Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

Produire des enregistrements électrophysiologiques stables à partir des jonctions neuromusculaires des larves de Joof. Disséquez d’abord une larve pour exposer la paroi corporelle, les muscles et le système nerveux avant l’enregistrement. Les axones à la base du SNC sont coupés à l’arrière du ganglion ventral.

Ensuite, une électrode d’enregistrement est placée sur le muscle d’intérêt et une électrode de stimulation est placée près des motoneurones innervants. Les axones sectionnés des motoneurones sont aspirés dans la pipette de stimulation. Les potentiels de jonction excitatrice peuvent alors être enregistrés.

Bonjour, je m’appelle Wendy MLA et je travaille au laboratoire McCabe du département de physiologie et de biophysique cellulaire de l’Université Columbia. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour mesurer la transmission des tics à la jonction neuromusculaire de la lave GE. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie synaptique et la transmission neurologique.

Alors commençons. Pour commencer l’expérience, disséquez des larves de tiers errant et d’étoiles pour exposer la paroi du corps. Ce protocole est modifié pour les expériences électrophysiologiques à l’aide de broches de dissection courtes.

Ceux-ci mesurent environ deux à quatre millimètres de long et sont moins susceptibles de frapper l’objectif du microscope dans les électrodes pendant l’expérience. Après avoir exposé la paroi corporelle, utilisez une pince pour tenir le SNC et soulevez-le légèrement. Ensuite, coupez les axones moteurs des nerfs périphériques et retirez le cerveau.

Après avoir retiré le lavage de cerveau, la préparation disséquée deux fois avec un tampon HL 3.1 avec un millimolaire de calcium. Maintenant que la dissection est terminée, des enregistrements intracellulaires peuvent être effectués à partir des cellules musculaires larvaires. Placez la plaque de dissection sur le microscope d’électrophysiologie et immergez la préparation avec un tampon HL 3.1 plus du calcium.

Fixez ensuite l’électrode du bain de manière à ce qu’elle soit en contact avec la solution. L’électrode d’aspiration est utilisée pour stimuler les nerfs périphériques qui innervent le muscle. Positionnez d’abord l’électrode d’aspiration dans la parabole pour éviter les vibrations lorsque l’électrode intracellulaire est placée sur le muscle.

Une fois que l’électrode est dans la boîte, positionnez-la près du motoneurone qui innerve le muscle six. Dans le troisième segment abdominal, appliquez une légère aspiration jusqu’à ce que le nerf coupé soit à l’intérieur de la pipette en verre. Veillez à ne pas étirer les nerfs lors de l’application de la succion.

Soulevez légèrement la pipette pour qu’elle ne touche pas le muscle. Et puis positionnez-le de manière à ce qu’il ne tire pas sur les fibres nerveuses coupées. Une fois l’électrode d’aspiration en place, positionnez l’électrode d’enregistrement pour les enregistrements intracellulaires.

Utilisez une micro-électrode pointue remplie de chlorure de potassium à trois molaires. Positionnez l’électrode d’enregistrement au-dessus du centre du muscle six. Ajustez le décalage d’entrée pour qu’il indique zéro pour la solution de bain.

Abaissez lentement l’électrode et approchez-vous du muscle sous un grossissement optique élevé jusqu’à ce qu’il touche la surface musculaire. Pour confirmer que le muscle a été pénétré, observez l’oscilloscope. Le potentiel de la membrane au repos doit être d’au moins moins 60 millivolts.

Le potentiel sporadique de nplate miniature devrait maintenant être visible. Une fois l’électrode d’enregistrement en place, laissez les cellules se stabiliser pendant une minute. Avant de commencer les enregistrements, utilisez un axon HS deux, un étage de tête dans un amplificateur de pince d’essieu deux B pour détecter les changements de potentiel de membrane.

La pince d’essieu deux B est l’interface d’un ordinateur qui exécute le logiciel de pince P via les données numériques. 1322 A, qui numérise le signal. Enregistrez le potentiel de membrane sur un PC. Avec le logiciel clamp X, appliquez des stimuli à l’axone moteur pour générer des potentiels de membrane excitatrice ou ejs.

Une fois les ejs générés, enregistrez les ejs miniatures sur une période de trois minutes sans synapse des stimuli. Un logiciel d’analyse soft mini peut être utilisé pour analyser les traces et déterminer l’amplitude et la fréquence du mini EJP. Pour générer ejs.

Utilisez un générateur d’impulsions maître huit pour stimuler jusqu’à l’extrémité coupée d’un programme de motoneurones. Le générateur pour fournir des impulsions de tension carrée de 0,3 milliseconde programme. Un intervalle de cinq secondes entre les stimuli pour permettre la récupération synaptique.

Au NMJ, enregistrez au moins 10 potentiels évoqués de chaque muscle et faites la moyenne des amplitudes. Cette figure montre une trace typique enregistrée à partir du muscle six d’une larve de sal de type sauvage avec des réponses EJP évoquées et des mini-EJ.PS spontanées Nous venons de vous montrer comment enregistrer les potentiels cy de la jonction neuromusculaire de la lave de drosophile. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de terminer la dissection dans les trois à 10 minutes et de commencer les enregistrements électrophysiologiques immédiatement pendant que les cellules sont encore saines et réactives.

Si la dissection prend trop de temps, le potentiel de membrane au repos des cellules musculaires sera inférieur à moins 60 millivolts, ce qui est trop faible pour être enregistré. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.