Name: Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Découvrez la mesure de la dynamique calcique globale et proche membrane dans les astrocytes en culture utilisant la microscopie à fluorescence et en réflexion totale interne. Cette méthode permet d'étudier simultanément les signaux calciques dans les cellules gliales.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Uehara Memorial du Japon (ES) ainsi que la Fondation de Whitehall, l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies et un prix de Stein-Oppenheimer de dotation (au BSK).

Procédures expérimentales La procédure expérimentale se compose de deux parties principales qui sont décrits d&#39;une façon par étapes ci-dessous. Partie 1: PRÉPARATION DES CULTURES hippocampique astrocyte Brièvement, mélangé hippocampique astrocyte-neurone cultures ont été préparés en utilisant un protocole bien établi 1,2,3. Nous avons optimisé la procédure de céder saine astrocytes mis en culture. Toutes les procédures énumérées ci-dessous doit être effectuée dans un environnement stérile, comme une hotte à flux laminaire. Préparation des lamelles <ul><li> 22 lamelles mm (VWR, 48380-068) </li><li> Poly-D-Lysine (PDL, Sigma P0899), des aliquotes (1 mg / ml) </li><li> La laminine aliquotes (20 pg / ml): ajouter 49 ml d&#39;eau stérile à 1 mg / ml solution laminine (Sigma L2020), faire 1,2 aliquotes ml et conserver à -20 ° C </li></ul><ol><li> Dissoudre PDL dans l&#39;eau stérile (50 pg / ml) </li><li> Autoclaver les lamelles, rincez à l&#39;eau stérile et le placer dans PDL (20 ml pour 100 lamelles). Laisser à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Remplacer PDL à l&#39;eau stérile (3 lavages extensifs). Puis sécher les lamelles et conserver à 4 ° C. </li><li> Le jour avant l&#39;étalement des lamelles les astrocytes place individuelle dans un puits stérile sur une plaque à 6 puits (Multiwell fond plat Plaques avec couvercles, stériles de BD Bioscience). Mettez 400 pi de la laminine sur chaque lamelle et incuber pendant la nuit, dans l&#39;incubateur pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol> Dissection Dissection des médias: <ul><li> 500 ml de Earle solution saline équilibrée (EBSS) (1X), liquide (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ml solution HEPES (Sigma, H0887) </li></ul> Les médias hippocampe: <ul><li> 412,5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) (1X), liquide contient des sels de Earle, mais pas de rouge de L-glutamine ou du phénol (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml de glucose (Sigma, D-(+)-glucose anhydre SIGMA ULTRA G7528) 1 M dans du MEM </li><li> 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml de solution de pyruvate de sodium (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml d&#39;HEPES solution 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml de N-2 Supplément (100X), liquide (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml de sérum de cheval, inactivé par la chaleur (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Solution de papaïne: <ul><li> Ajouter 5 ml de milieu de dissection dans Worthington PAPAÏNE-022 flacon (LK003178; concentration finale de 20 U / ml) et incuber à 37 ° C pendant 60 min. </li></ul><ol><li> Décapitez ratons âgés de P1 (généralement 2 chiots) suivant les lignes directrices révisées et approuvées par les réglementations nationales et de vos soins locaux des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation. </li><li> Enlever la peau et le crâne et le cerveau dans une boîte de Pétri remplie avec les médias de dissection froide. </li><li> Suppression des méninges, disséquer les deux hémisphères et disséquer hippocampes. </li><li> Hacher les hippocampes dans ~ 1X1 pièces mm et digérer en solution papaïne à 37 ° C pendant min 11-13. </li><li> Une fois les morceaux de tissu sont installés, retirez soigneusement la papaïne et ajouter 5 ml de milieu de l&#39;hippocampe pour éliminer toute trace de l&#39;enzyme. Répétez cette étape et remettre dans le milieu de l&#39;hippocampe (2 ml). </li><li> Triturer les cellules ~ 5 fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y touffes gauche, avec trois flammes poli pipettes de trous progressivement plus petits (1000 um, ~ ~ 500 um et 300 um). </li><li> Une fois trituré, passer les cellules à travers une passoire de cellules (taille des pores, 70 um, BD Biosciences). Compter les cellules dans 10 pl de suspension. Réglez le volume du