Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d'âge des plantules Arabidopsis thaliana
17 août 2009
Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.
Cette procédure commence par la mise en place de graines d'arabidopsis sur un milieu Agar MS au jour 14. Après la germination des graines, les plantules sont récoltées et tranchées. Le matériel végétal est ensuite digéré dans une solution enzymatique dégradant la paroi cellulaire.
Le mélange obtenu est filtré à travers un torchon en mousseline afin de séparer les protoplastes des autres matériaux végétaux. Les protoplastes recueillis sont ensuite purifiés par gradient de densité de saccharose en les superposant à la solution W cinq. Les protoplastes s'accumulent à l'interface entre l'enzyme et la solution W cinq.
Ils sont collectés et lavés avant l'expérimentation. Bonjour, je suis Jang Ja du laboratoire de Lina Wauk, Département des sciences des cultures et des sols de l'Université Cornell. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'isolement de photographies intactes à partir de TH de 14 jours d'âge d'aro Ana.
Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la localisation subcellulaire des protéines d'intérêt, pour l'isolement d'organites intacts et pour l'analyse fonctionnelle de gènes à l'aide d'une interférence par ARN double brin. Commençons donc. Nous démarrons la procédure en préparant des plaques MS 0,5 fois, supplémentées avec 1 % de saccharose et 0,7 % d'agar pour un litre de milieu.
Peser 2,15 grammes de poudre MS. Ajouter dans 800 millilitres d'eau dans un flacon stérilisable de 1,5 litre contenant une barre magnétique, et mélanger le milieu sur une plaque agitatrice pour dissoudre la poudre tout en agitant. Ajouter goutte à goutte une solution normale de potasse pour ajuster le pH à 5,7.
Poursuivez le mélange et ajoutez 10 grammes de saccharose. Ensuite, ajoutez sept grammes d'agar, qui ne se dissout pas, mais se solubilisera ultérieurement lors de l'autoclavage. Et enfin, ajustez le volume à 1000 millilitres.
Stériliser le milieu MS par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Garder le barreau aimanté dans la bouteille après l'autoclavage. Agiter le milieu sur une plaque chauffante pour le refroidir à environ 60 degrés Celsius.
L'agitation pendant le refroidissement empêche l'agar de précipiter au fond de la bouteille. Si l'on peut maintenir ses mains sur la bouteille pendant 10 secondes, le milieu est suffisamment refroidi et l'on peut verser les géloses. Se déplacer sous la hotte afin de verser le milieu dans des boîtes de Petri de 150 par 15 millimètres.
90 millilitres par plaque. Conserver les plaques à quatre degrés Celsius. Maintenant que les plaques ont poussé, les plantes sont prêtes.
Préparons les graines d'Arabidopsis. Commencez la culture des plantes en stérilisant les graines d'Arabidopsis pour les placer sur une boîte de Pétri. Mettez les graines dans un tube micro-centrifuge Eppendorf en une quantité équivalente à un volume de 50 microlitres.
Stérilisez d'abord à l'éthanol en ajoutant un millilitre d'éthanol à 70 % et en mélangeant. Incubez correctement avec l'éthanol pendant deux minutes, durant lesquelles les graines sédimenteront. Retirez autant d'éthanol que possible à l'aide d'une pipette, puis stérilisez avec de l'eau de Javel en ajoutant un millilitre d'une solution d'eau de Javel contenant du Tween et en mélangeant pendant 10 minutes, en vortexant toutes les deux à trois minutes.
Pour faciliter l'élimination de la solution d'eau de Javel, effectuez une courte centrifugation afin de regrouper les graines au fond du tube, puis aspirez autant de solution que possible. La dernière étape de stérilisation s'effectue sous hotte à flux laminaire. Ajoutez un millilitre d'eau stérile aux graines et mélangez soigneusement.
Faites rapidement tourner les graines et aspirez l'eau. Répétez ce lavage à l'eau encore quatre fois. Maintenant que les graines sont stérilisées, répartissez-les sur la plaque MS.
Après avoir réparti les graines, conserver les boîtes ensemencées pendant 24 heures à quatre degrés Celsius à l’obscurité pour la stratification. Après les 24 heures d’incubation, transférer les plantes dans un environnement de croissance et les faire croître pendant 14 jours. Sous un cycle de 8 heures de lumière et 16 heures d’obscurité, les semis âgés de 14 jours sont ensuite prêts à être récoltés.
