du glycérol et du tampon. Vortexez à nouveau l'échantillon viral rompu et déposez-le sur le gradient de glycérol. Placez le tube dans un rotor oscillant Beckman MLS 50 et centrifugez le gradient pendant trois heures et 45 minutes à 217 000 ×g et à quatre degrés Celsius.

Une fois la centrifugation terminée, prélevez manuellement des aliquotes de 250 microlitres du gradient en partant du haut du tube. Conservez les fractions sur glace ou à quatre degrés Celsius. Une fois les fractions recueillies, nous sommes prêts à les analyser par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

Pour commencer l'analyse SDS-PAGE, prélevez 20 microlitres de chaque fraction et transférez-les dans un tube propre. Ajoutez ensuite 5 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS-PAGE 5× et chauffez l'échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après chauffage, centrifugez brièvement les échantillons et chargez-les sur un gel de polyacrylamide à 10 %, en incluant des marqueurs de poids moléculaire dans l'un des puits. Ensuite, faites migrer les échantillons à travers le gel jusqu'à ce que le colorant de charge bleu de bromophénol atteigne la partie inférieure du gel.

Retirez le gel de l'appareil SDS-PAGE et coloriez le gel avec du bleu kumasi. En fonction des résultats de la coloration, identifiez les fractions qui contiennent principalement la nucléoprotéine de la grippe.

La NP de la grippe A a une taille d'environ 56 kilodaltons et constitue la protéine majeure présente dans les complexes ribonucléoprotéiques viraux. La bande de NP est donc généralement la bande la plus intense dans les fractions contenant les VRNP. Dans la partie suivante, nous concentrerons ces fractions de VRNP.

Combiner les fractions de glycérol contenant principalement les NP, et les répartir dans deux tubes à centrifuger Beckman en polycarbonate de 11 millimètres par 34 millimètres ; remplir chaque tube avec du carbonate de pyruvyle éthylique ou de l'eau ultrapure traitée au DEPC. Ensuite, pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour homogénéiser. Placer les tubes dans un rotor Beckman TLA 120.2 et centrifuger pendant quatre heures et demie à 157 000 ×g à 4 °C.

Lorsque la centrifugation est terminée, retirez le surnageant et resuspendez le culot. Dans un aliquot de 50 microlitres d'eau traitée au DEPC, mettez de côté un aliquot du V NPS purifié et conservez les autres à moins 80 degrés Celsius. Nous sommes maintenant prêts à procéder à la coloration négative des VRP.

Diluez un microlitre de VRNP purifié dans neuf microlitres de tampon PBS fraîchement préparé et filtré deux fois. Soumettez une grille de microscopie électronique à transmission (MET) en cuivre à une décharge luminescente pendant 30 secondes. Cette grille avait été préalablement recouverte d’un film de Parlow Dion et de carbone. À l’aide de pinces pour maintenir la grille fraîchement soumise à la décharge luminescente, appliquez une goutte de cinq microlitres de VRNP dilué sur la grille d’échantillon.

Laisser la goutte s'absorber sur la grille pendant huit minutes en attendant. Placer une petite bande de parfum dans un plateau, puis déposer sur le parfum deux gouttes contenant chacune 10 microlitres de tampon PBS, ainsi qu'une goutte de 80 microlitres de la solution de coloration fraîchement préparée, composée de 1 % d'ammonium méli date. Laver ensuite la grille porte-échantillon en la descendant soigneusement dans les deux gouttes de PBS pendant une durée totale d'une minute.

Ensuite, utilisez un morceau de papier filtre pour absorber une partie de la solution échantillon sur la grille porte-objet sans laisser sécher la grille. Immédiatement après avoir absorbé la dernière goutte de tampon sur la grille porte-objet, plongez complètement celle-ci dans la goutte de colorant. Attendez ensuite une minute.

Après une minute, utilisez un nouveau morceau de papier filtre pour éliminer complètement la solution de coloration de la grille d'échantillon. Laissez sécher la grille d'échantillon à l'air pendant plusieurs minutes avant l'observation. Au microscope électronique en transmission, voici des images représentatives de la microscopie électronique en transmission de nanoparticules de V colorées négativement.

Comme vous pouvez le constater ici, les V NPS ressemblent à des particules en forme de bâtonnets de longueur variable, mesurant environ entre 30 nanomètres et 120 nanomètres de long. La NP oligomérique est organisée en une chaîne de molécules de NP qui s'enroule ensuite en une structure répétitive en double hélice. Ainsi, des boucles aux extrémités de ces particules en forme de bâtonnets peuvent parfois être observées.

Nous venons de vous montrer comment purifier et visualiser l'influenza. Des complexes ribonucléoprotéiques viraux. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de ne pas utiliser de PBS pour diluer les VR mps si vous utilisez de l'acétate d'urane pour la coloration négative.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.