milieu de l&#39;hippocampe dans le but d&#39;avoir 400 000 cellules / ml. </li><li> Aspirer le laminine hors les lamelles, et avant le couvre peut sécher, la plaque 200 pl de la suspension cellulaire par lamelle. </li><li> Laissez-les à joindre pendant 60 min dans l&#39;incubateur, puis ajouter 2 ml de milieu de l&#39;hippocampe par puits. </li><li> Le lendemain, aspirer ancienne moyennes hippocampe pour enlever les cellules mortes et les débris et ajouter 2 ml de pré-chauffé moyennes hippocampique frais. </li></ol> Entretien Les médias Neurobasal: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml de sérum B27 supplément gratuit (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml de L-glutamine (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Nourrissez les cultures astrocytes neurone deux fois par semaine avec milieu neurobasal, à commencer quatre jours après placage. Préincuber les médias à environ 30 minutes dans l&#39;incubateur dans un flacon aéré pour équilibrer la température et le CO 2. Partie 2: imagerie calcique Mémoire tampon d&#39;enregistrement hippocampe: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (Tous les produits chimiques de Sigma) pH 7,4 (ajusté avec NaOH). Chargement colorant indicateur de calcium dans les astrocytes <ol><li> Placer la culture dans un puits sur une plaque à 6 puits remplis avec 2 ml de tampon d&#39;enregistrement hippocampe contenant 2,5 uM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) et 0,05% Pluronic ® solution F-127 de 20% dans le DMSO (Invitrogen, P-3000MP) et incuber à température ambiante pendant 10-30 min. </li><li> Retirer Fluo-4 solution et laver lamelles 3 fois avec un tampon d&#39;enregistrement de l&#39;hippocampe et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Placer la lamelle sur la chambre, propre et de l&#39;autre côté de la lamelle avec un liquide de nettoyage pour lentilles. </li><li> Mettez une petite goutte d&#39;huile d&#39;immersion (DF type à immersion d&#39;huile à partir Cargille) sur l&#39;objectif et de mettre la chambre (chambre ouverte pour 25 mm rond lamelle de Warner Instruments) sur la platine du microscope (Olympus IX71). </li><li> Regardez les cellules en utilisant la lumière de transmission de voir comment les cellules regard, et les amener au point. Puis éclairent les cellules avec 488 nm à partir d&#39;un monochromateur (V polychrome de Till Vision) et de déterminer si le signal de fluorescence du fluo-4 est uniforme et détectable dans les astrocytes. </li><li> Utilisez le PEV et l&#39;éclairage TIRF pour mesurer le calcium dans les astrocytes. </li></ol> Microscopie TIRF En bref, nous utilisons un microscope Olympus IX71 équipé d&#39;une caméra Andor IXON DV887DCS EMCCD. Le contrôle de l&#39;excitation et l&#39;acquisition des images est réalisé en utilisant le logiciel TILLVision. Les poutres de 454/488/515 nm Argon (100 mW) et 442 nm état solide (45 MW) lasers sont combinés et contrôlée avec un laser TILL Polyligne combineur, condenseur à double port et de la FRBR acoustoptical filtre accordable et le contrôleur (AOTF; tous de TILL Photonics) et nourris dans une fibre à large bande pour l&#39;entrée en Kineflex le condenseur FRBR. Nous utilisons un Olympus 60X 1,45 NA pour atteindre l&#39;objectif FRBR. Le gain de la caméra est ajusté pour chaque astrocyte pour fournir le meilleur rapport signal sur bruit des images. Le contexte et les principes de microscopie TIRF ont été récemment revu 4, 5. La plupart des composants optiques que nous utilisons ont été achetés auprès TILL Photonics, qui fait maintenant partie de Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondeur de pénétration TIR peut être calculé à partir des équations ci-dessous. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Équation" /> d = profondeur de pénétration Indice de réfraction n1 = de verre n2 = indice de réfraction de la cellule a = angle d&#39;incidence NAi = ouverture numérique de l&#39;incidence Afin d&#39;assurer le laser est aligné de façon optimale pour la FRBR, nous trouvons qu&#39;il est utile d&#39;observer 100 nm bille fluorescente (Invitrogen, F8803). Nous présentons des images fixes et des vidéos de perles avec le PEV et la microscopie TIRF. Lorsque dans les FRBR, on observe une augmentation spectaculaire de signal-bruit et les perles d&#39;affichage diffusion brownienne. Nous estimons qu&#39;il est utile d&#39;observer le comportement de 100 nm avec des perles microscopie