À présent que les semis ont poussé pendant deux semaines, il est temps de préparer les protoplastes sous la hotte. Utilisez une lame de rasoir neuve pour découper deux grammes de semis dans 15 millilitres de solution TVL stérilisée par filtration, dans une boîte de Pétri. Ensuite, transférez les tissus hachés dans un bécher de 200 millilitres enveloppé dans du papier d’aluminium.
Ajoutez 20 millilitres de solution d'enzyme fraîchement préparée et stérilisée par filtration pour dégrader la paroi cellulaire végétale. Agitez délicatement le bécher pour mélanger, puis recouvrez-le d'une membrane biologique et de papier d'aluminium afin de maintenir le tissu à l'abri de la lumière. Incubez ensuite les tissus végétaux dans la solution enzymatique sous agitation pendant 16 heures à température ambiante.
À la fin de l'incubation avec la solution enzymatique, recueillir les protoplastes libérés dans un tube Falcon de 50 millilitres en filtrant le mélange à travers huit couches de gaze préalablement humidifiées avec la solution W5. Récupérer les protoplastes restants en rinçant doucement la gaze avec 10 millilitres de solution W5. Les protoplastes se trouvent désormais dans le tube Falcon. Recouvrir délicatement les protoplastes avec cinq millilitres de solution WW5.
Veillez à ne pas perturber le gradient de sucre formé par l'ajout de la solution W cinq. Ensuite, centrifugez les protoplastes pendant sept minutes à 100 G. Les protoplastes s'accumulent à l'interface entre la solution enzymatique et la solution W cinq. Récupérez 10 millilitres de liquide à l'interface.
Transférez les protoplastes collectés dans un nouveau tube Falcon de 50 millilitres et ajoutez 15 millilitres de solution W5. Ensuite, centrifugez pendant cinq minutes à 60 ×g. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et remettez en suspension les protoplastes dans 15 millilitres de solution W5.
Centrifuger à nouveau les protoplastes pendant cinq minutes à 60 g. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et le résidu. Suspendre les protoplastes en culot dans un à deux millilitres de solution W5.
Enfin, évaluer le rendement de protoplastes par comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre au microscope. La procédure de culture décrite ici permet d’obtenir des plantules saines d’Arabidopsis, adaptées à l’isolement de protoplastes après digestion et séparation sur un gradient de densité. La récolte d’un gramme de plantules fraîches donne typiquement entre cinq et dix fois dix puissance six protoplastes intacts.
Nous vous avons montré comment isoler des protoplastes à partir du plafond d'une aose âgée de 14 jours. Lors de la réalisation de cette procédure, il est très important de se souvenir que le succès dépend de plantes saines. Par conséquent, il est essentiel de maintenir un rapport tige à plaque élevé et de respecter les spécifications indiquées dans ce protocole pour les moulins à filet, ms.
Milieu par plaque. Enfin, n'oubliez pas que les portes plus sont très fragiles. Une fois la cellule retirée, manipulez le bus avec précaution en mélangeant par retournement plutôt qu'en vortexant, et en préparant les mouvements vers le haut et vers le bas.
C'est tout. Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.
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Aperçu
Cette vidéo démontre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts à partir de semis d'Arabidopsis âgés de 14 jours. Les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96 heures, ce qui rend cette méthode efficace pour les tests nécessitant des protoplastes viables.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie végétale
- Biologie cellulaire
- Physiologie végétale
Contexte
- Les protoplastes sont des cellules végétales dépourvues de paroi cellulaire.
- L'isolement des protoplastes est essentiel pour divers dosages cellulaires.
- Les méthodes traditionnelles utilisent souvent des plantes adultes, qui peuvent ne pas produire de protoplastes intacts.
- Cette étude se concentre sur une méthode utilisant des jeunes plantules afin d'obtenir de meilleurs résultats.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour isoler des protoplastes intacts.
- Améliorer la viabilité des protoplastes pour les essais expérimentaux.
- Utiliser des jeunes plants pour une meilleure intégrité des protoplastes.
Méthodes utilisées
- Les graines sont déposées sur un milieu gélosé MS et laissées germer pendant 14 jours.
- Les plantules sont récoltées et tranchées en tranches pour préparer la digestion.
- Une solution enzymatique est utilisée pour digérer les parois cellulaires.
- Le mélange est filtré à travers un torchon en mousseline afin d'isoler les protoplastes.
- Les protoplastes sont purifiés à l'aide d'un gradient de densité de saccharose.
Résultats principaux
- Des protoplastes intacts peuvent être isolés à partir de semis âgés de 14 jours.