TIRF sur une base régulière (~ une fois par semaine) pour être sûr que la FRBR optimale se produit, plutôt que de l&#39;éclairage oblique, compromis qui se produirait si l&#39;angle critique ne sont pas égaux à α (voir fig 1). Application de la protéine G agonistes des récepteurs couplés Les astrocytes expriment une variété de GQ récepteurs couplés aux 6, 7, y compris les récepteurs de glutamate métabotropique et des récepteurs P2Y (agoniste, ATP, ADP). L&#39;activation de ces récepteurs conduit à une augmentation significative du taux de calcium intracellulaire dans les astrocytes. Par exemple, on peut facilement observer des élévations de calcium intracellulaire pendant l&#39;application de l&#39;ATP (30 uM) à 8-10 astrocytes. Nous utilisons une solution rapide de commutation de Warner Instruments appelé le Système VC-77SP perfusion rapide Étape (http://www.warneronline.com/index.cfm). Avec cette méthode peut être des solutions appliquées en moins de ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figure 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> Cartoon FIGURE 1. Et des photographies de l&#39;imagerie mis en place. A. montre une photographie du microscope monté sur une airtable, alors que (B) montre une photographie de l&#39;assemblage laser, les contrôleurs et les boîtes de faisceau. C montre une photo de la platine du microscope à la chambre de montée pour l&#39;imagerie. Sur la gauche du dispositif de perfusion rapide peut être vu (avec le moteur pas à pas et tubes thêta). Sur la droite du headstage d&#39;un amplificateur Axopatch 200A est vu. La caricature schématise le trajet de la lumière dans la mise en place et comment TFRI est atteint. Le laser est focalisé sur le plan focal arrière de l&#39;objectif 60X 1,45 NA et sa position est ajustée décentré afin qu&#39;elle émerge dans l&#39;huile d&#39;immersion à l&#39;angle critique α. A ce point le faisceau souffre d&#39;une réflexion interne totale et se désintègre avec une λ distance (voir l&#39;équation dans le texte principal) dans le milieu de l&#39;indice de réfraction plus faible. Dans ce cas, il s&#39;agit de la mémoire tampon d&#39;enregistrement entourant les astrocytes et les astrocytes eux-mêmes. Le résultat est une excitation optique (et donc d&#39;imagerie) des molécules dans ~ 100 nm de la membrane plasmique. Dans le dessin animé de la cellule de ceci est montré que le vert &quot;excité&quot; récepteurs membranaires, alors que ceux au sein de la cellule ou sur la surface supérieure de la cellule ne sont pas excités. Un compte rendu complet de la microscopie TIRF a été fournie par Steyer et Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figure 2" /> FIGURE 2. Images de 100 perles fluorescentes nm acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. montre des images du PEV d&#39;un champ de vue avec des perles de plusieurs dizaines de nm 100 fluorescentes. Le point rouge flèches aux perles qui se sont installés sur la lamelle de verre, tandis que les flèches bleues au point de perles qui se diffusent dans l&#39;eau. B. montre une image TIRF du même champ de vision, comme indiqué en A. Dans ce point de vue que les perles adhérente représentée par les flèches rouges sont visibles. C&#39;est parce que ces s&#39;étaient installés sur le verre et coverlsip étaient donc dans le domaine de ~ 100 nm évanescente. Les perles montré dans une des flèches bleues ne sont pas dans cette région et sont donc invisibles dans les images FRBR. Les parcelles inférieures montrent un rendu 3D des images. Il est clair qu&#39;une augmentation importante de signal-bruit est produit pour les billes dans le champ évanescent lorsque observées par microscopie TIRF. En fait, pour ces images le signal-bruit pour le PEV a été de 7,1 ± 0,6, tandis que pour la FRBR il était de 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figure 3" /> FIGURE 3. Images des astrocytes chargées avec Fluo-4 colorant indicateur de calcium acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. PEV images d&#39;un champ de vue avec cinq astrocytes. B. Une image TIRF du même champ de vue montré dans la note B. que les images de A et B sont sensiblement différentes. C&#39;est parce qu&#39;avec la FRBR seul éclairage de la membrane plasmique des régions en apposition à proximité de la lamelle de verre sont imagés. Les panneaux inférieurs montrent ATP évoqué transitoires du calcium intracellulaire imagées avec le PEV et la microscopie TIRF.

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<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
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<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Il est bien établi que les astrocytes affichage des élévations de calcium intracellulaire. Ils se produisent spontanément, peut être déclenchée par l&#39;activité neuronale ou par application d&#39;agonistes à activer les récepteurs à la surface des astrocytes 11. Une question importante et controversée est de savoir si astrocytes élévations de calcium intracellulaire peut déclencher la libération de molécules de signalisation qui activent les récepteurs des neurones 11, 12. Ceci est controversée, car il ya eu des preu...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Micro Cover Slips, Ronds, No. 1</td><td>Outil</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromure</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminine provenant de la membrane basale de sarcome murin Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée d'Earle&amp;rsquo;s (EBSS) (1X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Minimum Essentiel (MEM) (1X), liquide, contenant les sels d'Earle&amp;rsquo;s, mais sans L-glutamine ni rouge de phénol</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Solution liquide de pénicilline-streptomycine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pyruvate de sodium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Solution de HEPES 1 M</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Supplément N-2 (100X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval, inactivé par la chaleur</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Réactif</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal&amp;#8482; (1X), liquide sans rouge de phénol</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Supplément sans sérum B-27 (50X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquide</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour cellules</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits plates BD Falcon avec couvercles, stériles</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Acide HEPES libre</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Fluo-4 AM 1 mM dans le DMSO</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Pluronic&amp;#174; F-127 20 % dans le DMSO</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Huile d'immersion TYPE DF</td><td>Microscope</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Chambre ouverte pour lamelles rondes de 25 mm, volume de 100 &amp;mu;l</td><td>Outil</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme P-2 pour chambres série 20, sans chauffage</td><td>Outil</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles carboxyl-modifiées FluoSpheres, 0,1 &amp;mu;m, fluorescentes jaune-vert (505/515), 2 % de solides</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Le cerveau contient des cellules gliales. Les astrocytes, un type de cellules gliales, ont longtemps été connues pour fournir un rôle passif de soutien pour les neurones. Cependant, plus de preuves suggèrent que les astrocytes peuvent aussi participer activement à la fonction cérébrale par des interactions fonctionnelles avec les neurones. Toutefois, de nombreux aspects fondamentaux de la biologie des astrocytes restent controversées, clairs et / ou expérimentalement inexploré. Une question importante est la dynamique des transitoires du calcium intracellulaire dans les astrocytes. Cette question est pertinente parce que le calcium est bien établi comme un messager important secondes et parce qu&#39;il a été proposé que les élévations de calcium astrocytaire peut déclencher la libération de transmetteurs d&#39;astrocytes. Cependant, il n&#39;a pas été toute description détaillée ou satisfaisante du calcium à proximité de la membrane plasmique de signalisation dans les astrocytes. Fluorescence totale de réflexion interne (FRBR) microscopie est un outil puissant pour analyser physiologiquement pertinents événements de signalisation dans environ 100 nm de la membrane plasmique des cellules vivantes. Ici, nous utilisons la microscopie TIRF et décrire la façon de surveiller à proximité de la membrane plasmique et la dynamique globale du calcium intracellulaire presque simultanément. Le raffinement et l&#39;application systématique de cette approche a le potentiel pour informer sur les détails précis de la signalisation calcique astrocytaire. Une compréhension détaillée de la dynamique du calcium dans les astrocytes pourrait fournir une base pour comprendre si, comment, quand et pourquoi les astrocytes et les neurones subissent calcium-dépendante des interactions fonctionnelles.

Nous décrivons comment mesurer près de la membrane et la dynamique globale du calcium intracellulaire dans les astrocytes cultivés en utilisant la réflexion interne totale et de la microscopie à épifluorescence.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Le cerveau contient des cellules gliales. Les astrocytes, un type de cellule gliale, sont connus depuis longtemps pour jouer un rôle de soutien passif auprès des neurones. Cependant, ...