- Les protoplastes restent viables pendant au moins 96 heures après leur isolement.
- La méthode montre une efficacité améliorée par rapport aux techniques traditionnelles.
Conclusions
- Cette procédure permet d'obtenir de manière fiable des protoplastes intacts.
- L'utilisation de jeunes semis améliore l'intégrité des protoplastes lors des essais.
- La méthode peut être appliquée à divers montages expérimentaux en biologie végétale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de protoplastes intacts à partir de jeunes plants d'Arabidopsis permet une préparation rapide et évolutive de systèmes cellulaires végétaux destinés à la validation de cibles et au criblage phénotypique. Cette approche réduit les contraintes temporelles et les besoins en ressources par rapport aux protocoles utilisant des plantes matures, accélérant ainsi les étapes précoces des flux de découverte. La méthode facilite la détection mécanistique des risques en fournissant des cellules viables dépourvues de paroi, utiles à la localisation subcellulaire, à l'isolement d'organites et à l'analyse fonctionnelle basée sur l'ARNi.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la localisation subcellulaire des protéines et de l'intégrité des organites dans un contexte natif dépourvu de paroi.
- Valeur opérationnelle : Produit 5–10×10⁶ protoplastes intacts par gramme de plantules âgées de 14 jours, une quantité comparable à celle obtenue à partir de feuilles mais avec un cycle de croissance réduit de 50 %.
- Valeur stratégique : Facilite la confirmation rapide des cibles et l'élucidation des voies métaboliques à l'aide de tests d'ARNi ou de suivi des protéines.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Fournit un système reproductible et quantitatif pour évaluer les effets de composés sur les processus cellulaires dans des protoplastes intacts.
- Valeur opérationnelle : La purification par gradient de densité de saccharose assure une population de protoplastes de haute pureté, réduisant ainsi la variabilité des tests.
- Valeur stratégique : Permet une préparation standardisée et évolutive pour le criblage à haut contenu de molécules bioactives ou de perturbations génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation liée aux maladies chez Arabidopsis en autorisant l'inactivation ciblée de gènes et le suivi des protéines dans des cellules physiologiquement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Les protoplastes restent intacts et viables pendant ≥96 heures, permettant des essais cinétiques et une validation fonctionnelle ultérieure.
- Valeur stratégique : Fait le lien entre les phases de découverte et préclinique en offrant un système végétal scalable et facilement manipulable sur le plan génétique pour des études de mécanisme d'action.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la validation de cibles par la localisation subcellulaire et l'analyse fonctionnelle des gènes, et en permettant le développement d'essais évolutifs pour l'identification de composés d'intérêt dans des systèmes à base de plantes.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses par l'inhibition génique médiée par ARNi et le suivi protéique dans des protoplastes intacts.
- Criblage : Fournit des préparations normalisées et quantifiables de protoplastes adaptées au criblage de bibliothèques de composés ou de gènes.
- Analytique : Permet de mesurer la localisation, l'intégrité des organites et l'efficacité du silençage génique comme paramètres quantitatifs.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la fonction des gènes et les résultats phénotypiques dans un modèle végétal, contribuant ainsi à la priorisation des cibles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour des tests basés sur des protoplastes, applicable à plusieurs projets et catégories de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la fonction de la cible grâce à l'observation directe de la localisation protéique et de l'intégrité des organites.
- Valeur opérationnelle : La digestion enzymatique standardisée et la purification par gradient de densité assurent une reproductibilité entre les lots.
- Valeur stratégique : Un temps de croissance réduit (15 jours contre 35 à 36 jours) diminue les coûts d'infrastructure et augmente le débit.
- Impact sur le portefeuille : Permet des décisions plus rapides d'aller/arrêt lors de la validation précoce des cibles en fournissant des données phénotypiques rapides et fiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des tissus végétaux, la digestion enzymatique et la séparation par gradient de densité.
- Dépend d'une technique stérile, d'une activité enzymatique adéquate et d'une stabilité du gradient pour assurer la viabilité des protoplastes.
- Exige un accès à un hémocytomètre, à une centrifugeuse et à une hotte à flux laminaire pour l'isolement et la quantification.
- L'adaptation à d'autres espèces végétales peut nécessiter une optimisation de la concentration enzymatique et du temps d'incubation.
- La fragilité des protoplastes exige une manipulation délicate (par exemple, le pipetage plutôt que le vortexage) afin de préserver leur intégrité.