Dans la première partie de cette vidéo, nous allons démontrer comment préparer la co-culture d'astrocytes et de neurones. Pour ce faire, plusieurs hippoCampi provenant de rats P un sont collectés dans un tube, digérés au propane, dissociés par ation, puis ensemencés sur des lamelles. La deuxième section montrera comment mesurer la dynamique calcique intracellulaire dans les astrocytes, ce qui implique le chargement d'un colorant indicateur calcique flu oh quatre dans les astrocytes et la mesure de la dynamique calcique globale par microscopie epi, ainsi que la mesure de la dynamique calcique proche de la membrane par microscopie turf.En modifiant rapidement et automatiquement l'illumination, on peut observer presque simultanément le calcium global et le calcium proche de la membrane. Bonjour, je suis Aji omi, chercheur postdoctoral au laboratoire Budget COS du Département de physiologie de l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie calcique des asto sites.Nous utilisons cette procédure dans notre étude en laboratoire sur la dynamique calcique globale et près de la membrane dans un ostéocyte. En modifiant rapidement et automatiquement l'élimination, nous pouvons résoudre le calcium global et le calcium proche de la membrane. Presque simultanément, je montrerai comment nous appliquons une TP pour provoquer une élévation du calcium dans l'astrocyte.Je terminerai ensuite par un résumé et une discussion sur la barrière avec la méthode d'étude des astrocytes. Commençons donc l'étude. Pour initier la culture d'astrocytes, retirez la peau et le crâne de la tête d'un raton décapité.Placer le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de milieu de dissection froid, disséquer les deux hémisphères et retirer les méninges. Ensuite, disséquer les hippocampes. Hacher les hippocampes en morceaux d'environ un millimètre sur un millimètre.Effectuer la digestion dans la solution Pappa à 37 degrés Celsius pendant 11 à 13 minutes. Retirer le tissu disséqué de l'incubateur. Ensuite, une fois que les morceaux de tissu sont déposés, les retirer soigneusement de la digestion au propane et ajouter cinq millilitres de milieu hippocampique pour laver les morceaux hachés d’hippocampe.Répétez cette étape, puis finalement, resuspendez dans le milieu hippocampique. Itérez les cellules environ cinq fois à l’aide de trois pipettes dont la taille diminue progressivement et dont l’embout a été poli à la flamme. Une fois terminé, faites passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres de diamètre et ajoutez quatre millilitres de milieu au tamis.Compter les cellules dans 10 microlitres de suspension. Ajuster le volume du milieu hippocampique afin d'obtenir 400 000 cellules par millilitre. Préparer maintenant les lamelles pour ensemencer la suspension cellulaire en aspirant le laminine des lamelles, qui ont été exposées à une solution de laminine toute la nuit.Avant que les lamelles ne sèchent, déposez 200 microlitres de la suspension cellulaire par lamelle. Laissez-les adhérer pendant 60 minutes dans l'incubateur. Après l'incubation, ajoutez deux millilitres de milieu hippocampique par puits.Le lendemain, aspirez le vieux milieu hippocampique pour éliminer les cellules mortes et les débris, puis ajoutez deux millilitres de nouveau milieu hippocampique préalablement réchauffé. L'entretien du milieu des cultures mixtes astrocytes-neurones doit commencer quatre jours après le semis, en ajoutant un millilitre de milieu neurobasal frais deux fois par semaine. Veillez à pré-incuber les milieux environ 30 minutes dans l'incubateur, dans un flacon ventilé, afin d'équilibrer la température et le dioxyde de carbone.Avant d'étudier les astrocytes, il est utile d'observer des billes fluorescentes nanométriques afin d'optimiser l'angle du laser pour la technique TURF. Pour ce faire, déposez 200 microlitres d'eau dans la boîte de Pétri et ajoutez un microlitre de billes fluorescentes de 100 nanomètres, mélangez, puis observez les billes en microscopie à épifluorescence. Ensuite, observez les billes en microscopie TURF.Pour l'imagerie calcique, placer la culture dans une cavité d'une plaque à six puits remplie de deux millilitres de tampon d'enregistrement hippocampique contenant 2,5 micromolaire de fluo-4 AM et 0,05 % de Pluronic F127, une solution à 20 % dans le DMSO, et incuber à température ambiante pendant 10 à 30 minutes. Pensez à couvrir la plaque afin d'éviter la décoloration du fluorophore. Ensuite, retirer la solution de fluo-4 et rincer les lamelles trois fois avec le tampon d'enregistrement hippocampique. Incuber les lamelles rincées à température ambiante pendant 30 minutes.Placez la lame couvre-objet dans la chambre, nettoyez l'autre face de la lame avec du liquide de nettoyage pour objectif et ajoutez 200 microlitres de tampon hippocampique. Déposez une petite goutte d'huile à immersion sur l'objectif et placez la chambre sur la platine du microscope. Observez les cellules en lumière transmise afin de les mettre au point et d'examiner leur aspect.Ensuite, illuminez les cellules avec une longueur d'onde de 488 nanomètres provenant d'une source monochrome et déterminez si le signal fluorescent du flu oh quatre est uniforme et détectable. Dans les astrocytes, utilisez l'illumination en épifluorescence et en turfs pour mesurer le calcium dans les astrocytes. Ici, les microbilles fluorescentes sont observées par illumination en épifluorescence.En plus de produire une fluorescence de fond, ils présentent également un mouvement brownien important selon l'angle d'illumination. Lorsque l'angle du laser s'approche de l'angle critique, le faisceau laser est entièrement réfléchi par l'interface verre-eau. Cette réflexion totale interne génère un champ électromagnétique appelé champ évanescent.Cela présente une profondeur dans la cellule d'indice de réfraction inférieur d'environ 100 nanomètres. Vous pouvez exciter les fluorophores dans cette fine couche située à la surface de l'échantillon. Voici des billes fluorescentes observées par éclairage en champ proche, comparées à l'épi-illumination.Le rapport signal sur bruit de l'illumination augmente considérablement lorsque vous réduisez l'angle. Le faisceau du laser ne se reflète pas à la surface et traverse la lame couvre-objet pour atteindre directement les billes fluorescentes. Vous pouvez observer une forte fluorescence de fond.Nous augmentons maintenant l'angle. Encore une fois, le bruit de fond diminue considérablement et vous pouvez voir des billes fluorescentes près de la surface de la lame. Ces images montrent des astrocytes et des neurones chargés en flu oh quatre.Les astrocytes sont des cellules plates dotées de prolongements fins, tandis que les neurones possèdent un corps cellulaire rond et des dendrites épaisses et longues. Les astrocytes et les neurones semblent tous deux en bonne santé et chargés de flu. Oh quatre correctement.L'examen des astrocytes par microscopie epi ou confocale permet de déterminer si les astrocytes sont sains et si les indicateurs calciques sont correctement chargés dans l'astrocyte. Dans les régions de l'astrocyte les plus proches du verre de couverture, appelées empreinte, on observe qu'un TP provoque une augmentation du calcium près de la membrane plasmique. On sait que les astrocytes de l'hippocampe expriment des récepteurs purement anergiques, et qu'un TP appliqué dans le bain peut induire une libération globale de calcium.Nous venons de vous montrer comment préparer une culture d'ostéocytes hippocampiques et comment mesurer le taux de calcium dans un ostéocyte, de manière globale et au niveau de la membrane plasmique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'optimiser l'angle du laser ; la meilleure façon de s'en assurer au microscope consiste à observer le comportement à des vitesses d'écoulement de 100 millimètres par seconde. L'enregistrement simultané du calcium global et du calcium proche de la membrane nous fournira non seulement une description détaillée du signal calcique, mais aussi de nouvelles perspectives sur le mécanisme de régulation du calcium dans l'astrocyte.Il nous est également apparu que l'approche décrite ici est utile pour mesurer les niveaux de calcium intracellulaire près de la membrane et au niveau global dans d'autres domaines excitable inconnus. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

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Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Le protocole AWESAM décrit ici est optimal pour la culture des astrocytes murines isolément des autres cellules du cerveau une manière rapide, simple et peu coûteux. AWESAM astrocytes présentent spontanée Ca2 + signalisation, la morphologie et génétique des profils d’expression semblables aux astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d'analyse d'image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Ce protocole fournit une description complète d’une méthode permettant l’enregistrement simultané des signaux calciques provenant des neurones et des astrocytes à travers plusieurs régions cérébrales liées à la mémoire et démontre son application dans un paradigme d’apprentissage et de comportement mémoire.

Une méthode de photométrie à fibres bicolores pour enregistrer l’activité astrocyte-neurone dans plusieurs régions cérébrales lors de l’apprentissage et des comportements de mémoire

Découvrez la mesure de la dynamique calcique globale et proche membrane dans les astrocytes en culture utilisant la microscopie à fluorescence et en réflexion totale interne. Cette méthode permet d'étudier simultanément les signaux calciques dans les cellules gliales.

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